三葉青的生藥學研究※

●李振斌 （黔西南民族職業技術學院 貴州 興義 562400）

三葉青學名三葉崖爬藤（Tetrastigma hemsleyanumDielsetGilg），為葡萄科崖爬藤屬植物，為民族民間常用中草藥，主要分布于貴州、浙江、廣西、福建等地，全草具有清熱解毒、活血祛風等功效，可用于治療流行性感冒、肝炎、泌尿系統結石等[1-3]，素有“植物抗生素”等美譽。隨著其藥用價值的不斷開發，金奇片、金絲地甲膠囊等中成藥問世，進一步促進三葉青產業發展。目前，以浙江、福建、湖南、廣西產三葉青研究居多，對貴州產三葉青研究甚少，特別是黔喀斯特地區，因地形地貌獨特，植物特征鮮明，缺乏該地區三葉青的基礎研究，且尚存在產地把狹葉三葉青及其同屬植物混作三葉青栽培，缺少質量評價研究，影響本品的合理使用。鑒于此，本試驗開展三葉青生藥學研究，以期為三葉青的準確應用和深入開發提供科學依據，為質量標準的制定提供參考。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

樣品自采，共9批，其中3批栽培，6批野生，詳見表1。經貴州黔西南喀斯特區域發展研究院鄧朝義研究員鑒定為三葉崖爬藤的全株。

表1 樣品來源

槲皮素（對照品）購于中國食品藥品檢定研究院國家藥品標準物質網，批號：100081-201610。

1.2 儀器

EX30生物顯微鏡（寧波舜宇儀器公司）；FA224分析天平（ 萬分之一，上海舜宇恒平科學儀器）；KS-5200DB超聲波清洗機（昆山潔力美超聲儀器有限公司）。

1.3 試驗方法

1.3.1 鑒別 對不同產地三葉青進行地理標記，以物候期為指向，定點觀察其植物特征，記錄植株特點；對收集的藥材進行干燥，觀察描述藥材不同部位性狀特點，并對其進行粉碎，通過制片顯微鏡觀察藥材的粉末顯微特征。

1.3.2 薄層色譜 取干燥的三葉青全草粉末10 g，稀乙醇250 mL回流提取2 h，冷卻過濾并蒸干，用適量水混懸，乙酸乙酯萃取3次，每次 100 mL，合并乙酸乙酯層，濃縮至約5 mL，得供試品溶液。取槲皮素對照品適量，加無水甲醇溶解，制得1 mg/mL對照品溶液。照中國藥典薄層色譜法（通則0502）試驗[4]，分別吸取上述溶液各10 μL，分別點于同一硅膠G薄層板上。以石油醚∶乙酸乙酯∶甲酸（9∶4∶1）為展開劑，展開，取出晾干后噴以1%AlCl3乙醇溶液，于紫外燈（365 nm）下檢視。

1.3.3 水分、總灰分、酸不溶性灰分、浸出物測定 水分按照《中國藥典》2020年版四部通則0832水分測定法（第二法 烘干法）[5]測定；總灰分、酸不溶性灰分按照《中國藥典》2020年版四部通則2302灰分測定法測定。

浸出物測定按《中國藥典》2020年版四部通則2201浸出物測定法，分別用60%乙醇、水作溶劑，以冷浸法、熱浸法篩選確定理想的溶劑和提取方法。

1.4 數據處理及分析

涉及數據用SPSS 24.0與Excel2010軟件統計數據，并進行組別的差異性分析。P＜0.05表示差異顯著，每組試驗重復3次。

2 結果與分析

2.1 原植物鑒別

草質藤本。常分枝，匍匐或攀沿，具5縱棱，無毛或被疏柔毛。卷須不分枝，與葉對生。復葉有3小葉，小葉披針形、長橢圓披針形，長5～9 cm，寬1.7～3.5 cm，頂端漸尖，基部略楔形，側生小葉基部不對稱，邊緣每側有4～8個鋸齒，上表面綠色，下表面略淺，無毛；側脈5～6對，網脈不明顯；葉柄長4～7 cm，中央小葉柄長0.5～1.8 cm，側生小葉柄長0.2～0.4 cm，無毛或被疏柔毛。花序腋生，下部有節，節上有苞片，二級分枝集生成傘形，花二歧狀著生在分枝末端；花序梗被短柔毛，長1～2.5 mm；花蕾卵圓形，萼碟形，萼齒細小，卵狀三角形；花瓣4，卵圓形，無毛；雄蕊4，花藥黃色；子房陷在花盤中，柱頭4裂。果實近球形或倒卵球形（青色，橙紅色，后為烏黑色），直徑0.4～0.6 cm，有種子1顆。花期5～7月，果期8～11月。對比發現，栽培品與野生品原植物特征無明顯區別。

2.2 性狀鑒別

2.2.1 野生品 塊根類圓球形、紡錘形或不規則塊狀，長1～7 cm，直徑 0.5～4 cm；表面棕褐色或灰褐色，稍皺縮，具類網狀紋理，偶見皮孔狀凸起，殘留棕褐色細根或根莖；質地硬而脆，斷面略平坦，粉性，類白色或淺棕紅色。莖五棱形，表面暗棕褐色或黃綠色；可見節，稍膨大；質脆，斷面纖維性。葉皺縮，多破碎，完整葉片展平后為三出掌狀復葉；上表面黃綠色或暗綠色，下表面色稍淺，無毛。氣微，味微甜。

