姜黃素對急性缺血性腦卒中小鼠MCP-1和CCR2水平的影響

張 鑫, 薛 慧, 孟天予, 耿尚勇, 鄭雅楠, 趙吉利, 杜文倩

急性缺血性卒中(acute ischemic stroke,AIS)的發病率逐年增加[1],AIS常導致腦組織壞死及局灶性神經功能損傷,因此致殘甚至死亡。盡管近年來對AIS的病理生理機制的研究取得重大進展,但仍缺乏改善AIS預后的有效治療藥物。炎性損傷是AIS的發病機制中重要的因素,其過度的表達可以促使AIS損傷進一步惡化和發展。其中,小膠質細胞激活是大腦炎癥反應的第一步[2],在神經元存活或損傷的調節中具有重要影響[3,4]。單核細胞趨化蛋白-1(monocyte chemoattractant protein-1,MCP-1)是其中至關重要的趨化因子,其主要由上皮細胞、小膠質細胞等產生,并通過與7個跨膜G蛋白偶聯受體 C-C 趨化因子受體 2 (C-C Chemokine Receptor 2,CCR2)結合并激活,向這些靶細胞類型發出信號而產生生物學效應,使其在各種疾病的損傷和感染部位指導單核細胞、小膠質細胞等的遷移和浸潤[5]。

姜黃素(curcumin,CUR)是一種從姜黃的植物根莖中提取出來的多酚化合物,因其具有的生物活性繁多,包括抗炎、抗氧化、免疫調節等而飽受關注[6～8]。有研究表明,在dss誘導的結腸炎中,姜黃素抑制dss刺激的巨噬細胞中NLRP3炎癥小體的激活,并顯著降低了MCP-1及IL-1β、IL-6的表達以及組織病理學損傷,顯著改善結腸炎的癥狀[9]。Sun等[10]的研究發現姜黃素可能通過失活AXL/JAK2/STAT3信號通路抑制小膠質細胞介導的炎癥反應,從而改善自身免疫性腦脊髓炎小鼠的癥狀及嚴重程度。因此,我們猜想姜黃素是否在AIS模型中通過對MCP-1/CCR2的抑制發揮神經保護作用,故通過建立AIS模型進行研究。

1 材料與方法

1.1 實驗動物 健康雄性8～10周齡的C57/BL/6小鼠,體質量18～23 g,購自內蒙古大學動物研究中心,小鼠飼養于室內12 h明暗交替,室溫18～23 ℃,標準鼠飼料喂養,自由進食水。

1.2 實驗試劑和儀器 超凈臺(山東博科);Western blot電泳轉膜儀器系統(Bio-rad);超聲勻漿器(天根);電子天平(奧豪斯);超低溫冰箱(松下);電熱恒溫鼓風干燥箱(上海博訊);恒溫水浴鍋(上海博訊);低溫離心機(艾本德);酶標儀(賽默飛);恒溫振蕩器(上海世平);轉棒疲勞儀(YLS-4C);電凝器(浩航);解剖顯微鏡(JSZ6-05047272);激光掃描共聚焦顯微鏡(OLYMPUS FLUOVIEW FV3000)。

姜黃素(購于美國Sigma-Aldrich公司),分子式C21H20O6,純度大于94%;二甲基亞砜(dimethyl sulfoxide,DMSO)(北京索萊寶科技有限公司);兔MCP-1多克隆抗體(美國Abcom公司);兔CCR2多克隆抗體(英國Biorbyt公司);鼠抗甘油醛-3-磷酸脫氫酶(glyceraldehyde-3-phosphate,GAPDH)多克隆抗體(美國Proteintech公司);Elisa試劑盒(江蘇酶免實業有限公司)。

1.3 實驗方法

1.3.1 實驗分組 雄性C57BL/6小鼠隨機分為3組,即假手術組(Sham組)、溶劑對照組(dMCAO組)、姜黃素組(CUR組)。假手術組僅分離頸總動脈且不灼燒大腦中動脈分支;CUR組于術后連續7 d給予姜黃素[200 mg/(kg·d)]腹腔注射;對照組腹腔注射等體積DMSO。

1.3.2 構建dMCAO模型 根據電凝法制作dMCAO動物模型[11],水合氯醛(30 mg/kg)腹腔注射麻醉,腹部朝上固定小鼠。頸部去毛后消毒,于正中部位切開一約1.0 cm切口,將左側頸總動脈小心仔細的分離,盡量避免出血,并用絲線永久性結扎,縫合頸部切口。然后,將小鼠變化體位,用膠布右側臥位固定,在耳屏與左側外眥之間切開皮膚,暴露顳肌,在顯微鏡下用眼科剪將顳肌剪開,顱骨下隱約能看到右側大腦中動脈皮質的分支,使用超聲顱錐將顱骨鉆開一小洞,直徑1 mm 左右,完整暴露大腦中動脈皮質分支,隨后用電凝筆燒灼血管。

1.3.3 Longa評分 動物模型建立成功后,各組小鼠分別在術后 3 d和 7 d采用改良的Longa 分級法進行行為學評分:0分,無缺陷;1級,不能伸展對側前肢;2分,對側前肢屈曲;3分,輕度向對側轉圈;4分,嚴重向對側轉圈;5分,向對側跌倒。

