奇異南星揮發油通過miR-762/NF2軸對甲狀腺癌細胞惡性生物學行為的影響

張慧 閆旺 孫明華

甲狀腺癌是最常見的內分泌系統惡性腫瘤,占每年診斷出的癌癥的3.4%[1],大多數患者可通過甲狀腺癌根治術和頸部淋巴結清掃術治愈,但是,在手術后仍有15%～30%患者出現復發及頸部淋巴結轉移[2],患有頑固性或轉移性甲狀腺癌患者預后較差[3],因此探索甲狀腺癌發病及進展機制對于患者綜合治療具有重要意義。微小RNA(microRNAs,miRNAs)是一類進化保守、長約22個核苷酸的非編碼小RNA,可介導細胞增殖、分化及腫瘤發生等多種生物學行為[4]。研究發現,miR-762在乳腺癌細胞系及臨床乳腺癌組織中高表達,可促進乳腺癌細胞增殖及侵襲,表明其可能參與癌癥發展[5]。2型神經纖維瘤(Neurofibromatosis type 2,NF2)基因是一種新型抑癌基因,可編碼Merlin蛋白,據報道NF2/Merlin可抑制乳頭狀甲狀腺癌轉移[6],miRNAs可通過靶向調控NF2基因表達參與多種生物學進程,但miR-762是否可靶向調控NF2基因表達參與甲狀腺癌發生發展進程,尚需研究證實。奇異南星揮發油(Arisaema decipiens volatile oil,ADVO)為天南星科天南星屬植物萃取物,對肺癌、肝癌和乳腺癌等細胞株具有生長抑制作用[7]。本研究擬通過體外培養人甲狀腺癌細胞株TPC-1,探究ADVO對TPC-1細胞惡性生物學行為的影響及可能的作用機制,以期為ADVO臨床應用于甲狀腺癌的治療提供實驗依據。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 細胞株 TPC-1(人甲狀腺癌細胞)購自武漢普諾賽生命科技有限公司。

1.1.2 主要試劑 奇異南星全株(經鑒定為天南星屬植物奇異南星)購自廣西容縣;AnnexinV-FITC/PI流式細胞凋亡檢測試劑盒購自南京凱基生物科技公司;Matrigel基質膠購自美國BD公司;Invitrogen Lipofectamine2000購自美國Invitrogen公司;miR-762 mimics、miR-762 mimics NC購自上海吉瑪生物技術有限公司;NF2/Merlin、兔抗yes相關蛋白1(Yes associated protein 1,YAP1)、裂解半胱氨酸蛋白酶-3(Cleaved cysteine protease-3,C-caspase-3)、E-鈣黏蛋白(E-cadherin)、波形蛋白(Vimentin)抗體及山羊抗兔IgG二抗購自美國Abcam公司;兔抗YAP1(phospho Ser127)多克隆抗體購自武漢艾美捷生物科技有限公司;RT-qPCR試劑盒購自北京天根生物技術有限公司。

1.2 方法

1.2.1 ADVO制備 參考文獻[7],采用同時蒸餾萃取技術,以二氯甲烷為溶劑從奇異南星根莖中提取出ADVO 0.326 g。利用RPMI 1640完全培養液(含10%胎牛血清)分別制成15、30、60、120 μg/mL條件培養液。

1.2.2 細胞培養 利用RPMI 1640完全培養液復蘇TPC-1細胞,于37℃、5% CO2及飽和濕度環境條件下的培養箱中培養,待細胞增殖至85%左右時進行傳代,傳2～3代后備用。

1.2.3 CCK-8法檢測不同濃度ADVO對細胞存活率的影響 取對數期TPC-1細胞,以1×105個/mL密度接種100 μL細胞懸液于96孔板,利用RPMI 1640完全培養液(ADVO 0 μg/mL)、15、30、60、120 μg/mL ADVO條件培養液培養,各濃度均設置5個復孔,48 h后直接于各孔加入10 μL CCK-8試劑,培養箱內靜置2 h,測定450 nm處各孔吸光度(OD)值,實驗重復3次。細胞存活率(%)=實驗組OD值/對照組OD值×100%(此處對照組為0 μg/mL ADVO培養的細胞)。

