牙齦卟啉單胞菌與常見消化系統惡性腫瘤相關性的研究現狀

龔忠誠, 買熱拍提·買明, 李晨曦, 熱孜萬姑麗·亞森

(1新疆醫科大學第一附屬醫院(附屬口腔醫院) 頜面腫瘤外科, 2新疆維吾爾自治區口腔醫學研究所, 烏魯木齊 830054)

1 牙齦卟啉單胞菌的主要特征

慢性感染是癌癥發展中重要的流行病學決定因素,近20%的人類惡性腫瘤與感染因子有關[1]。牙齦卟啉單胞菌(Porphyromonasgingivalis,P.gingivalis)的致病因素多樣,包括其自身結構成分,如脂多糖(Lipopolysaccharide,LPS)、菌毛、熱休克蛋白(Heat shock protein,HSP)和分泌成分,如牙齦素(gingipains)和外膜囊泡,它們刺激相鄰上皮細胞產生各種細胞因子[2],包括白細胞介素(Interleukins,ILs)和腫瘤壞死因子-α(Tumor necrosis factor-alpha,TNF-α),從而促進腫瘤微環境(Tumor microenvironment,TME)中的炎癥反應[3]。P.gingivalis同時是一種兼性胞內細菌,能入侵多種宿主細胞,包括牙齦上皮細胞、內皮細胞、血管平滑肌細胞、樹突狀細胞和神經元[4]。研究證實P.gingivalis涉及多種系統性疾病[5],如心血管疾病、神經系統疾病、自身免疫病、呼吸系統疾病、代謝性疾病、不良妊娠等。

P.gingivalis生長所需的代謝能來自蛋白質分解產物、血紅素和維生素K。P.gingivalis產生的牙齦素和肽基精氨酸脫亞胺酶(Peptidyl deaminase,PAD)成為其發病機制中的重要因素。牙齦素會導致局部組織破壞,擾亂宿主的抗菌防御,導致口腔和腸道內共生細菌過度生長及播散。菌群失調導致有毒代謝物的增加,這促進了與心血管疾病和自身免疫相關的代謝紊亂[2]。

囊泡是細胞膜的一部分,大小為50～300 nm,形成于A-LPS和具有C-末端結構域(CTD)的蛋白質(如牙齦素、PAD或血紅素結合蛋白35)組成的雙層膜結構[6]。菌毛促使細菌黏附宿主細胞、與外基質分子、細胞因子和纖維蛋白原、CD14、β2整合素、TLR(toll樣受體)2、4結合[2]。這些相互作用使促炎因子合成,如單核細胞趨化蛋白-1(MCP-1)、TNF-α、IL-1β、IL-6、IL-8等,并誘導多細胞間黏附分子-1(ICAM-1)、血管細胞黏附分子-1(VCAM-1)、P-選擇素(P-selectin)、E-選擇素(E-selectin)、CD40、CD80和CD86的表達[7]。其中IL-8能夠啟動可結合血紅蛋白的受體(HbR),以捕獲卟啉環和血紅素,從而獲得P.gingivalis生長所需的鐵[2]。它的LPS結合高度敏感的模式識別受體(Pattern recognition receptors,PRR)如TLR后[8],通過轉錄因子-核因子-κB (NF-κB)依賴性TNF-α的產生,激發涉及胞外調節蛋白激酶(Extracellular regulated protein kinases,ERK)的炎癥,激活p38和c-Jun氨基末端激酶(c-Jun N-terminal kinase,JNK)以及上調纖溶酶原激活物抑制劑(PAI)-1的表達[9],故LPS對細胞串擾的作用對P.gingivalis的毒力至關重要。P.gingivalis與牙周來源致病菌能夠侵入上皮和結締組織,后進入血液導致菌血癥[10]。

