銀杏葉提取物金納多對敵草快誘導大鼠急性腎損傷的改善作用

陳劍靖，徐美麗，何子夜，李超乾

廣西醫科大學第一附屬醫院急診科，南寧 530021

隨著百草枯逐漸退出農藥市場的應用，敵草快（DQ）中毒患者日益增多。DQ 主要蓄積在患者肝臟及腎臟中。腎臟是DQ 吸收后向人體外排泄的主要器官［1］，因此DQ 中毒極易導致AKI［2］。與傳統的腎損傷指標（血肌酐、尿素氮）相比，腎損傷分子-1（KIM-1）、視黃醇結合蛋白4（RBP4）是AKI 常用的檢測指標［3］。目前DQ 中毒導致腎損傷的機制尚未完全闡明，有研究［2］表明，DQ 中毒腎損傷機制與核轉錄因子-κB（NF-κB）信號通路激活，促進炎癥因子釋放，加重腎損傷有關。NF-κB 是調節機體炎癥反應的重要轉錄因子，MORAES-VIEIRA 等［4］發現RBP4 誘導的炎癥反應與NF-κB 的激活有關。因此我們推測，RBP4 和NF-κB 可能參與調節DQ 中毒所致的炎癥反應。腎臟損傷是DQ 中毒致死的主要原因［5］。如何緩解DQ 中毒所致的急性腎損傷，已成為目前臨床治療的一大難點。銀杏葉提取物金納多（EGB761）具抗凋亡、抗氧化、抗炎等多種功能，目前已廣泛用于腦血管疾病的治療中［6］。SENER等［7］研究表明，EGB761 能改善大鼠缺血再灌注腎損傷。我們前期研究［8］發現，EGB761 可減輕百草枯中毒小鼠的肺損傷。那么，EGB761 對DQ 中毒所致的腎損傷是否具有改善作用，目前尚未有研究報道。為此，我們觀察了EGB761 對DQ 誘導的大鼠AKI 是否具有改善作用，并初步探討其可能作用機制，旨在為臨床DQ 中毒AKI 患者的治療提供新思路。

1 材料與方法

1.1 動物、試劑及儀器 SPF級成年健康雄性Wistar大鼠30只，體質量180～200 g，購自長沙天勤生物技術有限公司［SCXK（湘）2019-0014］。本次實驗使用廣西醫科大學實驗動物中心屏障動物實驗設施，大鼠在SPF級環境飼養，經廣西醫科大學動物實驗倫理委員會批準202104008。DQ晶體純品（98.5 %，上海市農藥研究所有限公司）；總RNA 提取試劑盒（天根生化科技有限公司，北京）、逆轉錄試劑盒及qRTPCR試劑（TaKaRa公司）。引物由南寧捷尼斯生物科技有限公司合成。RBP4 抗體（英國Abcam 公司）；KIM-1抗體（美國Novus公司）；NF-κB p65抗體（Affinity）；內參β-Actin 抗體（武漢 賽維爾公司）；酶標儀（美國Thermo公司）。病理圖像分析系統（德國Leica公司）；正置熒光顯微鏡（日本Olympus公司）。

1.2 大鼠分組及EGB761、DQ 給予方法 將30 只SPF級健康雄性Wistar大鼠分隨機為敵草快 + 銀杏葉提取物治療組（DQ + EGB761組）、DQ中毒組（DQ組）及對照組（NS組），每組各10只。將DQ標準品（純度98.5 %）配制成25 mg/mL DQ 溶液，DQ 組和DQ +EGB761組予154 mg/kg DQ溶液灌胃（設為第1天），NS組予等劑量生理鹽水灌胃。DQ灌胃后半小時DQ+ EGB761組予10 mL/kg EGB761腹腔注射（1次/天，時間間隔24 h，連續3次），DQ組與NS組腹腔注射等劑量的生理鹽水（1次/天，時間間隔24 h，連續3次）。NS組大鼠精神、活動、飲食、大小便正常，毛發水亮；DQ 灌胃后DQ 組染毒后逐漸出現精神萎靡、毛發豎起、易激惹、進食減少、拉稀便等中毒癥狀。DQ +EGB761組與DQ組相比，以上中毒癥狀均減輕。第4天時用二氧化碳窒息法麻醉各組大鼠，將其仰臥位置于解剖臺上并固定好四肢，剔除胸腹部皮毛，消毒，用手術刀沿腹白線切開，從劍突到下腹部，充分暴露下腹部，取一半腎臟組織用生理鹽水清洗兩次，用4 %多聚甲醛溶液浸泡固定24 h，一部分腎臟組織切片后用于HE染色觀察各組大鼠腎組織病理變化。一部分腎臟組織-80 ℃冰箱保存以備后續研究。

