細(xì)胞周期蛋白K促進(jìn)食管鱗癌細(xì)胞增殖的機(jī)制研究*

尚瑤， 王芳， 王歆慧， 孔鵬洲， 成曉龍△

· 論著 ·

細(xì)胞周期蛋白K促進(jìn)食管鱗癌細(xì)胞增殖的機(jī)制研究*

尚瑤1，2， 王芳2， 王歆慧1，2， 孔鵬洲2， 成曉龍2△

（1山西醫(yī)科大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院，山西 太原 030001；2山西醫(yī)科大學(xué)醫(yī)學(xué)轉(zhuǎn)化研究中心，山西 太原 030001）

探討細(xì)胞周期蛋白K（CCNK）促進(jìn)食管鱗狀細(xì)胞癌（ESCC）發(fā)生發(fā)展的機(jī)制。對中國ESCC高發(fā)區(qū)155例患者的轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)及GSE53625數(shù)據(jù)庫進(jìn)行基因差異表達(dá)分析；通過轉(zhuǎn)染慢病毒分別在KYSE150、KYSE30及KYSE180細(xì)胞中構(gòu)建基因穩(wěn)定敲減（CCNK-SH）和陰性對照（NC）細(xì)胞株；利用集落形成實驗和CCK-8法檢測敲減基因?qū)SCC細(xì)胞增殖的影響；應(yīng)用流式細(xì)胞術(shù)檢測敲減基因?qū)SCC細(xì)胞周期的影響；分析155例ESCC患者轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)，對差異表達(dá)基因進(jìn)行信號通路富集；應(yīng)用免疫熒光染色檢測DNA損傷的指標(biāo)γ-H2AX；分析155例ESCC患者轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)和RT-qPCR實驗驗證基因與DNA損傷修復(fù)相關(guān)基因表達(dá)的情況。基因在ESCC組織中高表達(dá)（<0.01）；與NC組相比，CCNK-SH組細(xì)胞增殖和集落形成能力顯著降低（<0.01）；敲減基因能夠?qū)SCC細(xì)胞阻滯于G2/M期（<0.01）；免疫熒光染色結(jié)果顯示，與NC組相比，CCNK-SH組γ-H2AX信號顯著增強(qiáng)（<0.01）；基因表達(dá)與DNA損傷相關(guān)基因存在顯著相關(guān)性。CCNK可能通過DNA損傷修復(fù)機(jī)制參與細(xì)胞周期調(diào)控，從而影響ESCC細(xì)胞的增殖。

食管鱗狀細(xì)胞癌；細(xì)胞周期蛋白K；細(xì)胞增殖；細(xì)胞周期；DNA損傷

食管癌是世界上最致命的癌癥之一，其發(fā)病率和死亡率在中國位居前十［1］，癌變過程與癌基因的異常激活和抑癌基因的異常失活密切相關(guān)［2］。食管腺癌和食管鱗狀細(xì)胞癌（esophageal squamous cell carcinoma， ESCC）是食道惡性腫瘤的兩種主要亞型，各自具有不同的流行病學(xué)和病理生理學(xué)特征［3］。在中國，ESCC是食管癌的主要亞型，流行率很高，特別是在北部的太行山脈地區(qū)，一經(jīng)檢測多為晚期，病死率高，預(yù)后差，5年生存率不足20%［4-6］。因此，尋找新靶點對早期診斷和治療ESCC具有重要意義。