1.2.4 過表達miR-762對細胞存活率的影響 經ADVO濃度梯度篩選,60 μg/mL ADVO作用下可降低約50%的細胞存活率;接種1×105個細胞于6孔板內,利用脂質體轉染試劑Lipofectamine 2000將miR-762 mimics NC、miR-762 mimics分別轉染至匯合約50%的TPC-1細胞,轉染過夜并收集細胞。將TPC-1細胞分為空白組(含10%胎牛血清的完全培養液常規培養)、ADVO組(60 μg/mL)、miR-762 mimics組(轉染miR-762 mimics)、miR-762 mimics NC組(轉染miR-762 mimics NC)、ADVO+miR-762 mimics組(60 μg/mL ADVO+轉染miR-762 mimics)和ADVO+miR-762 mimics NC組(60 μg/mL ADVO+轉染miR-762 mimics NC),對應培養液培養48 h,CCK-8法檢測各組細胞存活率。以下實驗均按此分組進行。

1.2.5 Transwell實驗檢測各組細胞遷移及侵襲的影響情況 轉染后48 h收集細胞并重懸于不含胎牛血清的RPMI 1640培養液中,以每孔5×104個細胞密度接種于上室,下室加入200 μL完全培養基,48 h后棄去培養液,棉簽拭去小室表面細胞,膜下表面侵入細胞利用1%多聚甲醛固定,室溫下結晶紫染色,待Transwell 6孔板干燥后,400倍鏡下觀察并計數遷移細胞數量。細胞侵襲檢測方法同細胞遷移,除了Transwell上室提前涂布有Matrigel基質膠。

1.2.6 流式細胞術檢測各組細胞凋亡水平 各組細胞培養48 h后,收集細胞,PBS洗滌沉淀2次,將細胞以1×106個/mL重懸并加入Annexin V-FITC和PI雙重染色,室溫避光孵育15 min,然后將100 μL細胞懸液與400 μL結合緩沖液混合,流式細胞儀檢測細胞凋亡率,重復3次。

1.2.7 生物信息學預測和雙熒光素酶報告基因實驗 利用Targetscan網站預測NF2基因與miR-762的3′非翻譯區(3′untranslated region,3′UTR)之間的潛在結合位點。使用Lipofectamine2000將TPC-1細胞與miR-762 mimics、mimics NC分別與NF2基因野生型(Wild type,WT)或突變型(Mutant,MUT)熒光素酶報告載體共轉染,48 h后,裂解細胞,12 000 r/min,4℃離心10 min,收集上清,以海腎熒光素酶為內部對照,檢測熒光素酶活性。報告基因相對活性=螢火蟲熒光素酶活性/海腎熒光素酶活性。

1.2.8 RT-qPCR實驗檢測miR-762及NF2 mRNA相對表達水平 利用mirVanaTMmiRNA Isolation Kit分離和純化總RNA。制備RT-qPCR反應體系,反應條件為95℃ 10 min,95℃ 15 s,60℃ 30 s 40個循環、72℃ 60 s。以GAPDH和U6分別作為內參,2-ΔΔCt法計算目的基因的相對表達量。引物序列如下并送至華大基因合成(表1)。

表1 PCR引物

1.2.9 Western blot實驗檢測蛋白表達情況 各組細胞培養48 h后胰酶消化、收集并洗滌細胞,用預冷RIPA裂解液裂解,4℃ 12 000 r/min離心10 min,取上清。測定蛋白濃度后加熱變性,進行SDS-PAGE凝膠電泳,隨后濕轉蛋白至PVDF膜,洗膜3次,每次10 min,5%脫脂牛奶室溫封閉2 h,Merlin、YAP1、p-YAP1、C-caspase-3、E-cadherin、Vimentin一抗(均1∶1 000稀釋)于4℃孵育過夜,洗膜,IgG二抗(1∶8 000稀釋)室溫孵育2 h,洗膜,ECL發光液顯色,并用化學發光凝膠成像系統曝光并拍照記錄。Image J軟件分析條帶灰度值,以目的蛋白與內參GAPDH灰度值比值表示蛋白相對表達量。

