飼糧能氮比對簡州大耳羊糞便排泄參數及微生物區系的影響

付敏，陳天寶，歐陽佚亭，賴靖雯，陳敏，曾洪良

（四川省畜牧科學研究院，動物遺傳育種四川省重點實驗室，成都 610000）

肉羊養殖是我國畜禽養殖的重要組成部分，與1961 年相比，2021 年肉羊出欄量增長了34.4 倍，羊肉產量增長了46.7 倍，肉羊產業穩步增長[1]。然而，我國肉羊養殖也面臨著巨大的挑戰：一方面肉羊營養需要量標準不完善，導致生產上飼糧配方差異大，能量蛋白質不平衡，既浪費飼料資源，又造成環境氮污染。肉羊對養分的消化主要通過瘤胃微生物發酵，只有飼糧提供的能量和氮含量達到微生物需求平衡時，微生物才能達到最佳生長狀態，進而有利于養分的消化吸收，因此，飼糧適宜的能氮比是合理配制反芻動物飼糧的基礎[2]。研究表明，飼糧適宜的能氮比可以提高肉羊生產性能和養分消化率[3-5]；蛋白質水平過高導致的能氮不平衡問題，不僅會降低肉羊生產性能，還會增加氮的排泄[5-6]，糞便中氮含量與飼料蛋白質攝入量有很強的正相關關系[6-7]。李闖[2]、張繼偉等[4]、柴貴賓等[5]分別提出了不同飼養方式下本地羊適宜的飼糧能氮比，但由于肉羊的窄生態適應性，不同品種肉羊飼糧能氮比適宜值仍然需要根據品種特性和飼養方式進一步探索和研究。另一方面，隨著我國肉羊養殖數量增加和規模化程度提高，養殖污染問題日益突出，威脅到生態環境和人居安全，而且反芻動物對環境的影響是其他牲畜的3~10 倍[8]。畜禽糞便排泄參數不僅能反映畜禽營養健康狀況，更是開展畜禽糞污治理和資源化利用的基礎數據。國外對羊糞產排特性研究較早，美國農業工程師協會發布了羊的糞尿產生量及糞尿中污染物的含量[9]，而國內對肉羊糞便產排系數監測的重視度不高，研究較晚，楊碩等[10]研究了規模化羊場杜泊羊和小尾寒羊不同季節糞便主要成分含量差異，糞便產生量研究未見詳細報道。我國每10 年開展一次的污染普查，只針對生豬、牛、肉雞和蛋雞進行產排污系數原位監測，而缺少對羊的產排污監測，這給肉羊糞污治理及資源化利用帶來了盲目性。

簡州大耳羊是我國人工培育的肉用山羊新品種，生長快、肉質好，在南方地區廣泛飼養[11]。由于缺少針對性的飼養標準，生產上飼糧能氮比差異較大，這可能導致糞尿特性參數變化，不利于糞污減排和高效利用。因此，本試驗旨在探索全價顆粒飼糧不同能氮比（代謝能/總氮）對生長育肥期簡州大耳羊糞便排泄參數、氮排泄參數以及糞便微生物區系的影響，為簡州大耳羊的低碳高效養殖和糞便資源化利用提供科技支撐。

1 材料與方法

1.1 試驗設計

本研究采用單因子試驗設計，選擇32 只體質量為（26.16±2.39）kg 的健康簡州大耳羊，隨機分配到編號為a、b、c、d 的4 個試驗組，每組8 只羊（公母各4只），分別飼喂能氮比（ME/N）為0.59、0.51、0.43、0.35的全價顆粒飼糧，適應30 d后移入羊代謝籠開展12 d全收糞尿試驗（預飼7 d，正式5 d），測定試驗羊糞尿和氮排泄參數，然后在正式試驗第5 天收集試驗羊新鮮直腸糞便測定糞便微生物區系。試驗飼糧配方和能氮比設計參照課題組前期研究[3]，能氮比為飼糧代謝能濃度與總氮濃度比值，試驗飼糧組成及養分含量見表1。

表1 飼糧組成及養分含量（干物質基礎，%）Table 1 Composition and nutrient content of experimental diets（DM basis，%）