DNA是遺傳的基本單位，是遺傳信息的來源［7-8］。人體中的1013個細(xì)胞中每個細(xì)胞每天都會受到數(shù)萬個DNA損傷，這些損傷會阻止基因組復(fù)制和轉(zhuǎn)錄［9］。DNA損傷通常由固有的DNA損傷反應(yīng)機(jī)制識別和修復(fù)，如果受損的細(xì)胞被成功修復(fù)，細(xì)胞就會存活［10］。細(xì)胞周期中的細(xì)胞進(jìn)程由細(xì)胞周期蛋白依賴的激酶調(diào)節(jié)，以避免在前一個細(xì)胞周期完成之前啟動一個細(xì)胞周期。DNA損傷會干擾細(xì)胞周期，因此，有一些檢查點蛋白可以延緩細(xì)胞周期進(jìn)程，為DNA修復(fù)提供必要的時間［11］。細(xì)胞周期蛋白K（cyclin K， CCNK）是一種有580個氨基酸殘基的蛋白質(zhì)，通過其調(diào)節(jié)RNA聚合酶II大亞基的C端結(jié)構(gòu)域磷酸化的作用，參與轉(zhuǎn)錄控制［12］。有研究表明，CCNK調(diào)節(jié)前復(fù)合體組裝的形成且CCNK的表達(dá)與細(xì)胞增殖呈正相關(guān)［13］。細(xì)胞周期蛋白依賴性激酶已經(jīng)發(fā)展成為治療多種疾病（包括癌癥和白血病）的重要靶蛋白［14］。然而，基因在ESCC中的生理作用仍不清楚。本研究旨在通過一系列的實驗，探討基因在ESCC中的作用機(jī)制，為后續(xù)進(jìn)一步研究提供參考資料。

材料和方法

1　細(xì)胞系

本研究所用到的ESCC細(xì)胞株TE1、KYSE150、KYSE140、KYSE180、KYSE410、KYSE450、KYSE30、KYSE510、KYSE680和KYSE70來自中國科學(xué)院上海生命科學(xué)研究細(xì)胞資源中心，由山西醫(yī)科大學(xué)轉(zhuǎn)化醫(yī)學(xué)中心食管癌發(fā)病機(jī)理及轉(zhuǎn)化研究中心樣本庫保存。

2　主要試劑及儀器

細(xì)胞培養(yǎng)液和胰蛋白酶購自HyClone；胎牛血清購自Gibco；Trizol、RNA反轉(zhuǎn)錄試劑盒和RT-qPCR試劑盒均購自TaKaRa；Western blotting檢測所需試劑購自Solarbio；細(xì)胞增殖及毒性檢測試劑盒（CCK-8，MA0218）購自大連博格林生物科技有限公司；DNA損傷檢測試劑盒（C2035S）購自上海碧云天生物技術(shù)有限公司；鹽酸博來霉素購于MedChemExpress。

普通PCR儀（Veriti）和熒光定量PCR儀（StepOne Plus）均購自Applied Biosystems；蛋白電泳系統(tǒng)和蛋白轉(zhuǎn)印系統(tǒng)均購自Bio-Rad；低溫高速離心機(jī)（Micro21R）和CO2恒溫細(xì)胞培養(yǎng)箱均購自Thermo。

3　研究對象

本課題所用155例ESCC組織和配對的癌旁組織均收集自中國食管癌高發(fā)區(qū)山西省腫瘤醫(yī)院，第一次進(jìn)行手術(shù)切除治療，術(shù)前未經(jīng)過新輔助療法、化療或放療。ESCC的臨床分級參照美國癌癥聯(lián)合委員會及國際抗癌聯(lián)盟指定的2010年第7版TNM分級標(biāo)準(zhǔn)。所有標(biāo)本的采集均通過了患者本人及家屬同意并簽署了知情同意書，已取得山西省腫瘤醫(yī)院倫理委員會及山西醫(yī)科大學(xué)倫理委員會同意。具體信息見表1。

表1　155例樣本臨床信息

4　實驗方法

4.1ESCC細(xì)胞培養(yǎng)與分組KYSE30、KYSE150和KYSE180細(xì)胞均以含10%胎牛血清和1%雙抗（青霉素和鏈霉素混合溶液）的RPMI-1640培養(yǎng)液，置于37 ℃、5% CO2的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。細(xì)胞密度達(dá)到70%～80%進(jìn)行傳代培養(yǎng)，每2～3 d換一次液。在KYSE30、KYSE150和KYSE180細(xì)胞中轉(zhuǎn)染CCNK-shRNA病毒，之后將細(xì)胞分為對照組（KYSE30、KYSE150和KYSE180組）和敲減組（KYSE30-CCNK-SH、KYSE150-CCNK-SH和KYSE180-CCNK-SH組）共6組細(xì)胞，進(jìn)行后續(xù)實驗。