1.3 統計分析

2 結果

2.1 不同濃度ADVO作用下TPC-1細胞存活率

TPC-1細胞存活率隨ADVO作用濃度增大而降低(P<0.001),60 μg/mL ADVO作用濃度下的細胞存活率接近50%(圖1)。

圖1 不同濃度ADVO下的TPC-1細胞存活率比較Figure 1 The viability of TPC-1 cells treated with different concentrations of ADVONote:***P<0.001,when compared with the negative control group(0 μg/mL).

2.2 各組TPC-1細胞增殖情況

與空白組比較,miR-762 mimics組細胞存活率升高(P<0.001),ADVO組細胞存活率下降(P<0.001);與ADVO組比較,ADVO+miR-762 mimics組細胞存活率升高(P<0.001)(圖2)。

圖2 各組TPC-1細胞存活率比較Figure 2 The viability of TPC-1 cells treated with ADVO,miR-762 mimics or their combinationNote:***P<0.001,when compared with the blank group;△△△P<0.001,when compared with the miR-762 mimics NC group;###P<0.001,when compared with the ADVO group;▲▲▲P<0.001,when compared with the ADVO+miR-762 mimics NC group.

2.3 各組TPC-1細胞凋亡情況

與空白組比較,miR-762 mimics組細胞凋亡率降低(P<0.001),ADVO組細胞凋亡率升高(P<0.001);與ADVO組比較,ADVO+miR-762 mimics組細胞凋亡率降低(P<0.001)(圖3,圖4)。

圖3 流式細胞儀檢測各組TPC-1細胞凋亡情況Figure 3 The apoptotic rates of were detected in TPC-1 cells by flow cytometry

圖4 各組TPC-1細胞凋亡率比較Figure 4 The comparison of apoptotic rates in TPC-1 cells treated with ADVO,miR-762 mimics,NC or their combinationNote:***P<0.001,when compared with the blank group;△△△P<0.001,when compared with the miR-762 mimics NC group;###P<0.001,when compared with the ADVO group;▲▲▲P<0.001,when compared with the ADVO+miR-762 mimics NC group.

2.4 各組TPC-1細胞侵襲及遷移情況

與空白組比較,miR-762 mimics組細胞侵襲及遷移數增加(P<0.001),ADVO組細胞侵襲及遷移數減少(P<0.001);與ADVO組比較,ADVO+miR-762 mimics組細胞侵襲及遷移數增加(P<0.001)(圖5,圖6)。

圖5 各組TPC-1細胞侵襲及遷移情況(400×)Figure 5 The invasion and migration of TPC-1 cells treated with ADVO,miR-762 mimics or their combination(400×)

圖6 各組TPC-1細胞侵襲及遷移細胞數比較Figure 6 The cellular number of migration and invasion in TPC-1 cells treated with ADVO,miR-762 mimics or their combinationNote:***P<0.001,when compared with the blank group;△△△P<0.001,when compared with the miR-762 mimics NC group;###P<0.001,when compared with the ADVO group;▲▲▲P<0.001,when compared with the ADVO+miR-762 mimics NC group.

2.5 miR-762與NF2基因的靶向關系

經生物信息學分析,NF2基因被預測為miR-762的潛在靶基因(圖7)。雙熒光素酶報告基因實驗結果顯示,與mimics NC組比較,miR-762 mimics共轉染NF2-WT組的熒光相對活性顯著降低(P<0.001),而共轉染NF2-MUT組的熒光相對活性無顯著性變化(P>0.05)(圖8)。

圖7 TargetScan靶基因預測結果Figure 7 The prediction results of target gene by TargetScan

圖8 各組細胞熒光素酶活性相對變化Figure 8 Relative changes of luciferase activity in each groupNote:***P<0.001,when compared with the mimics NC group.