1.2 飼養管理

飼養試驗前對羊舍和用具全面清洗、晾干、消毒。飼養期間按照羊場管理規范進行疫病防控和飼養管理，自由飲水，自由采食。正式試驗期，對試驗羊空腹稱質量后移入羊代謝籠，單只單籠飼養，先預飼7 d以確保肉羊體況正常穩定，然后連續開展5 d 的全收糞尿試驗，準確稱量每只羊每日的采食量、糞便量和尿液量，記錄圈舍環境溫度、濕度和試驗羊健康狀況等。

1.3 樣品采集與處理

飼糧樣品：分別在飼糧加工完成的第1 天、適應期第15 天和正式試驗期每日采集每組飼料樣品200 g，測定干物質含量和總氮含量。

糞便樣品：正式期每日8：00在每只羊的代謝籠特定位置放置干凈帶蓋塑料桶，用于收集試驗羊每次全部糞便，于次日8：00稱取前1天糞便總量。糞便混勻后，采用四分法按照糞便總質量的20%采集糞便樣品2份測定干物質含量、pH和總氮含量，糞便樣品采集方法參照《畜禽糞便監測技術》（GB/T 25169—2022）。

尿液樣品：正式期每日8：00 將干凈的裝有15 mL 4.5 mol·L-1H2SO4的接尿桶（容量5 000 mL）放置于羊代謝籠底部固定位置，收集每只羊全部尿液，于次日8：00 計量前1 天尿液總量，尿液混勻后，調整pH≤3（記錄加酸量），并按照總質量的20%采集尿液樣品用于測定總氮和氨氮。所有樣品按照標準編號，4 ℃保存，送實驗室檢測。

糞便微生物樣品：在正式期第5 天，用無菌鑷子采集每頭試驗羊直腸末端新鮮無污染糞便，裝入5 mL凍存管，并做好標記，-80 ℃凍存。

1.4 樣品檢測方法及指標計算

1.4.1 肉羊糞便及氮排泄參數檢測與計算

飼料和糞便的干物質含量均參照《飼料分析及飼料質量檢測技術》[13]測定，糞便和尿液pH、總氮、氨氮參照NY/T 525—2021 測定。畜禽糞便的排泄量還與體質量呈顯著正相關關系[14]，為了降低體質量變化帶來的排泄量的差異，用單位代謝體質量糞便尿液（氮）排泄參數來衡量糞尿（氮）排泄量更具代表性。通過以下公式計算：

氮攝入量（g·d-1）=日采食干物質量（g·d-1）×飼糧氮含量（%）

日排糞氮（g·d-1）=日排糞便干物質量（g·d-1）×糞便總氮含量（%）

日排尿氮（g·d-1）=日排尿液質量（g·d-1）×尿液總氮含量（%）

日排總氮（g·d-1）=日排糞氮（g·d-1）+日排尿氮（g·d-1）

氮排泄率（%）=日排總氮（g·d-1）/日攝入氮量（g·d-1）×100%

單位代謝體質量糞便日排泄量（g·kg-0.75·d-1）=日排糞便干物質量（g·d-1）/羊活體質量0.75（kg0.75）

單位代謝體質量尿液日排泄量（g·kg-0.75·d-1）=日排尿液質量（g·d-1）/羊活體質量0.75（kg0.75）

單位代謝體質量糞氮日排泄量（g·kg-0.75·d-1）=日排糞氮（g·d-1）/羊活體質量0.75（kg0.75）

單位代謝體質量尿氮日排泄量（g·kg-0.75·d-1）=日排尿氮（g·d-1）/羊活體質量0.75（kg0.75）

1.4.2 肉羊糞便微生物菌群檢測

糞便細菌多樣性檢測由天津諾禾致源生物信息科技有限公司完成，DNA提取和16S rRNA PCR擴增、測序及數據分析法參照Griffith等[15]的方法。每個試驗組選擇8只羊的糞便樣品進行微生物菌群檢測，分析糞便微生物菌群多樣性，及在門和屬水平上的組成和相對豐度。

1.5 統計分析

利用SPSS 20.0 軟件One-way ANOVA 進行單因素方差分析，組間采用Duncan's 法進行多重比較，隨后對飼糧能氮比進行線性（Linear）和二次曲線（Quadratic）回歸分析。數據結果用平均值±標準差表示，P<0.05表示差異顯著，P>0.05表示差異不顯著。