2 P.gingivalis與消化系統惡性腫瘤

2.1P.gingivalis與口腔鱗狀細胞癌口腔鱗狀細胞癌(Oral squamous cell carcinoma,OSCC)TME中多樣化的微生物組成分與癌前組織并不相同,P.gingivalis等牙周病原體與癌變關系密切,P.gingivalis感染增加OSCC患者的死亡風險[11]。它能夠入侵腫瘤細胞,并在胞質中繁殖,周圍的正常細胞亦可受其影響。研究表明,P.gingivalis作為慢性牙周炎(Periodontitis,PD)和侵襲性牙周炎(Aggressive periodontitis)的優勢菌,促進OSCC的發生發展[12]。目前普遍被學者接受的4個機制如下:(1)P.gingivalis誘導上皮-間質轉化(Epithelial-mesenchymal-transition,EMT):在EMT過程中,上皮細胞失去本身的特性,獲得間充質干細胞自我更新特性以及腫瘤細胞的遷移和侵襲特點[3],此過程存在于多種上皮細胞來源的腫瘤中。EMT由一組轉錄因子控制,包括鋅指蛋白1/2(Zinc finger E-box binding homeobox 1/2,ZEB1/ZEB2)、SNAIL轉錄因子、TWIST轉錄因子和Slug轉錄因子等。P.gingivalis上調ZEB1/ZEB2水平[13],其中ZEB1與間充質細胞標志物基質金屬蛋白酶(Matrix metalloproteinase,MMP)-9和波形蛋白(Vimentin)增加有關。P.gingivalis還參與磷酸化GSK3-β通路來調節EMT的發生[5,13]。(2)P.gingivalis抑制細胞凋亡,促進腫瘤細胞增殖:被P.gingivalis感染的上皮呈現出與癌變密切相關的抗凋亡特性。細菌LPS與宿主細胞表面的TLR-4受體結合,從而激活NF-κB蛋白復合物。NF-κB調節細胞基因轉錄,炎性環境引發NF-κB失控[9],該復合物隨后進入細胞核,激活細胞因子基因的轉錄,如IL-6基因。IL-6過度刺激JAK1/STAT3信號通路進而抑制細胞凋亡,同時參與線粒體凋亡、細胞的分化、遷移和增殖[13]。P.gingivalis可上調血管內皮生長因子(Vascular endothelial growth factor,VEGF)的表達,誘導腫瘤血管形成[14]。細胞因子信號轉導抑制因子(Cytokine signal transduction inhibitors,SOCS)3屬于SOCS家族蛋白,是miRNA-203的靶點[7],它的過表達通過JAK/STAT3等途徑降低細胞增殖、誘導細胞凋亡和部分G0/G1阻滯[14]。研究提示P.gingivalis感染的人牙齦上皮細胞(Human gingival epithelial cell,GEC)中miRNA-203水平升高,SOCS3和SOCS6水平降低[14]。核苷二磷酸激酶(Nucleoside diphosphate kinase,NDk)是一種廣泛存在于真核和原核結構域的酶。它在核苷酸代謝中必不可少,催化磷酸從NTP(核苷三磷酸)轉移到NDP(核苷二磷酸)的過程。P.gingivalisNDks不僅可以通過磷酸化Hsp27的絲氨酸殘基誘導細胞凋亡[8,14],而且能抑制嘌呤能受體(P2X7)的ATP活化,減少上皮中IL-1β的產生[8]。IL-1β則是啟動γ干擾素(Interferon-γ,IFN-γ)的關鍵因子,IFN-γ可產生腫瘤抗原特異性CD8+T細胞,此過程使腫瘤逃避免疫監測[7-8]。(3)P.gingivalis促進腫瘤細胞侵襲和轉移:P.gingivalis感染后MMP-1和MMP-2以及proMMP-9的水平明顯上調,其機制可能是通過ERK1/2-Ets1、p38/HSP27和PAR2/NF-κB通路誘導pro-MMP-9表達,而牙齦素將其轉化為MMP-9,導致IL-8依賴性MMP升高,OSCC細胞株的侵襲力增強[14]。P.gingivalis還可以通過參與巨噬細胞極化來促進OSCC的發展,P.gingivalis的LPS激活的巨噬細胞條件培養基促進II-IV期腫瘤的原發和轉移性頭頸部鱗狀細胞癌(Head and neck squamous cell cancer,HNSCC)細胞系的侵襲[15]。P.gingivalis抑制巨噬細胞吞噬SCC細胞株(Cal-27),誘導巨噬細胞功能極化成M2型腫瘤相關巨噬細胞(Tumor-associated macrophages,TAMs),上調TAMs和Cal-27細胞中腫瘤分子編碼基因的表達,從而引發OSCC的免疫逃避[16]。(4)P.gingivalis形成有利于TME的炎性環境:慢性炎癥能夠促進腫瘤的發生發展。巨噬細胞作為非特異性免疫中的主要細胞,它們隨循環系統遷移到身體的大部分組織器官中,誘導IL-1β、IL-6、TNF-α和其他促炎因子的合成和釋放[4]。這些因子抑制細胞凋亡,進一步擾亂細胞周期,為OSCC創造有利條件。NF-κB的激活同樣是細菌引起炎癥的主要因素之一,LPS結合TLR4后通過NF-κB信號通路誘導炎癥相關細胞因子的產生[11]。此外,P.gingivalis的免疫表達可能與C-X-C基序趨化因子配體2(CXCL2)和腫瘤相關中性粒細胞(Tumor associated neutrophils,TANs)呈正相關,三者與OSCC患者的不良預后有關[11]。P.gingivalis的促炎作用與促腫瘤作用相互交叉。