4.2基因穩(wěn)定敲減細(xì)胞株的構(gòu)建由于基因在ESCC中表達(dá)量很高，因此我們選擇了三種ESCC細(xì)胞系進(jìn)行敲減。根據(jù)細(xì)胞本身的特性及狀態(tài)，我們篩選出KYSE30、KYSE180和KYSE150細(xì)胞系用于構(gòu)建穩(wěn)定敲減基因的細(xì)胞株。感染慢病毒前1 d將細(xì)胞接種至24孔板中，每孔1×104個細(xì)胞，次日感染CCNK-shRNA病毒，棄掉孔板中原有培養(yǎng)液，根據(jù)MOI=10、50和100計算病毒體積，用無雙抗的完全培養(yǎng)液將液體補(bǔ)至250 μL，放入細(xì)胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)6 h后補(bǔ)液至500 μL，待細(xì)胞密度達(dá)到50%后加嘌呤霉素篩選1～2周。

4.3RT-qPCR使用Trizol法提取總RNA，利用PrimeScriptTMRT Master Mix試劑盒（RR036A； TaKaRa）進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄，反應(yīng)條件為：37 ℃ 15 min→85 ℃ 5 s→4 ℃保存。利用TB Green?Premix Ex TaqTM試劑盒（RR420Q； TaKaRa）進(jìn)行RT-qPCR，根據(jù)說明書配制體系后按照以下條件進(jìn)行：95 ℃ 5～10 min→（95 ℃ 15 s→65 ℃ 15 s→72 ℃ 30～60 s）×30～40個循環(huán)→4 ℃保存。最后用2-ΔΔCt法計算相對表達(dá)量。引物序列見表2。

表2　RT-qPCR引物序列

4.4Western blot將收集的細(xì)胞沉淀在含蛋白酶抑制劑的蛋白裂解液中裂解。4 ℃、12 000×離心30 min后收集上清液。用BCA法測定蛋白質(zhì)濃度。配制ESCC細(xì)胞蛋白樣品，進(jìn)行SDS-PAGE凝膠電泳，轉(zhuǎn)至PVDF膜上；用5%脫脂奶粉在室溫下封閉1 h，之后加入抗GAPDH抗體（60004-1-Ig； Proteintech）或抗CCNK抗體（AB85854； Abcam）于4 ℃孵育過夜；次日用TBST洗滌3次，之后加入熒光標(biāo)記的羊抗兔IgG（926-32211； LI-COR）或羊抗小鼠IgG（926-32210； LI-COR），室溫孵育2 h，用TBST洗膜后上機(jī)檢測蛋白條帶并使用ImageJ軟件進(jìn)行分析。

4.5CCK-8實驗將CCNK-SH組和對照組細(xì)胞接種于96孔板中，每孔3×103個細(xì)胞（重懸于200 μL培養(yǎng)液中），分別于24、48、72和96 h加入100 μL含10% CCK-8試劑的培養(yǎng)液，加入前注意將原培養(yǎng)液吸盡，于培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)0.5～4 h后，用酶標(biāo)儀檢測在450 nm處吸光度，分析數(shù)據(jù)并繪制圖表。

4.6集落形成實驗將CCNK-SH組和對照組細(xì)胞接種于6孔板中（每孔500個細(xì)胞），置于37 ℃的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，每隔3 d觀察一次。10～14 d后，將形成集落的細(xì)胞用4%的多聚甲醛固定，并用結(jié)晶紫染色，于鏡下觀察并拍照，計數(shù)統(tǒng)計并繪制圖表。

4.7流式細(xì)胞術(shù)收集對數(shù)生長期的CCNK-SH組和對照組細(xì)胞，消化離心后棄上清，用PBS洗2次，之后用預(yù)冷的70%乙醇固定24 h， 300×離心3 min，棄上清，用PBS洗一遍，之后加入由450 μL PI和50 μL RNase A配成的混合液于室溫避光0.5～1 h，之后按照流式細(xì)胞儀操作方法檢測細(xì)胞周期分布，分析數(shù)據(jù)并繪制圖表。

4.8鹽酸博來霉素溶液配制鹽酸博來霉素分子量為1 451 g/mol。母液配制：用無菌去離子水溶解配成10 g/L（6.892 mmol/L），分裝成每管200 μL，-80 ℃密封避光儲存。稀釋液配制：10 mL完全培養(yǎng)液中加1.45 μL鹽酸博來霉素母液，配成1 μmol/L稀釋液10 mL，再分別配成10、20、50、100和200 μmol/L的稀釋液。通過前期摸索及文獻(xiàn)查找，觀察到當(dāng)鹽酸博來霉素濃度為50 μmol/L、誘導(dǎo)2 h時效果最好。