2 結果與分析

2.1 不同能氮比全價顆粒飼糧對簡州大耳羊糞便排泄參數的影響

2.1.1 對糞便排泄參數的影響

如表2 所示，飼糧能氮比對試驗羊干物質采食量、糞便排泄量、尿液排泄量及單位代謝體質量糞便日排泄參數均無顯著影響（PA>0.05），4組試驗羊干物質采食量平均為1.21 kg·d-1，糞便、尿液排泄量平均為1.25 kg·d-1和0.70 kg·d-1，糞便含水率平均為62.32%，單位代謝體質量糞便和尿液日排泄量平均為29.49 g?kg-0.75·d-1和50.59 g?kg-0.75·d-1。隨著飼糧能氮比降低，糞便pH 呈線性增加（PL=0.004），且具有顯著的組間差異（PA=0.029）；單位代謝體質量尿液排泄量呈線性增加（PL=0.046），從47.35 g?kg-0.75·d-1增加到59.57 g?kg-0.75·d-1，增加了25.81%。

表2 不同試驗組簡州大耳羊糞便排泄參數Table 2 The fecal excretion parameters of Jianzhou Da′er goats in different groups

2.1.2 對氮排泄參數的影響

如表3 所示，不同能氮比飼糧對試驗羊糞氮、氮排泄率、單位代謝體質量糞氮日排泄參數無顯著影響（PA>0.05），糞氮日排泄量為7.26~8.23 g·d-1，氮排泄率為63.60%~68.55%。但是，隨著飼糧能氮比降低，氮的日攝入量、尿總氮排泄量、尿氨氮排泄量、日排總氮量、單位代謝體質量尿氮和單位代謝體質量總氮日排泄量均呈線性增加（PL<0.001），且具有顯著的組間差異（PA<0.05），相對于a 組，d 組分別增加了54.90%、152.03 %、605.66%、63.82%、147.50%、60.82%。

表3 不同試驗組簡州大耳羊氮排泄參數Table 3 The nitrogen excretion parameters of Jianzhou Da′er goats in different groups

2.2 不同能氮比全價顆粒飼糧對簡州大耳羊糞便微生物區系的影響

2.2.1 糞便樣品16S rRNA 基因測序結果

4 組糞便32 個樣本中共獲得1 616 790 條優質細菌16S rRNA 基因序列，每個樣本平均產生55 751.38條，序列平均長度為371.8 bp，有效標記（Effective Tags）中堿基質量值大于20（測序錯誤率小于1%）和30（測序錯誤率小于0.1%）的堿基所占的百分比分別為98.16%和94.30%。

2.2.2 OTUs分析和物種注釋

所有樣品共注釋了41 個門、74 個綱、163 個目、234個科、419個屬和146個種。如圖1所示，4個組共聚類得到2 538 個OTU，a、b、c、d 組OTU 數分別為1 665、1 627、1 663、1 855 個，共用1 170 個OTU，占OTU總數的46.10%，獨有的OTU數分別為75、81、57、430 個，占OTU 總數的比例分別為2.96%、3.19%、2.25%、16.94%，表明a、b、c 組相似度較高，差異較小，d組與其他3組差異較大。

圖1 不同試驗組糞便微生物Venn圖Figure 1 The venn diagram of fecal microorganisms in different groups

2.2.3 菌群α多樣性分析

由表4 可知，4 個組的覆蓋度均大于0.99，能準確地反映試驗羊糞便中細菌的組成。a、b、c組α多樣性差異不顯著，但隨著能氮比降低，Shannon 指數和Simpson指數均呈顯著下降趨勢（PL<0.05，PQ<0.05），d組的Simpson 指數顯著低于a、b 組和c 組（PA<0.05），Shannon指數顯著低于b組（PA<0.05）。

表4 不同試驗組簡州大耳羊菌群多樣性指數Table 4 The microbial diversity index of Jianzhou Da′er goats in different groups

2.2.4 菌群β多樣性分析

主成分分析（PCA）如圖2 所示，主成分1 和主成分2 的貢獻值分別為13.15%和7.98%，a、b、c 3 組樣本差異較小，微生物群落結構相似度較高，而d 組與其他3組距離較遠，差異較大。

圖2 糞便微生物主成分分析Figure 2 The principal component analysis（PCA）of fecal microorganisms