2.6 各組TPC-1細胞miR-762與NF2 mRNA相對表達情況

與空白組比較,miR-762 mimics組細胞miR-762相對表達水平升高、NF2 mRNA相對表達水平降低(P<0.001),ADVO組miR-762相對表達水平降低、NF2 mRNA相對表達水平升高(P<0.001);與ADVO組比較,ADVO+miR-762 mimics組細胞miR-762相對表達水平升高、NF2 mRNA相對表達水平降低(P<0.001)(圖9)。

圖9 各組TPC-1細胞中miR-762及NF2 mRNA相對表達水平比較Figure 9 The relative expression of miR-762 and NF2 mRNA in TPC-1 cells in each groupNote:***P<0.001,when compared with the blank group;△△△P<0.001,when compared with the miR-762 mimics NC group;###P<0.001,when compared with the ADVO group;▲▲▲P<0.001,when compared with the ADVO+miR-762 mimics NC group.

2.7 各組TPC-1細胞中蛋白相對表達情況

與空白組相比,miR-762 mimics組細胞Merlin、p-YAP1、C-caspase-3和E-cadherin蛋白相對表達水平降低,YAP1、Vimentin蛋白相對表達水平升高(P<0.001),ADVO組細胞Merlin、p-YAP1、C-caspase-3和E-cadherin蛋白相對表達水平升高,YAP1、Vimentin蛋白相對表達水平降低(P<0.001);與ADVO組比較,ADVO+miR-762 mimics組細胞Merlin、p-YAP1、C-caspase-3和E-cadherin蛋白相對表達水平降低,YAP1、Vimentin蛋白相對表達水平升高(P<0.05)(圖10,圖11)。

圖10 各組TPC-1細胞中相關蛋白相對表達水平Figure 10 The expression of merlin,YAP1,p-YAP1,C-caspase-3,E-cadherin and vimentin proteins in TPC-1 cells in each groupNote:***P<0.001,when compared with the blank group;△△△P<0.001,when compared with the miR-762 mimics NC group;###P<0.001,when compared with the ADVO group;▲▲▲P<0.001,when compared with the ADVO+miR-762 mimics NC group.

圖11 各組TPC-1細胞中蛋白表達量Figure 11 The expression of merlin,YAP1,p-YAP1,C-caspase-3,E-cadherin and vimentin proteins in TPC-1 cells in each groupNote:A.The blank group;B.The miR-762 mimics NC group;C.The ADVO group;D.The ADVO+miR-762 mimics NC group;E.The ADVO+miR-762 mimics group;F.The miR-762 mimics group.

3 討論

甲狀腺癌具有廣泛異質性,大多數起源于甲狀腺濾泡細胞,可細分為高分化乳頭狀甲狀腺癌(Papillary thyroid carcinoma,PTC)和濾泡狀甲狀腺癌,PTC是最常見的甲狀腺癌(約90%),其侵襲性亞型與多灶性、局部和遠處轉移及復發密切相關[8]。許多miRNAs在癌癥(包括甲狀腺癌)中異常表達,積極探索調節甲狀腺癌進展的miRNA,探討其分子機制并進行干預,對于甲狀腺癌早期診斷、治療及預后具有積極意義。