1.3.4 轉棒實驗(rota-rod)評價肢體功能 Rotarod 測試用于評估感覺運動的平衡和協調能力[12]。正式實驗開始前將小鼠置于固定速度為4 r/min 的轉棒上訓練跑輪,以15 min的間隔對小鼠進行連續3 d的訓練,每天3次,選擇能夠保留在轉棒上至少60 s的小鼠。正式實驗在 dMCAO 手術前1 d開始,將小鼠放置在加速的跑輪儀上,使小鼠在 300 s 的時間內以 4 r/min 到 40 r/min 的旋轉速度加速運動。由另一研究者記錄每只小鼠從開始試驗到從機器上掉落下來的持續時間。將此次轉棒持續時間作為AIS前基線水平(baseline)。在 dMCAO 之后的3 d、7 d重復進行 Rotarod 測試,每個測試日以 15 min的間隔對小鼠進行 3 次試驗,將3次數據的平均值作為當天的平均轉棒持續時間。

1.3.5 2,3,5-氯化三苯基四氮唑(2,3,5-triphenyltetrazolium chloride,TTC)染色法 dMCAO術后7 d,將各組小鼠麻醉后行斷頭處死,迅速取腦,去除額極,置入-80 ℃冰箱冷凍6 min后取出,連續等距、均勻切取5個冠狀腦片,厚度約2.0 mm,置于2%TTC溶液中進行染色,37 ℃恒溫孵育15 min。染色后棄去TTC,加入4%多聚甲醛固定24 h。染色后顯示為紅色區域為正常腦組織,白色區域則為梗死部分腦組織。數碼相機拍照,用Image J軟件進行圖像分析,計算梗死體積:總梗死體積=總梗死面積×腦片的厚度。計算梗死體積百分比:梗死體積百分比(%)=梗死體積百分比(%)={[總梗死體積-(梗死側半球體積-梗死對側半球體積)]/梗死對側半球體積}×100%。

1.3.6 Western blot蛋白質免疫印跡實驗 dMCAO術后7 d,假手術組、溶劑對照組及CUR組取AIS核心周圍的皮質腦組織,采用BCA蛋白定量法檢測蛋白濃度。Western blot方法測定MCP-1、CCR2蛋白表達水平。

1.3.7 免疫熒光實驗 dMCAO術后7 d,免疫熒光檢測MCP-1/CCR2和IBA1表達:使用多聚甲醛固定腦組織,經蔗糖梯度脫水后經冰凍切片機切成18 μm切片,浸泡在PBS溶液中,用0.3%Triton-PBS室溫搖床上漂洗3次,10 min/次;10%山羊血清封閉常溫搖床60 min,一抗上孵育過夜,第2天再用0.3%Triton-PBS室溫搖床上漂洗3次,10 min/次,避光孵育二抗,室溫搖床60 min,后繼續避光用0.3%Triton-PBS漂洗3次,將切片撈出平鋪在載玻片上,用DAPI染色固定細胞核后封片,4 ℃避光保存,后續在熒光顯微鏡400倍視野下采集圖片使用Image J軟件檢測。

1.3.8 Elisa dMCAO術后7 d,假手術組、溶劑對照組及CUR組取AIS核心周圍的皮質腦組織,采用Elisa法檢測IL1β、IL-6、TNF-α表達水平。

2 結 果

2.1 改良Longa評分 在小鼠清醒時采用 Zea-Longa方法進行神經行為學評分。dMCAO組與Sham組相比較,dMCAO組神經行為學評分顯著升高(P<0.05)。CUR組與神經行為學組相比較,CUR組神經功能缺損評分有明顯下降(P<0.05)(見圖1)。

圖1 小鼠改良Longa評分統計圖

2.2 轉棒實驗 術前,小鼠在滾輪上的時間無顯著差異。術后7 d,與dMCAO組小鼠相比,CUR組小鼠在滾輪上停留的時間均顯著提高,dMCAO組為66.13 s±23.62 s,CUR組為90.87 s±15.16 s(P<0.05)(見圖2)。

圖2 小鼠轉棒實驗統計圖

2.3 小鼠腦組織TTC染色(見圖3) 采用TTC染色小鼠腦組織,并統計梗死體積。CUR組小鼠腦組織梗死體積比(33.91%±3.55%)小于dMCAO組(P<0.05)。

圖3 小鼠腦組織TTC染色圖、AIS體積比統計圖

2.4 Western blot中MCP-1及CCR2表達表達水平的改變(見圖4、圖5) 與Sham組比較,dMCAO組的MCP-1及CCR2蛋白的表達均明顯升高,差異有統計學意義(P<0.05);dMCAO組和CUR組比較,CUR組中 MCP-1及CCR2蛋白的表達均有明顯降低,差異有統計學意義(P<0.05)。