2.2.5 糞便菌群在門和屬水平上的組成與相對豐度

如表5所示，在門水平上厚壁菌門（Firmicutes）和擬桿菌門（Bacteroidota）是優勢菌門，兩個菌門占總細菌種類的80%左右。隨著飼糧能氮比降低，厚壁菌門的相對豐度先增加后降低（PQ=0.007），c組最高，但與a、b 組差異不顯著，d 組顯著低于前3 組（PA=0.003）；疣微菌門（Verrucomicrobiota）和放線菌門（Ac?tinobacteriota）相對豐度呈線性升高（PL<0.05），且d 組顯著高于前3組（PA<0.05）；其他菌群相對豐度沒有受到顯著影響（P>0.05）。

表5 糞便微生物門水平的相對豐度（%）Table 5 The relative abundance of fecal microflora at phylum level（%）

如表6 所示，在屬水平上，擬桿菌屬（Bacteroi?des）、瘤胃球菌科（UCG-005）、另枝菌屬（Alistipes）、理研菌科RC9（Rikenellaceae_RC9）、克里斯滕森菌科R7（Christensenellaceae_R-7）、普雷沃氏菌屬（UCG-002）和艾克曼菌屬（Akkermansia）等是各組糞便優勢菌屬。隨著飼糧能氮比降低，艾克曼菌屬（PL=0.002）和擬桿菌屬（PL=0.021）的相對豐度呈線性增加，而且d組艾克曼菌屬相對豐度顯著高于前3組（PA=0.007）。毛螺菌科（Lachnospiraceae_AC2044_group）的相對豐度先增加后降低，呈顯著的二次曲線關系（PQ=0.042）。

表6 糞便微生物屬水平相對豐度（%）Table 6 The relative abundance of fecal microflora at genus level（%）

3 討論

3.1 不同能氮比全價顆粒飼糧對簡州大耳羊糞便及氮排泄的影響

與豬和雞的糞便相比，肉羊糞便呈顆粒狀，具有含水率較低及適宜的碳氮比等特點[16-17]，在糞肥還田利用中深受種植業主的喜愛，但由于缺少糞便排泄相關參數指導，糞肥資源化利用效率受到限制。因此，本研究獲取了飼糧不同能氮比條件下簡州大耳羊的糞便排泄參數，并探索其影響規律和機理。我國肉羊糞便排泄參數相關研究報道較少，李丹陽等[18]研究報道半放牧半舍飼貴州半細毛羊的糞便量、尿液量分別為0.97 kg·d-1·只-1和0.53 L·d-1·只-1，全舍飼湖羊分別為0.99 kg·d-1·只-1和0.56 L·d-1·只-1，略低于本研究結果。宋大利等[19]報道的羊糞便排泄量（1.9 kg·d-1）高于本研究，尿液排泄量（0.6 kg·d-1）略低于本研究。分析原因主要是因為測試羊的品種、飼養方式、飼糧形態都具有較大的差異。本研究結果表明全價顆粒飼糧能氮比對試驗羊干物質采食量、糞便和尿液排泄量均無顯著影響，原因是肉羊干物質采食量與飼糧原料組成、形態、能量和纖維含量顯著相關[20]，本試驗中飼糧原料組成、形態以及能量和纖維水平一致，因此4組試驗羊干物質采食量無顯著差異，而干物質采食量顯著影響糞便排泄量[21-22]，因此，糞尿排泄量也無顯著差異，這與前人研究結果一致。糞便pH 不僅能反映腸道內環境，而且是影響氨氣揮發的關鍵因素，一般呈中性或者弱堿性，pH 升高將增加氮的損失[23]。目前未見關于肉羊糞便pH 的報道，但有研究顯示生豬 糞 便pH 為6.42~7.64[24]，肉 雞 糞 便pH 為6.15~8.17[25]，肉牛糞便pH 為6.42~6.9[26]，均低于本研究結果。生豬和肉雞均采用全價精飼糧飼喂，而肉牛采用全混合日糧飼喂，精飼糧的占比較低，因此生豬和肉雞糞便pH 較肉牛更高，而本研究采用全價顆粒飼糧飼喂，且營養濃度按照肉羊飼養標準的最高生產性能（日增質量200 g）進行配方，營養密度較大，導致糞便中未消化的堿性物質含量較高，而且飼糧能氮比降低，增加了飼糧氮的攝入，導致后腸含氮堿性物質增加，進而造成糞便pH增加。