2.2P.gingivalis與食管鱗狀細胞癌Gao等[17]對P.gingivalis在食管鱗狀細胞癌(Esophageal squamous cell carcinoma,ESCC)中的重要作用進行了研究,結果提示P.gingivalis可作為監測食管癌發生發展的重要生物標志物。他們從100名患者身上采集的61%的癌組織樣本中檢測到P.gingivalis。P.gingivalis感染是ESCC的一個危險因素。P.gingivalis感染亦與腫瘤的淋巴結轉移和生存時間減少有關[18]。然而,在食管腫瘤微環境中,P.gingivalis是否是一種明確的致病因子或癌變組織中的微環境僅僅有利于它的定植,有待進一步深入研究。

P.gingivalis在ESCC發生發展中的作用機制與口腔癌有相似之處,亦通過促進EMT、干擾宿主細胞周期、促進腫瘤細胞的侵襲與遷移來實現。果蠅頭狀因子-3(Grainyhead-like3,GRHL3)是一種轉錄因子,參與傷口愈合、血管生成、上皮遷移、表皮分化和屏障形成。研究表明,與未感染的食管癌細胞相比,P.gingivalis感染的ESCC細胞系中GRHL3(miR-194的直接靶點)和抑癌基因PTEN(Phosphatase and tensin)的水平降低,p-Akt及miR-194水平上調,而miR-194的抑制或過度表達對食管癌細胞株(KYSE-30和KYSE-150)的遷移和侵襲有顯著影響[18]。綜上,P.gingivalis通過miR194/GRHL3/PTEN/Akt信號軸促進ESCC增殖和遷移。研究發現P.gingivalis在食道TME中通過觸發NF-κB信號通路,促進ESCC細胞的增殖和轉移[19]。Beclin1是自噬的關鍵調節因子,由Becn1基因編碼, Beclin1在腫瘤發生中起著重要作用,P.gingivalis感染和Beclin1下調增強ESCC細胞(KYSE150和KYSE30)的增殖、遷移和抗凋亡能力[20]。研究表明P.gingivalis的細胞內侵襲通過轉化生長因子-β(TGF-β)依賴性轉錄因子(Smads)/Yes相關蛋白(YAP)/具有PDZ結合基序的轉錄輔激活子(TAZ)增強ESCC細胞的增殖、遷移、侵襲和轉移能力[21]。Smads/YAP/TAZ/TEA結構域轉錄因子1(TEAD1)復合物的形成對于啟動下游靶基因、誘導EMT至關重要。此外,P.gingivalis還能通過跨膜蛋白GARP上調增加TGF-β的分泌和生物活性。

2.3P.gingivalis與胰腺癌胰腺癌(Pancreatic cancer)的預后極差,5年生存率僅為10%左右[22],其中胰腺導管腺癌(Pancreatic ductal adenocarcinoma,PDAC)是最常見的胰腺惡性腫瘤類型,其轉移風險高,約占所有胰腺癌病例的90%[23]。口腔中的P.gingivalis感染及牙周病增加了胰腺癌發生的風險。P.gingivalis引起的TLR激活可以刺激胰腺,并顯著加速小鼠胰腺癌的發生[24]。一項體外動物實驗結果提示P.gingivalis促進胰腺導管細胞中TGF-β信號通路的激活[25]。有證據表明,TGF-β及其下游信號分子在胰腺癌發生中起關鍵作用[26]。TGF-α信號通路可能參與益生菌對PDAC進展的抑制作用。口腔中接種P.gingivalis可加速胰腺上皮內瘤變(PanIN)的發展,益生菌可能通過降低癌細胞增殖,抑制PanIN進展和EMT的發生[25]。在胰腺TME中,P.gingivalis可招募TANs,并增加CXC和中性粒細胞彈性蛋白酶(Neutrophil elastase,NE)的釋放,產生促炎性微環境,有助于胰腺腫瘤的進展[27]。P.gingivalis等相關菌群感染通過miR-21水平升高和PTEN水平降低來促進胰腺癌細胞轉移和化療耐藥[28]。可見,P.gingivalis在某種程度上被認為是胰腺癌發生和發展的一個生物標志物。