4.9DNA損傷檢測將CCNK-SH組和對照組細(xì)胞接種至6孔板中，待細(xì)胞貼壁后于細(xì)胞中加入50 μmol/L鹽酸博來霉素誘導(dǎo)DNA損傷2 h，之后根據(jù)DNA損傷檢測試劑盒說明書進(jìn)行操作。首先吸除培養(yǎng)液，用PBS洗滌1次；隨后加入1 mL固定液，固定5～15 min，用洗滌液洗3次，每次5 min；之后加入1 mL免疫染色封閉液，常溫封閉10～20 min，去除封閉液，加入1 mL γ-H2AX兔單抗，4 ℃過夜；洗滌液洗3次后加入1 mL抗兔Alexa Fluor 594室溫孵育1 h，之后加入1 mL DAPI染色液，常溫放置5 min左右進(jìn)行核染色；最后在細(xì)胞表面加入一定量抗熒光淬滅封片液，蓋上蓋玻片，進(jìn)行封片。在熒光顯微鏡下觀察染色情況。

5　統(tǒng)計學(xué)分析

本研究的所有實驗數(shù)據(jù)均進(jìn)行了3次獨立重復(fù)實驗。使用GraphPad Prism 8作圖并進(jìn)行數(shù)據(jù)處理。結(jié)果表示為均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（mean±SD）。采用檢驗或方差分析進(jìn)行組間差異分析，以<0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義；采用Pearson相關(guān)分析評估數(shù)據(jù)的相關(guān)性，>0.2或<-0.2認(rèn)為存在相關(guān)性。

結(jié)果

1　CCNK在ESCC中高表達(dá)

通過分析155例ESCC患者的轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)，提示CCNK mRNA在ESCC腫瘤組織中的平均表達(dá)量是29.879 4，在正常組織的平均表達(dá)量是21.740 7，腫瘤組織中的表達(dá)是正常組織的1.37倍（<0.01），見圖1A。對GSE53625數(shù)據(jù)庫中358例樣本的表達(dá)量進(jìn)行分析，顯示CCNK mRNA在ESCC腫瘤組織中的平均表達(dá)量是12.34，在正常組織的平均表達(dá)量是11.86，腫瘤組織中的表達(dá)是正常組織的1.04倍（<0.01），見圖1B。

Figure 1.　The mRNA expression of CCNK in transcriptome data from esophageal squamous cell carcinoma patients （A； n=155） and GSE53625 database （B； n=358）. The mRNA levels of CCNK in ESCC tumor tissues （T） and corresponding non-tumor tissues （N） were analyzed using paired t-test （P<0.01）.

2　CCNK基因敲減穩(wěn)株的效率檢測

RT-qPCR檢測CCNK在各個ESCC細(xì)胞系中的mRNA表達(dá)，結(jié)果見圖2。

Figure 2.　The mRNA expression of CCNK in different esophageal squamous cell carcinoma cell lines. Mean±SD. n=3. *P<0.05， **P<0.01 vs KYSE150.

根據(jù)CCNK在各個細(xì)胞系中的表達(dá)量及細(xì)胞本身的特性和狀態(tài)，我們篩選出KYSE30、KYSE180和KYSE150細(xì)胞系用于構(gòu)建穩(wěn)定敲減基因的細(xì)胞株。RT-qPCR結(jié)果顯示，與對照組相比，KYSE150-CCNK-SH1組的敲減效率為82.34%（<0.01），見圖3A；KYSE180-CCNK-SH1組的敲減效率為63.22%，KYSE180-CCNK-SH2組的敲減效率為74.94%（<0.01），見圖3B；KYSE30-CCNK-SH1組的敲減效率為49，49%，KYSE30-CCNK-SH2組的敲減效率為50.5%（<0.01），見圖3C。Western blot結(jié)果顯示，與對照組相比，KYSE150-CCNK-SH1組的敲減效率為35.33%（<0.01），見圖3D；KYSE180-CCNK-SH1組的敲減效率為21.10%，KYSE180-CCNK-SH2組的敲減效率為60.71%（<0.01），見圖3E；KYSE30-CCNK-SH1組的敲減效率為64.35%，KYSE30-CCNK-SH2組的敲減效率為56.05%（<0.01），見圖3F。

Figure 3.　The efficiency of stable knockdown of CCNK gene in esophageal squamous cell carcinoma cell lines. The mRNA （A， B and C） and protein （D， E and F） levels of CCNK in KYSE150 （A and D）， KYSE180 （B and E） and KYSE30 （C and F） cells were detected by qRT-PCR and Western blot， respectively. Mean±SD. n=3. **P<0.01 vs NC group.