本研究結果表明，飼糧能氮比降低顯著增加了尿氮的排泄，且呈現了顯著的線性相關性，但對糞氮排泄量沒有顯著影響。這與牛驍麟等[27]用蛋白水平分別為11.5%、14.0%和16.5%的飼糧飼喂32.25 kg左右湖羊的研究結果一致，同時，樊艷華等[28]和Marini等[29]也得出了相似的試驗結果。糞氮排泄量差異不顯著是由于糞氮主要來源于未消化的日糧氮、未被消化的微生物氮和內源氮，排泄量一般比較穩定[30]；尿氮排泄與反芻動物特殊的消化功能有關，研究表明，反芻動物飼糧中的大部分養分在瘤胃被分解消化，飼糧蛋白質被分解為肽、氨基酸和氨，一部分氨被瘤胃微生物利用合成微生物蛋白，另一部分則被瘤胃壁或后腸吸收，通過血液循環經門靜脈進入動物肝臟轉化為尿素，其中一部分被尿液排出體外，當蛋白質不足時，部分尿素重新進入血液循環到達唾液腺，隨唾液重新進入瘤胃[2]。因此，隨著能氮比降低，飼糧氮濃度升高，多余的氮以尿素的形式通過尿液排出體外，導致尿液中的氮排泄量增加，而當尿液中尿素排出體外遇到糞便尿素酶時會轉化為氨，導致尿總氮和氨氮的量顯著增加。而尿氨氮容易揮發，且具有刺激性氣味，尿氨氮排泄量的增加不但增加了氮的損失，還會導致圈舍內NH3的濃度增加，影響動物健康。

3.2 不同能氮比全價顆粒飼糧對簡州大耳羊糞便微生物區系的影響

16S rRNA 高通量測序技術可以很好地揭示肉羊糞便微生物多樣性。Shannon 指數和Simpson 指數可反映菌群的多樣性，d 組的Simpson 指數最低，說明糞便菌群的多樣性和均勻度低于前3組，這與PCA 結果一致。本研究發現，擬桿菌門和厚壁菌門為試驗羊主要優勢菌門，這與魏子維等[31]對雷州山羊及潘鋒等[32]對肉牛糞便微生物的研究結果一致。本研究結果顯示，隨著飼糧能氮比降低，d 組的厚壁菌門相對豐度顯著降低。研究表明，厚壁菌門主要與碳水化合物和蛋白質的吸收有關[33]，厚壁菌門相對豐度越高，可能越有利于飼糧蛋白質的消化吸收，其相對豐度降低不利于蛋白質的消化吸收。付敏等[3]的研究表明在飼糧能氮比為0.43 時，簡州大耳羊生長性能最佳，能氮比為0.35 時，生長性能下降。因此，飼糧能氮比可能會通過影響肉羊后腸菌群的相對豐度，進而影響生長性能。與此同時，本試驗結果顯示，當飼糧能氮比為0.35 時，疣微菌門和放線菌門的相對豐度顯著增加，而疣微菌門具有誘導和調節免疫的能力[34]，放線菌主要通過產生多種抗生素消滅致病菌群來保護宿主，部分放線菌還能分泌蛋白酶等幫助宿主消化分解飼糧營養物質[35]，由此推斷，在能氮比降低到0.35時，肉羊后腸可能存在潛在的健康問題，誘導了機體產生免疫反應，同時分泌抗生素抵抗致病菌。研究表明，擬桿菌屬能產生纖維素酶，提高動物對飼糧的消化吸收[36]，在屬水平上，本研究最主要的優勢菌是擬桿菌屬，說明后腸仍然具有較多的待消化養分，需要微生物分泌更多酶幫助消化。本試驗中，飼糧能氮比降為0.35 時，艾克曼菌屬的相對豐度顯著提高，研究認為艾克曼菌可以改善腸道屏障功能、增厚黏膜層，其數量的增加有助于緩解炎癥性腸病癥狀[37]，因此，飼糧能氮比過低可能增加了后腸的消化負擔，可能導致后腸黏膜炎癥。

4 結論

（1）飼糧能氮比對試驗羊糞便和尿液排泄參數無顯著影響。

（2）隨著飼糧能氮比降低，糞便pH和尿氮排泄量顯著提高。

（3）飼糧能氮比降低到0.35 時，糞便菌群的多樣性和相對豐度受到顯著影響，糞便菌群的結構發生改變，不利于動物對養分消化吸收，進而影響動物腸道健康。