基于網(wǎng)絡藥理學的重樓鎮(zhèn)驚湯調(diào)治抽動障礙的作用機制研究

陳 玉，鄧安妮，薛貝貝

（1.成都中醫(yī)藥大學，四川 成都 610075；2.成都中醫(yī)藥大學第三附屬醫(yī)院，四川 成都 610000）

抽動障礙是兒童時期一種常見的神經(jīng)精神障礙性疾病，與遺傳、中樞神經(jīng)遞質、感染及免疫等因素有關，臨床以不自主、突發(fā)、反復、快速、無節(jié)律性的一個或多個部位運動抽動和（或）發(fā)聲抽動為主要特征，嚴重影響兒童的身心健康及日常生活[1-3]。重樓鎮(zhèn)驚湯為李建保教授所創(chuàng)立的治療抽動障礙的經(jīng)驗方，臨床療效顯著，由重樓、柴胡、黃芩、白芍、桑葉、菊花、鉤藤、全蝎、天麻、蜈蚣、薄荷、甘草組成。網(wǎng)絡藥理學結合了多學科的技術，能夠對藥物治療疾病進行多層次網(wǎng)絡分析，從微觀分子的角度去探索其治療機制，提供了一條新的途徑以研究藥物作用機制[4]。本文基于網(wǎng)絡藥理學方法分析重樓鎮(zhèn)驚湯調(diào)治抽動障礙的藥理作用機制。

1 材料與方法

1.1 潛在作用靶點篩選

在TCMSP 數(shù)據(jù)庫中尋找重樓鎮(zhèn)驚湯化學成分并根據(jù)OB ≥30% 且DL ≥0.18 進行篩選，獲得相關靶點蛋白，后在Uniprot 數(shù)據(jù)庫中將蛋白名轉換為基因名。以抽動障礙為關鍵詞在GeneCards、TTD、OMIM、DRUGBANK 數(shù)據(jù)庫中查找其靶點，將藥物和疾病靶點導入Venny2.1 軟件中取交集并繪圖，即重樓鎮(zhèn)驚湯治療抽動障礙的潛在靶點。

1.2 構建PPI 網(wǎng)絡和“成分-靶點”網(wǎng)絡

將交集靶點在STRING 數(shù)據(jù)庫中構建PPI 網(wǎng)絡，其文件導入CytoScape3.8.0，利用內(nèi)置工具分析拓撲值，包括連接度、介度及緊密度，構建重樓鎮(zhèn)驚湯“成分-靶點”網(wǎng)絡，并篩選核心成分及靶點。

1.3 富集分析及構建

將交集靶點錄入Metascap 平臺并設置P＜0.01，進行GO 及KEGG 富集分析。

2 結果

2.1 重樓鎮(zhèn)驚湯治療抽動障礙的潛在靶點

因TCMSP 數(shù)據(jù)庫中未查到重樓、全蝎、天麻、蜈蚣4 味藥活性成分，故經(jīng)查閱已發(fā)表文獻、化源網(wǎng)、化學成分數(shù)據(jù)庫、ETCM、BATMAN-TCM 獲得其成分及CAS 號，經(jīng)swissadme 篩選得到有效成分及TCMSP 平臺預測靶點，共獲得重樓鎮(zhèn)驚湯活性成分336 種，靶點520 個。分別在Genecard 等4 個數(shù)據(jù)庫中查找、合并并刪除重復值后得到2395 個抽動障礙相關靶點。將二者靶點取交集，并繪制韋恩圖（見圖1），得到165 個交集靶點，即重樓鎮(zhèn)驚湯治療抽動障礙的潛在靶點。

圖1 重樓鎮(zhèn)驚湯治療抽動障礙的潛在靶點

2.2 PPI 網(wǎng)絡構建和“成分-靶點”網(wǎng)絡

將交集靶點導入STRING 數(shù)據(jù)庫中得到重樓鎮(zhèn)驚湯靶點PPI 網(wǎng)絡（見圖2），其TSV.文件導入CytoScape3.8.0，利用CytoScape3.8.0 內(nèi)置工具分析各節(jié)點連接度、介度及緊密度等拓撲參數(shù)，并繪制“成分- 靶點”網(wǎng)絡（見圖3）。根據(jù)網(wǎng)絡可視化分析得到重樓鎮(zhèn)驚湯治療抽動障礙的核心成分（見表1）及核心靶點（見表2）。其中AKT1 的連接度、介度及分別為89、0.0549、0.6599，預測是重樓鎮(zhèn)驚湯發(fā)揮治療作用的關鍵靶點。