3　CCNK基因?qū)SCC細(xì)胞增殖的影響

CCK-8結(jié)果顯示，與KYSE150對照組相比，KYSE150-CCNK-SH1組細(xì)胞活力顯著下降（<0.01），見圖4A；與KYSE180對照組相比，KYSE180-CCNK-SH1和KYSE180-CCNK-SH2組細(xì)胞活力均顯著下降（<0.01），見圖4B；與KYSE30對照組相比，KYSE30-CCNK-SH1和KYSE30-CCNK-SH2組細(xì)胞活力均顯著下降（<0.01），見圖4C。集落形成實驗結(jié)果顯示，與KYSE150對照相比，KYSE150-CCNK-SH1組細(xì)胞集落形成數(shù)目減少了70.36%（<0.01），見圖4D；與KYSE180對照相比，KYSE180-CCNK-SH1組和KYSE180-CCNK-SH2組細(xì)胞集落形成數(shù)目分別減少了88.82%和84.67%（<0.01），見圖4E；與KYSE30對照相比，KYSE30-CCNK-SH1組和KYSE30-CCNK-SH2組細(xì)胞集落形成數(shù)目分別減少了41.74%和45.18%（<0.01），見圖4F。

Figure 4.　Knockdown of CCNK inhibited the proliferation of esophageal squamous cell carcinoma cells. The viability （A， B and C） and colony-forming ability （D， E and F） of KYSE150 （A and D）， KYSE180 （B and E） and KYSE30 （C and F） cells were detected by CCK-8 assay and colony formation assay， respectively. Mean±SD. n=3. **P<0.01 vs NC group.

4　CCNK基因?qū)SCC細(xì)胞周期的影響

流式細(xì)胞術(shù)結(jié)果顯示，與KYSE150對照組相比，KYSE150-CCNK-SH1組處于G2/M期的細(xì)胞比例由5.38%增加到19.26%（<0.01），見圖5A；與KYSE180對照組相比，KYSE180-CCNK-SH1組G2/M期的細(xì)胞阻滯率由8.25%增加到20.18%（<0.01），KYSE180-CCNK-SH2組的G2/M期細(xì)胞阻滯率增加到22.70%（<0.01），見圖5B；與KYSE30對照組相比，KYSE30-CCNK-SH1組處于G2/M期的細(xì)胞比例由5.27%增加到13.93%（<0.01），KYSE30-CCNK-SH2組的G2/M期細(xì)胞阻滯率增加到12.64%（<0.01），見圖5C。

Figure 5.　Knockdown of CCNK induced G2/M phase arrest in esophageal squamous cell carcinoma cells. The cell cycle of KYSE150 （A）， KYSE180 （B） and KYSE30 （C） cells was detected by flow cytometry. Mean±SD. n=3. *P<0.05， **P<0.01 vs NC group.

5　CCNK基因可能通過DNA損傷修復(fù)機(jī)制參與ESCC細(xì)胞周期調(diào)控

對155例ESCC患者轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)中差異表達(dá)基因進(jìn)行KEGG富集分析，提示基因與cell cycle、p53 signaling pathway，NF-κB signaling pathway、Notch signaling pathway等通路相關(guān)，見圖6。

Figure 6.　Bubble map of CCNK-related gene enrichment analysis.