2.4P.gingivalis與其他消化道腫瘤尚無證據表明肝癌與P.gingivalis的直接關系,但相關研究表明P.gingivalis參與非酒精性脂肪肝(Non-alcoholic fatty liver disease,NAFLD)、非酒精性脂肪性肝炎(Non-alcoholic steatohepatitis,NASH)及肝纖維化等疾病的發生發展[29-30]。使用高脂肪飲食(HFD)誘導的NASH小鼠模型,P.gingivalis感染后加重了肝臟炎癥和纖維化。P.gingivalis和LPS刺激可誘導造血干細胞和肝細胞產生TGF-β1和半乳糖凝集素-3(Gal-3),它們在肝纖維化的進展中發揮重要作用。P.gingivalis的亮氨酸-異亮氨酸-纈氨酸(Leucine-isoleucine-valine,LIV)系統可能通過誘導支鏈氨基酸水平的增加而加重NAFLD和NASH。P.gingivalis和放線菌也有助于肝硬化患者胰腺癌的發生[31]。

口腔病原體與胃癌(Gastric cancer,GC)前病變之間尚無明確聯系。有研究顯示在高P.gingivalis檢出的個體中,牙周病原體與胃癌前病變的風險相關性增加,口腔內的有菌環境以及牙周病原體可能與胃癌前病變發生有關聯[32]。目前僅有研究表明PD病原菌中的具核梭桿菌(Fusobacterium nucleatum,F.nucleatum)和胃癌有關聯[33],尚無證據表明單獨P.gingivalis與GC的發展有關。消化道腫瘤患者的口腔微生物群顯示出更高的細菌多樣性,如P.gingivalis、齦下福賽斯坦納菌(Tannerella forsythia,T.forsythia)、齒垢密螺旋體(Treponema denticola,T.denticola)和伴放線聚集桿菌(Aggregatibacter actinomycetemcomitans,Aa)[34]。

結腸黏膜屬于厭氧環境,pH值高,有利于P.gingivalis黏附,繼而通過促進微環境中炎癥因子的釋放,最終促進結腸癌的發生。此外,結腸菌群受口腔細菌的影響,特別是長期持續感染P.gingivalis引起腸道菌群失調。除P.gingivalis外,其他牙周病原體包括放線菌,也可以播散至結腸,口腔與結腸的這種連接關系是口腔細菌介導全身炎癥反應的另一種途徑[10]。Lin等[35]通過實驗證明P.gingivalis的GroEL蛋白能夠通過增強內皮細胞的功能以及血管生成加速腫瘤生長,并降低小鼠模型的生存率。還有一項研究[36]顯示C57BL/6N小鼠持續5周感染P.gingivalis,可導致內毒素血癥,降低回腸緊密連接蛋白(Zonula Occludens-1,ZO-1)基因的表達水平。P.gingivalis在結直腸癌發生發展中的作用機制仍需深入研究。

3 啟發

P.gingivalis是牙周炎的主要病原體,可直接或間接地引起全身其他臟器的各種損害。在腫瘤方面,首先,口腔牙菌斑中篩查P.gingivalis可以初步篩查易感人群,有助于癌癥的預防和早期診斷;其次,改善口腔衛生在一定程度上可降低癌癥發病的風險。聯合使用抗P.gingivalis療法和手術、放療或化療,新輔助治療是阻斷P.gingivalis促進消化系統腫瘤的方法。深入研究P.gingivalis在惡性腫瘤中的作用,有助于指導個體化治療,提高患者的生活質量。

WHO在2007年提出應鼓勵促進口腔健康,將其作為健康生活方式的不可或缺的一部分。減少P.gingivalis的負荷被認為是可變因素,牙周治療對預防OSCC有直接或間接的積極影響,在抗菌藥物的使用方面仍需要進一步探索。對于食管癌,目前常用的血清標記對ESCC的早期檢測和進展沒有足夠的敏感性和特異性。ESCC患者唾液中唾液鏈球菌和P.gingivalis的表達顯著增加,這些細菌結合考慮到年齡、性別、吸煙、酒精攝入和過熱飲食偏好時,對ESCC有較高的預測價值[37]。進一步研究P.gingivalis對胰腺癌的作用機制,有助于降低胰腺癌的死亡率。對P.gingivalis的致病機理進行阻斷有望預防疾病、減弱其影響和改善預后。

(利益沖突 所有作者聲明不存在利益沖突。

作者貢獻聲明 買熱拍提·買明:起草文章;熱孜萬姑麗·亞森:文獻檢索,收集及整理;李晨曦:分析并解釋相關內容,文章修回、審閱;龔忠誠:研究設計,監督指導,文章審閱,獲取研究經費。)