1.3 各組大鼠AKI程度觀察

1.3.1 各組大鼠腎組織病理變化觀察 取各組大鼠腎組織，HE 染色后鏡下觀察腎組織病理變化，對各組大鼠腎組織進行病理評分，評分標準為：正常腎小管計0分；輕度腎小管損傷，影響視野＜25 計1分；中度腎小管損傷，影響視野25 %～50 %計2分；重度腎小管損傷，影響視野＞50 %計3分。

1.3.2 各組大鼠腎組織腎損傷指標KIM-1mRNA及蛋白檢測 取各組大鼠腎組織，分別采用PCR和WESTERN Blotting 法檢測各組大鼠腎組織KIM-1mRNA 及蛋白。PCR：使用離心柱法提取各組腎組織中KIM-1 總RNA，采用逆轉錄試劑盒將RNA反轉錄為cDNA，進行 Real time PCR 擴增檢測大鼠腎組織中的KIM-1 mRNA 的相對表達量。KIM-1 上游引物：5’-CATTTCCACTCCACTTCTGTCTTG-3’；KIM-1 下游引物：5’-CTCCTTTCTTTCCTCTTTCGTTTCT-3’。β-Actin 上游引物：5’-AGATCAAGATCATTGCTCCTCCTG-3’；β -Actin 下游引物：5’-CAGCTCAGTAACAGTCCGCC-3’。以β-Actin 作為內參，以2-ΔΔCt代表目的mRNA的相對表達量。重復測算3 次，取平均值。WESTERN Blotting 法：取大鼠腎組織，BCA法檢測蛋白濃度，用Odyssey system 掃膜。應用Image J 軟件分析蛋白條帶灰度值，以目的蛋白條帶灰度值與內參β-Actin蛋白條帶灰度值的比值作為目的蛋白表達量。重復測算3次，取平均值。

1.4 各組大鼠腎組織RBP4、NF-κB mRNA 和蛋白及其下游因子TNF-α、IL-1β 的mRNA 檢測 取各組大鼠腎組織，采用PCR 法檢測RBP4、NF-κB、TNF-α和IL-1β 的mRNA，WESTERN Blotting 法檢測RBP4和NF-κB 蛋白。 PCR 實驗具體操作步驟同“1.3.2”。RBP4 上游引物：5’-GTGAGGCAGCGACAGGAGGA-3’；RBP4 下游引物：5’-GGGGAGGTGGGGAAACTAAACT-3’；NF-κ B 上游引物：5’-GAAGTTAGGTCTGGGGATATTGA-3’；NF-κB 下游引物：5’-ATGTGCTGTCTTGTGGAGGAG-3’；TNF- α 上游引物：5’-CTGGCGTGTTCATCCGT TCT-3’；TNF-α 下游引物：5’-TCAGCGTCTCGTGTGTTTCTG-3’；IL-1β 上游引物：5’-CTATGTCTTGCCCGTGGAGC-3’；IL-1β 下游引物：5’-AGGTCGTCATCATCCCACGA-3’。WESTERN Blotting實驗具體操作步驟同“1.3.2”。按照抗體說明書用一抗稀釋液稀釋一抗，RBP4、NF-κ B 的稀釋比例分別為1∶2 000、1∶1 000。實驗均重復測算3次，取平均值。

1.5 統計學方法 采用SPSS 23.0 統計軟件進行數據處理。使用GraphPad Prim 8.0.2 軟件繪圖，計量資料通過Shapiro-Wilk 進行正態性檢驗，符合正態分布的數據以±s表示，組間比較采用單因素方差分析。P＜0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 各組大鼠腎組織損傷情況

2.1.1 各組大鼠腎組織病理變化及病理評分 光鏡下NS 組大鼠腎組織結構清晰，腎小管結構正常，未見水腫及充血；DQ 組大鼠腎小管上皮細胞腫脹，管腔變窄，部分腎小管上皮細胞空泡變性、壞死，大量炎細胞浸潤。DQ + EGB761組與DQ組相比，腎小管上皮細胞腫脹程度及炎細胞浸潤程度明顯減輕。DQ + EGB761 組、DQ 組及NS 組腎組織病理評分分別為（1.5 ± 0.52）、（2.25 ± 0.75）、0 分。與NS 組比較，DQ 組大鼠腎組織損傷情況明顯加重（P＜0.05）；與DQ組比較，DQ + EGB761組大鼠腎組織腎損傷情況明顯減輕（P＜0.05）。