免疫熒光染色結(jié)果顯示，與KYSE150對照組相比，KYSE150-CCNK-SH1組γ-H2AX信號顯著增強(qiáng)，見圖7。

Figure 7.　Changes of γ-H2AX， a DNA damage marker， in KYSE150 cells with CCNK knockdown. The cells was stained with the primary antibody of anti-γ-H2AX and the secondary antibody of Alexa Fluor 594-conjugated goat anti-rabbit IgG （red） in NC group （A） and CCNK-SH1 group （D）. The nuclei of the cells were stained with DAPI （blue） in NC group （B） and CCNK-SH1 group （E）. The merged images of NC group （C） and CCNK-SH1 group （F） were shown. The cells were all induced by bleomycin at 50 μmol/L for 2 h. The DNA damage signal was indicated by red arrows.

利用155例轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)對基因與細(xì)胞周期和DNA損傷相關(guān)基因進(jìn)行相關(guān)性分析，提示、、、和與基因的表達(dá)呈正相關(guān)，、和與基因的表達(dá)呈負(fù)相關(guān)，見圖8。

Figure 8.　Correlation analysis between CCNK and DNA damage-related genes ［CCNB1 （A）， CDK1 （B）， TP53BP1 （C）， ATR （D）， TP53 （E）， CDKN1A （F）， EP300 （G） and ATM （H）］ in transcriptome data from 155 cases of esophageal squamous cell carcinoma patients.

RT-qPCR結(jié)果顯示，敲減基因后，KYSE150和KYSE180細(xì)胞中TP53BP1的mRNA表達(dá)量顯著上調(diào)（<0.01），CCNB、CDK1、TP53、P21和EP300的mRNA表達(dá)量顯著下調(diào)（<0.01），見圖9。

Figure 9.　The mRNA expression of DNA damage-related genes in KYSE150 （A） and KYSE180 （B） cells with CCNK knockdown was detected by RT-qPCR. Mean±SD. n=3. *P<0.05， **P<0.01 vs NC group.

討論

細(xì)胞周期的正常維持依賴于兩個細(xì)胞周期檢查點以及細(xì)胞周期調(diào)控系統(tǒng)的監(jiān)測。其中細(xì)胞周期調(diào)控系統(tǒng)由細(xì)胞周期蛋白、周期蛋白依賴性激酶（cyclin-dependent kinase， CDK）以及CDK抑制劑三者的相互制衡組成［15］。CCNK作為細(xì)胞周期蛋白家族成員之一，主要參與RNA聚合酶II的羧基末端結(jié)構(gòu)域磷酸化，促進(jìn)轉(zhuǎn)錄調(diào)控［16］。文獻(xiàn)報道CCNK可以與CDK12結(jié)合，參與DNA損傷修復(fù)相關(guān)基因的轉(zhuǎn)錄［17-18］。目前在結(jié)直腸癌［19］、非小細(xì)胞型肺癌［22］及晚期耐藥的前列腺癌［20］患者中檢測到CCNK與患者耐藥相關(guān)，并通過藥物篩選找到了針對CCNK的小分子化合物，這進(jìn)一步推動了CCNK作為腫瘤靶標(biāo)的研究。CCNK在ESCC中的研究尚無報道，在本次研究中，我們的結(jié)果提示CCNK在ESCC細(xì)胞周期調(diào)控中發(fā)揮重要作用，敲減基因表達(dá)，ESCC細(xì)胞周期會阻滯在G2/M期。G2/M期是決定細(xì)胞一分為二的控制點，主要檢測DNA是否損傷，作用是使得細(xì)胞有充足的時間將損傷的DNA得以修復(fù)。因此我們推測CCNK可能通過調(diào)節(jié)細(xì)胞周期而影響DNA損傷修復(fù)進(jìn)而促進(jìn)ESCC細(xì)胞增殖。