細胞增殖、侵襲和遷移被認為是癌細胞惡性行為的最重要生物學特征。在惡性行為背景下,研究發現miR-762表達在肌肉浸潤性膀胱癌和卵巢癌中顯著上調,并可顯著提高癌細胞的增殖及侵襲能力[9-10]。ADVO中含有大量脂肪酸,這些成分可誘導癌細胞凋亡、抑制癌細胞生長及轉移并降低患癌風險[7,11]。本研究結果顯示,miR-762及AVDO對TPC-1細胞的惡性生物學行為起不同作用,miR-762過表達時,可顯著促進TPC-1細胞增殖、遷移、侵襲并抑制其凋亡,AVDO單獨作用時,與其效果相反,且ADVO作用于過表達miR-762組細胞時,可顯著減弱miR-762的促癌作用,提示AVDO可能通過降低miR-762表達發揮抑制甲狀腺癌細胞惡性生物學行為的作用。與經典轉錄因子相比,miRNA通過調節內源性靶基因的表達發揮作用,本研究通過生物信息學軟件預測miR-762靶基因并進行熒光素酶報告基因分析驗證,發現miR-762可直接與NF2基因的3′-UTR作用并抑制NF2表達,提示NF2為miR-762的潛在靶基因。NF2是一種編碼Merlin蛋白的基因,能夠轉導細胞內和細胞外信號以調節細胞增殖、凋亡等生物學過程,并作為一種腫瘤抑制基因,與多種人類癌癥有關[12]。多項研究表明,NF2基因在腫瘤轉移中起重要作用,Garcia等[13]證明,NF2/Merlin失活可導致低分化甲狀腺癌病理進展;You等[14]研究結果顯示,NF2過表達時,可顯著抑制甲狀腺癌細胞增殖、遷移及侵襲,在右側頸淋巴結轉移的PTC中,NF2 mRNA表達較低。本研究發現,未處理的癌細胞中,miR-762表達水平較高,NF2 mRNA相對表達水平較低,過表達miR-762后,NF2 mRNA相對表達水平顯著降低,但ADVO可通過降低miR-762表達逆轉此情況,提示ADVO可能通過降低癌細胞內miR-762表達,上調其靶基因NF2水平進而發揮抗PTC-1細胞惡性生物學行為的作用。

Merlin主要通過激活Hippo通路來調節生長控制[15]。Hippo通路的核心是蛋白激酶級聯反應,YAP為該級聯中的效應蛋白,且僅在通路不活躍時定位于細胞核,進而控制細胞分化、組織生長、促增殖和抗凋亡基因表達;Hippo通路被激活時,YAP被磷酸化為p-YAP,p-YAP不能進入細胞核并滯留于胞質內被降解、失活,Merlin為YAP滅活劑[16]。上皮-間質轉化(Epithelial mesenchymal transformation,EMT)是一種上皮細胞向間充質表型轉化的細胞過程,此過程中,上皮細胞獲得間充質表型,包括高遷移和侵襲、抗凋亡和降解細胞外基質的能力,同時Vimentin表達上調,E-cadherin表達下調[17]。Lai等[18]研究發現,miR-762表達上調可促進結腸癌增殖、侵襲及EMT;Zheng等[19]研究證明,Hippo信號通路可調節EMT以促進甲狀腺癌發展、侵襲及轉移,這與p-YAP增加和YAP表達降低有關[20]。Caspase-3為細胞凋亡途徑的下游主要效應蛋白酶,其裂解提示細胞凋亡程序的激活,本研究結果顯示,miR-762過表達后,Merlin、p-YAP1、C-caspase-3及E-cadherin蛋白相對表達水平顯著降低,YAP1及Vimentin蛋白表達顯著上調,經ADVO作用后,可逆轉此情況,且ADVO作用于過表達miR-762組細胞時,可減弱miR-762效果,提示ADVO可能通過抑制miR-762表達,上調抑癌蛋白Merlin水平從而激活Hippo-YAP信號通路,降低YAP核內表達,進而抑制下游抗凋亡、促增殖及EMT等相關基因轉錄以發揮抑制PTC-1細胞增殖、遷移及侵襲并促進其凋亡作用。

綜上所述,ADVO可抑制甲狀腺癌細胞的惡性生物學行為,其作用機制可能與介導miR-762/NF2軸激活抑癌相關信號有關。但本研究僅在細胞水平上進行了探究,關于ADVO在動物水平上對腫瘤形成、發展及惡性轉移的影響及機制仍待進一步論證。