2.1.2 各組大鼠腎組織KIM-1mRNA 及蛋白相對表達量比較 DQ + EGB761組、DQ組、NS組大鼠 腎組織KIM-1mRNA 相對表達量分別為2.10 ± 1.14、5.01 ± 1.33、1.00 ± 0.07，KIM-1蛋白相對表達量分別為0.29 ± 0.14、0.59 ± 0.03、0.17 ± 0.1。與NS組比較，DQ 組大鼠腎組織KIM-1 mRNA 和蛋白相對表達量高（P＜0.05）；與DQ組比較，DQ + EGB761組大鼠腎組織KIM-1 mRNA和蛋白相對表達量低（P＜0.05）。

2.2 各組大鼠腎組織RBP4、NF-κB 、TNF-α、IL-1β的 mRNA及蛋白相對表達量比較

2.2.1 各組大鼠腎組織RBP4 mRNA、NF-κB mRNA、TNF-α mRNA、IL-1β mRNA 相對表達量比較 各組大鼠大鼠腎組織RBP4 mRNA、NF-κB mRNA、TNF-α mRNA、IL-1β mRNA 相對表達量見表1。與NS 組比較，DQ 組大鼠腎組織RBP4 mRNA、NF-κB mRNA、TNF-α mRNA、IL-1β mRNA 相對表達量高（P均＜0.05）；與DQ 組比較，DQ + EGB761 組大鼠腎組織RBP4 mRNA、NF- κB mRNA、TNF- α mRNA、IL-1β mRNA相對表達量低（P均＜0.05）。

表1 各組大鼠腎組織RBP4 mRNA、NF-κB mRNA、TNF-α mRNA、IL-1β mRNA相對表達量（± s）

表1 各組大鼠腎組織RBP4 mRNA、NF-κB mRNA、TNF-α mRNA、IL-1β mRNA相對表達量（± s）

組別DQ + EGB761組DQ組NS組RBP4 mRNA 1.40 ± 0.09 2.47 ± 0.61 1.02 ± 0.09 NF-κB mRNA 1.43 ± 0.47 2.23 ± 0.13 1.02 ± 0.05 TNF-α mRNA 1.54 ± 0.12 2.40 ± 0.21 1.00 ± 0.04 IL-1β mRNA 1.26 ± 0.10 1.99 ± 0.14 1.00 ± 0.05

2.2.2 各組大鼠腎組織RBP4、NF-κB 蛋白相對表達量比較 各組大鼠腎組織RBP4、NF-κB 蛋白相對表達量見表2。與NS 組比較，DQ 組大鼠腎組織RBP4、NF-κB 蛋白相對表達量高（P均＜0.05），與DQ 組比較，DQ + EGB761 組大鼠腎組織RBP4、NF-κB蛋白相對表達量低（P均＜0.05）。

表2 各組大鼠腎組織RBP4、NF-κB蛋白相對表達量（± s）

表2 各組大鼠腎組織RBP4、NF-κB蛋白相對表達量（± s）

組別DQ + EGB761組DQ組NS組RBP4 1.22 ± 0.17 1.6 ± 0.19 0.42 ± 0.09 NF-κB 0.54 ± 0.10 0.75 ± 0.05 0.44 ± 0.11

3 討論

DQ中毒目前尚未有特效解毒劑，其發病率和死亡率都很高。腎臟損傷是DQ 中毒致死的主要原因。如何緩解DQ 中毒所致的腎損傷，成為臨床治療的一大難點，尋找可以緩解DQ 中毒AKI 的藥物十分有必要。

DQ 中毒可導致多個器官損害，其中腎臟是DQ中毒損害的主要靶器官［1］。賈俊娥等［9］實驗發現DQ染毒24 h 后，組織中DQ 濃度順序為：腎臟＞脾臟＞肝臟＞心臟＞腸＞肺臟。有研究［2］表明，DQ 中毒患者發生AKI 的可能性高達81%，AKI 主要表現為腎小管損傷。本研究也發現，DQ 中毒組大鼠出現了少尿、無尿甚至血尿等腎損傷表現，腎組織HE 染色光鏡下觀察發現DQ 中毒組大鼠腎小管上皮細胞出現明顯水腫，管腔變窄，部分腎小管上皮細胞出現空泡變性、壞死等情況，且有大量炎細胞浸潤。KIM-1 在正常腎組織中幾乎不表達，但當腎組織發生毒性損害時，腎近曲小管上皮細胞會釋放大量的KIM-1，KIM-1的表達量顯著增高［10］。有研究［3］表明，KIM-1可作為腎損傷24 h 的一個早期AKI 生物學標志物。超過99%的RBP4會被近端腎小管重新吸收，RBP4可作為腎小管損傷的早期敏感指標。本研究也發現，與NS組相比，DQ中毒組大鼠KIM-1和RBP4的表達水平均顯著升高。本研究結果表明，DQ中毒可導致明顯的腎損傷，且主要以腎小管損傷為主，經EGB761 干預后，DQ + EGB761組腎小管上皮細胞水腫程度及炎癥浸潤較DQ 組相比均明顯減輕。經EGB761 干預后，DQ + EGB761組KIM-1和RBP4的表達水平較DQ組相比顯著降低。表明EGB761可以減輕DQ中毒所誘導的大鼠急性腎損傷。