DNA損傷達(dá)到一定程度會導(dǎo)致細(xì)胞周期停滯、細(xì)胞凋亡等現(xiàn)象［21］。DNA發(fā)生損傷時細(xì)胞內(nèi)的監(jiān)控系統(tǒng)PI3K相關(guān)激酶會立刻被激活：如共濟(jì)失調(diào)-毛細(xì)血管擴(kuò)張突變（ataxia telangiectasia mutated， ATM）、共濟(jì)失調(diào)毛細(xì)血管擴(kuò)張和Rad3相關(guān)（ataxia telangiectasia and Rad3-related， ATR）及DNA依賴蛋白激酶［22］。其中ATM和ATR蛋白可以直接或間接磷酸化p53、Mdm2等蛋白是的下游靶基因，它一方面可以與p53結(jié)合，促進(jìn)p53的降解［23］，另一方面被ATM磷酸化而失去活性［24］，這一機(jī)制促使p53蛋白在DNA損傷過程中不被降解。p53充當(dāng)轉(zhuǎn)錄因子，可引起細(xì)胞周期阻滯和DNA損傷修復(fù)。如通過激活下游靶基因［25］、［24］等，抑制CCNB-CDK1復(fù)合體進(jìn)入細(xì)胞核，使細(xì)胞阻滯在G2/M期并促進(jìn)DNA修復(fù)。基因的另一個重要的下游靶基因是（）［26］，它是一種CDK抑制劑，DNA損傷誘發(fā)p53蛋白水平升高，p21蛋白水平也相應(yīng)升高，抑制CDK2和CDC2的水平，促進(jìn)細(xì)胞周期阻滯［27-28］。我們的研究表明，基因低表達(dá)使細(xì)胞周期阻滯在G2/M期，與該時相的標(biāo)志基因和表達(dá)呈顯著正相關(guān)，而與和基因表達(dá)呈負(fù)相關(guān)，我們猜測基因低表達(dá)會影響G2/M期DNA損傷修復(fù)過程，通過mRNA和蛋白水平分析我們也證實了這一點，即基因低表達(dá)與TP53BP1和γ-H2AX的信號呈現(xiàn)顯著負(fù)相關(guān)。CCNK參與G2/M期DNA損傷修復(fù)調(diào)控的具體機(jī)制可能是：CCNK蛋白低表達(dá)導(dǎo)致ATM和ATR蛋白表達(dá)增多，通過p53的磷酸化和p21蛋白水平的表達(dá)，抑制CCNB和CDK1蛋白水平。但基因的下調(diào)是否是DNA損傷的驅(qū)動因素我們尚不得知，且CCNK在ESCC中參與p53通路的具體過程，細(xì)胞周期停滯在G2/M期后ESCC細(xì)胞的結(jié)局還有待進(jìn)一步探索。

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Mechanism of cyclin K promoting proliferation of esophageal squamous cell carcinoma cells

SHANG Yao1，2， WANG Fang2， WANG Xinhui1，2， KONG Pengzhou2， CHENG Xiaolong2△

（1，，030000，；2，，030000，）

To explore the role and mechanism of cyclin K （CCNK） in the development of esophageal squamous cell carcinoma （ESCC）.Transcriptome data of 155 patients with ESCC in China and GSE53625 database were analyzed for the differential expression ofgene. Cell lines with stable knockdown ofgene （CCNK-SH） and negative control （NC） cell lines were constructed in KYSE150， KYSE30 and KYSE180 cells via transfecting the lentivirus. The proliferation ability was detected by clonal formation assay and CCK-8 assay. The cell cycle was detected by flow cytometry. Pathway enrichment associated withwas analyzed using the transcriptome data of 155 ESCC cases. The DNA damage marker was detected by immunofluorescence staining. The correlations betweenand DNA damage-related genes were verified through the transcriptome data of 155 cases and RT-qPCR assay.was highly expressed in ESCC tumor tissues compared with normal tissues （<0.01）. Its knockdown significantly inhibited cell proliferation and colony formation and induced cell cycle arrest in G2/M phase compared with NC group （<0.01）. Bioinformatics analysis suggested that CCNK was associated with DNA damage repair. Immunofluorescence staining results showed that γ-H2AX signal was significantly enhanced in CCNK-SH group compared with NC group （<0.01）. The expression ofwas significantly correlated with DNA damage-related genes.CCNK might be involved in cell cycle regulation of ESCC cell lines via DNA damage repair pathway.

esophageal squamous cell carcinoma； cyclin K； cell proliferation； cell cycle； DNA damage

1000-4718（2023）07-1153-10

2023-04-12

2023-06-15

0351-4135728； E-mail： chengxl@sxmu.edu.cn

R363.2； R735.1； R-33

A

10.3969/j.issn.1000-4718.2023.07.001

［基金項目］國家自然科學(xué)基金資助項目（No. 82072746）；山西省基礎(chǔ)研究計劃青年科學(xué)研究項目（No. 202103021223220）

（責(zé)任編輯：林白霜，羅森）