表1 重樓鎮(zhèn)驚湯主要活性成分網(wǎng)絡節(jié)點特征參數(shù)

表2 關鍵靶點網(wǎng)絡節(jié)點特征參數(shù)

圖2 PPI 網(wǎng)絡圖

圖3 重樓鎮(zhèn)驚湯“成分-靶點”網(wǎng)絡

2.3 KEGG 富集分析

在Metascape 平臺對重樓鎮(zhèn)驚湯調(diào)治抽動障礙的相關靶點進行富集分析，結果見圖4。由圖4 可知重樓鎮(zhèn)驚湯主要參與的通路有PI3K-Akt 信號通路、MAPK 信號通路以及多巴胺能突觸通路等。

圖4 KEGG 富集分析氣泡圖

3 討論

多巴胺合成與代謝障礙是抽動障礙的病理機制，且炎性因子與其相關。槲皮素能夠減輕多巴胺神經(jīng)損傷[5]并抑制白細胞介素（IL）-1β、IL-6、IL-8 和腫瘤壞死因子-α（TNF-α）[6-8]。山柰酚能降低IL-1β、IL-6、IL-8 和TNF-α 水平[9-10]。β- 谷甾醇可降 低IL-1β、IL-6、TNF-α 和ERK1/2 的 表 達[11]。柚皮素能夠減輕腦缺血大鼠神經(jīng)元的變性死亡，降低IL-1β 和IL-6 的表達[12]，且對脂多糖誘導的多巴胺神經(jīng)元損傷有保護作用[13]。木犀草素和蘆丁組合物可減輕神經(jīng)元受損程度，抑制促炎因子的釋放，延緩多巴胺能神經(jīng)元進行性退變[14]。故上述重樓鎮(zhèn)驚湯的核心成分可能通過調(diào)節(jié)多巴胺合成與代謝以及抗炎發(fā)揮抗抽動作用。本文預測出重樓鎮(zhèn)驚湯治療抽動障礙的核心靶點，其中IL-1β、IL-6、CXCL8、TNF 均為炎性細胞因子。研究發(fā)現(xiàn)，抽動障礙患兒血清及動物模型腦組織中IL-6、TNF-α 等炎性細胞因子水平升高[15-16]，IL-1β、IL-8 與心理社會壓力相關[17]，而心理精神因素是抽動障礙的危險因素。AKT1 參與調(diào)節(jié)人腦紋狀體多巴胺信號傳導且位于P13K-Akt 信號通路上，能調(diào)節(jié)細胞凋亡，可能是調(diào)治抽動障礙的重要靶點。抽動障礙與神經(jīng)發(fā)育起源、多巴胺能神經(jīng)元的改變等有關，神經(jīng)生長因子（NGF）對維持周圍和中樞神經(jīng)系統(tǒng)神經(jīng)元存活、分化和生物學功能具有重要作用，可能在抽動障礙的發(fā)生中起關鍵作用[18]。PI3K/Akt 通路能夠調(diào)節(jié)細胞增殖、代謝、分化，抗細胞凋亡[19-21]。動物實驗證明，PI3K 抑制劑LY294002能夠減輕多發(fā)性抽動癥（TS）大鼠的癥狀，降低TS大 鼠IL-1β、IL-6 和TNF-α 的 水 平[22]。多 巴 胺D2受體在多巴胺能神經(jīng)元的發(fā)育過程中起著重要作用，有實驗表明其與ERK/MAPK 激活有關[23]。通過MAPK 通路能夠調(diào)節(jié)細胞凋亡和多巴胺能神經(jīng)元發(fā)育，從而影響抽動。大腦基底神經(jīng)節(jié)及邊緣系統(tǒng)皮質多巴胺系統(tǒng)功能紊亂，可能是抽動障礙的主要發(fā)病機制[24]。多巴胺突觸通路上有包括DRD2在內(nèi)的多個多巴胺受體，通過調(diào)節(jié)這些靶點能夠較好地控制抽動障礙[25]。綜上，重樓鎮(zhèn)驚湯可能是通過抗炎、調(diào)節(jié)神經(jīng)遞質和細胞凋亡從而治療抽動障礙。

本研究通過網(wǎng)絡藥理學方法，分析了重樓鎮(zhèn)驚湯治療抽動障礙的主要活性成分、核心靶點及信號通路，為臨床運用重樓鎮(zhèn)驚湯治療抽動障礙提供了分子學依據(jù)。但本研究未考慮中藥劑量、劑型、煎煮后的化學成分變化及在體內(nèi)的代謝物，故后續(xù)仍需在此基礎上進行動物或細胞實驗來進一步驗證。