圖4 MCP-1蛋白表達及統計圖

圖5 CCR2蛋白表達及統計圖

2.5 小鼠腦組織免疫熒光中MCP-1表達水平(見圖6) dMCAO組的小膠質細胞及MCP-1蛋白的表達與Sham組相比,均明顯升高,差異有統計學意義(P<0.05);dMCAO組和CUR組比較,CUR組中小膠質細胞及MCP-1蛋白的表達均有明顯降低,差異有統計學意義(P<0.05)。

圖6 MCP-1及IBA1表達圖

2.6 炎癥因子TNF-α、IL-1β、IL-6表達水平改變 dMCAO組的TNF-α、IL-1β、IL-6表達與Sham組相比,均明顯升高,差異有統計學意義(P<0.05);dMCAO組和CUR組比較,CUR組中TNF-α、IL-1β、IL-6的表達均有明顯降低,差異有統計學意義(P<0.05)(見表1)。

表1 TNF-α、IL-1β、IL-6表達水平

3 討 論

AIS是指由可由數種病因導致的一種腦血管疾病,具有發病率高、致殘率高等特點,嚴重危及患者的健康和生命,是世界第二大死因。AIS導致腦血管急性阻塞和血供中斷,從而引起局部腦組織缺血、缺氧性壞死,進而出現神經功能障礙產生一系列臨床綜合征,嚴重影響患者生活質量[13,14]。

小膠質細胞是中樞神經系統的巨噬細胞,對腦損傷和疾病極其敏感,在維持中樞神經系統穩態中起著重要作用[15]。小膠質細胞在AIS后被激活,并在缺血再灌注損傷產生的炎癥反應中發揮主導作用[16],活化的小膠質細胞可產生包括炎癥因子(如TNF-α)、一氧化氮(nitricoxide,NO)等在內的多種促炎介質等對腦組織進行產生作用[17]。

單核細胞趨化蛋白-1 (MCP-1/CCL2)是調控單核細胞和小膠質細胞招募和激活的關鍵趨化因子之一,可以與多種受體結合,但主要通過附著在CCR2的細胞外區域來加強其生物學效應,它們在各種疾病的損傷和感染部位指導單核細胞、小膠質細胞、記憶性T淋巴細胞的遷移和浸潤[18]。MCP-1具有促使黏附分子表達的作用,影響受損部分腦組織血供,使腦組織損傷更加嚴重。MCP-1水平升高與卒中遠期風險增加相關[19]。因此,阻斷MCP-1/CCR2通路可作為治療AIS后炎癥損傷的一種重要策略。本研究表明,姜黃素顯著抑制AIS后MCP-1/CCR2的產生及釋放。這些說明姜黃素可能對缺血后的炎癥反應具有重要的抑制作用。

姜黃素作為一種抗炎劑,在多種疾病模型中發揮著積極的作用。有研究表明[20],在膠原誘導關節炎小鼠模型中,聯合姜黃素和富含維生素D3和Omage3脂肪酸(VO)的飲食顯著增強了TNF,IFN-γ和MCP-1的抑制,使疾病嚴重程度降低80%,并最大限度地延遲疾病的發生和進展。Kar等研究者發現[21],姜黃素和LOXblock-1通過抑制semaphorin-plexin通路減輕炎癥過程,改善缺血-再灌注誘導的炎癥和急性腎損傷,明顯觀察到炎癥因子,如TNF-α、IL-6和MCP-1的顯著降低。除此之外,有報道顯示[22],姜黃素在結直腸癌中也發揮重要作用,研究者使用apc突變小鼠(家族性腺瘤性息肉病模型)來評估姜黃素的效果,使用500 ppm的姜黃素處理8周可以抑制腸息肉的發展,并抑制有息肉的腸部分MCP-1和IL-6 mRNA的表達水平。研究者Boarescudeng等[23]評估姜黃素納米顆粒(CCNP)與傳統姜黃素(CC)對異丙腎上腺素(ISO)誘導的大鼠心肌梗死(MI)的影響,研究發現所有劑量的CC和CCNP均可發揮心肌保護作用,其中CCNP的效果最好,且CCNP能更有效地抑制心肌梗死后炎性細胞因子(TNF-α、IL-6、IL-1α、IL-1 β、MCP-1和RANTES)水平的升高,有助于限制心肌梗死后的心臟損傷。因此,我們檢測了姜黃素在AIS相關dMCAO小鼠模型中對梗死部分腦組織所產生炎癥發生的治療作用。我們的研究結果表明:(1)姜黃素降低AIS小鼠的神經功能缺損評分,增加腦血流灌注,減小腦梗死體積;(2)這些功能的改善與小膠質細胞的活化的減少,MCP-1/CCR2及炎癥因子TNF-α、IL-1β、IL-6表達的水平降低有關。

綜上所述,本結果顯示了姜黃素對AIS的保護作用。在AIS模型中,姜黃素對AIS腦組織損傷的保護作用可能是通過降低小膠質細胞活化至減低MCP-1/CCR2的表達,下調炎癥因子的水平實現的,本實驗的數據也表明,姜黃素可能是一種治療急性缺血性卒中的有效藥物,但是我們的研究有一定的局限性,雖然已經提出一些數據表明姜黃素的療效,還需要更多的劑量反應的詳細研究,以及姜黃素是否通過其它途徑起到腦保護作用,還需進一步研究。