DQ中毒導致腎損傷的機制尚未完全闡明，可能與氧化應激、炎癥反應，細胞凋亡等有關［11］。DQ 進入細胞后，在細胞色素P450 還原酶的催化下，將DQ2+還原成DQ+自由基。DQ+很不穩定，在氧氣存在的條件下形成超氧陰離子自由基（·O2-），而DQ+失去電子后轉變成DQ2+。DQ2+在還原酶細胞色素P450 和輔酶NADPH 的雙重作用下，繼續進行氧化還原反應，再次還原成DQ+自由基，DQ+不斷地與氧結合，產生超氧陰離子自由基（·O2-），循環往復周而復始形成持續的氧化還原循環［12］。這種持續的氧化還原循環，會導致大量活性氧（Reactive oxygen species， ROS）的產生，ROS 與所有細胞大分子，尤其是多不飽和脂肪酸相互作用，這是膜結構的主要組成部分，能輕易通過脂質過氧化作用被ROS 附著，造成細胞死亡［13］，進一步激活NF-κB 等炎癥信號通路，造成細胞損傷等［14］。岑祥瑩等［2］研究發現DQ中毒腎損傷機制與白介素-17 含量增加和NF-κB信號通路激活有關，通過抑制白介素-17 的表達，可抑制NF-κB 信號通路激活，從而減輕DQ 中毒腎損傷。

NF-κB 是一種轉錄因子，可參與調節機體的免疫反應、炎癥和凋亡等［5］，也是DQ 中毒氧化應激反應的重要轉錄因子。有研究［15］表明，正常大鼠的腎組織中NF-κB 表達較低，而急性DQ 中毒大鼠腎組織中NF-κB 表達較高。有研究［6］發現RBP4 誘導的炎癥反應，主要由Toll 樣受體2/4（TLR2/4）的激活和巨噬細胞的促炎細胞因子分泌介導，激活NF-κB 信號通路，并引起其下游因子TNF-α 和IL-1β的表達升高。本研究結果發現與NS 組相比，DQ 組大鼠RBP4 和NF-κB 的mRNA 和蛋白表達水平均明顯升高。與NS組相比，DQ組大鼠TNF-α和IL-1β的mRNA 表達水平均顯著增高。結果表明，DQ 中毒后可能通過激活NF-κB/RBP4 信號通路，促進其下游炎癥因子TNF-α和IL-1β的表達。

LI 等［16］研究表明，EGB761 能通過抑制促炎細胞因子和JAK-STAT 信號傳導，減輕腦死亡引起的腎損傷。FANG 等［17］發現EGB 治療可以有效緩解缺血性結腸炎癥狀，加快粘膜愈合?？赡芡ㄟ^清除氧化自由基和下調炎癥介質（TNF-α 和IL-6 等），改善缺血性結腸炎。本研究中：經EGB761 干預后，DQ +EGB761 組大鼠RBP4 和NF-κB 的mRNA 和蛋白表達水平均明顯低于DQ 組，DQ + EGB761 組大鼠TNF-α 和IL-1β 的mRNA 表達水平均明顯低于DQ組。表明EGB761 能顯著降低RBP4、NF-κB、TNF-α和IL-1β 的表達水平，其可能通過抑制NF-κB/RBP4信號通路，從而抑制其下游因子TNF-α 和IL-1β 的表達，減輕DQ中毒后導致的炎癥反應。

綜上所述，EGB761可以有效改善DQ中毒AKI，其可能通過抑制NF-κB/RBP4 信號通路，發揮腎臟保護作用。本研究還存在不足之處，在本研究中我們只驗證了RBP4、NF-κB 及其下游因子的改變，尚未用相關激動劑和抑制劑對NF-κB/RBP4信號通路進行雙重驗證，有待后續實驗深入研究。