2.2.2 栽培品 塊根橢圓形、紡錘形、長條形，長2～8 cm，直徑0.6～3.5 cm，偶見類網狀紋理，質地稍硬，斷面略平坦，富粉性。莖特點與野生品無顯著區別。葉片顏色較野生品偏黃，為黃綠色或黃褐色，完整葉片亦較野生品多。

2.3 顯微鑒別

粉末灰棕色或灰褐色。淀粉粒橢圓形、類圓形或紡錘形等，多單粒，直徑9～45 μm。網紋細胞較多，壁稍厚，黃棕色或黃色，直徑121～189 μm。草酸鈣針晶散在或成束存在于紡錘形黏液細胞內，長36～129 μm。草酸鈣簇晶散在或排列成行，直徑10～74 μm。可見角質層組織。螺紋導管多見，孔紋導管直徑42～98 μm，纖維長梭形，壁厚，胞腔狹小。葉片下表皮細胞多角形，氣孔為平軸式或不定式。栽培品與野生品粉末特征無明顯區別。見圖1。

圖1 三葉青全草粉末顯微特征圖（10×40）

2.4 薄層色譜鑒別 從圖譜可見，1～9號樣品與對照品在相同位置均有斑點顯示，但呈不同顏色斑點，說明各樣品中可均含槲皮素，但還夾雜其他成分，該方法需要再次優化升級，方可達到有相同和清晰斑點呈現。見圖2。

圖2 三葉青藥材薄層色譜圖

2.5 水分、總灰分及酸不溶性灰分測定結果

2.5.1 水分 9批三葉青藥材中水分含量范圍為8.86%～11.15%。由表2可知，野生品因產地不同，水分含量變化較為明顯，以貴陽產藥材水分含量較高，安順產藥材含量較低，但各地栽培品藥材水分含量變化差異不明顯。

表2 三葉青藥材水分、總灰分、酸不溶性灰分、浸出物含量測定結果 單位：%

2.5.2 總灰分、酸不溶性灰分 9批三葉青藥材中總灰分含量范圍為6.91%～9.76%，野生品以六盤水和貴陽產藥材較高，栽培品各產地藥材無顯著差異。酸不溶性灰分含量范圍為0.75%～1.49%，野生品同一地區不同批次間存在顯著差異，不同地區間亦存在顯著差異；栽培品各產地藥材變化較小，相對穩定。

2.6 浸出物測定

2.6.1 提取方法考察 通過對不同溶劑和不同提取方法進行試驗發現，溶劑以60%乙醇提取效率較高，用冷浸法提取為宜（表3）。

表3 三葉青藥材不同提取方法浸出物測定結果（n = 3）

2.6.2 樣品浸出物含量 9批三葉青藥材（全草）浸出物含量范圍為12.17%～13.58%。各產地的樣品浸出物含量差異不顯著，同一產地不同批次間差異亦不顯著，其中以栽培品浸出物含量相對較高（表4）。

表4 9批三葉青藥材浸出物測定結果（n = 3）

3 討論

本研究對黔喀斯特地區三葉青經過長期觀察對比發現，其特征與《中國植物志》[6]和劉培剛等[7]等對三葉青原植物描述，形態特征基本一致，但葉片較之略寬長，花期稍有后移，且莖有較明顯五縱棱紋。藥材塊根部稍大，表面網狀紋較清晰；莖可見五縱棱，暗棕褐色或黃綠色，節稍大，斷面纖維性，葉皺縮，多破碎，黃綠色或暗綠色，下表面色稍淺，《湖南省中藥材標準（2009年版）》《浙江省中藥材質量標準（2017年版）》（下稱“湖標”“浙標”）中未見描述。栽培品較野生品偏長橢圓狀，稍光滑，莖無顯著區別，葉片顏色偏黃。在粉末特征方面，本研究對象為全草（含塊根），淀粉粒、草酸鈣針晶和簇晶與“浙標”和崔偉亮等[8]描述一致，但未對網紋細胞進行描述。此外，全草粉末中可見角質層組織，螺紋導管、孔紋導管，纖維束、平軸式或不定式氣孔等。

參照李鶴[4]、崔偉亮等[8]薄層鑒別法，以稀乙醇為溶劑制備供試品和槲皮素作對照展開發現，三葉青全草在相同的位置出現相同斑點，但斑點顏色與對照不一致，經過增加萃取次數、活性炭吸附處理欲排除色素干擾，但斑點顏色并未呈現相同顏色，說明對于三葉青全草需要進一步探索合適的提取方法和展開系統，但樣品與對照品在相同的位置有斑點出現，側面印證了前者研究結果。

4 結論

喀斯特地區三葉青栽培品與野生品植物外觀形態上區別較小，藥材形態差異為塊根偏長橢圓狀，稍光滑，莖五棱狀特征清晰，葉片顏色偏黃，破壞率相對較低；全草粉末中均可見角質層組織，螺紋導管、孔紋導管，纖維束、平軸式或不定式氣孔等；水分、總灰分、酸不溶性灰分含量，因產地和環境差異而表現出不同程度的差異，但從數據分析，較野生品穩定，變化幅度小；栽培品浸出物含量較野生品高。綜合分析，喀斯特地區三葉青馴化栽培品生物特性相對突出，標示性較強，水分、總灰分、酸不溶性灰分、浸出物含量等生理指標較具優勢，在三葉青資源開發及產業化發展中可作為有效路徑進行探索，栽培替代野生品，亦可對野生三葉青資源進行保護。同時可補充黔產三葉青理論依據，為其質量標準的制定提供參考。