C646靶向KAT3b通過Survivin乙酰化調(diào)控食管癌侵襲和遷移

鄭競雄 楊 陽 孫光蕊 邢 磊 白宇航 梁宗英

食管癌是最具侵襲性的胃腸道癌癥之一,極大危害了我國人民的身體健康[1]。雖然手術(shù)切除、化療及放療等治療手段在一定程度上改善了食管癌患者的預(yù)后,但其總體生存率和生活質(zhì)量仍較差[2]。Survivin是一種進化保守的真核生物蛋白,對細胞分裂至關(guān)重要,可抑制細胞死亡[3]。正常情況下,它只在增殖活躍的細胞中表達,但在大多數(shù)腫瘤中表達上調(diào),參與腫瘤的增殖、凋亡、侵襲及轉(zhuǎn)移[4,5]。前期研究顯示,在食管癌組織及轉(zhuǎn)移淋巴結(jié)中Survivin呈高表達并發(fā)生了乙酰化,且其高乙酰化水平與食管癌分期、組織分化及淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移相關(guān)[6]。表觀遺傳學(xué)中的乙酰化修飾是蛋白質(zhì)轉(zhuǎn)錄翻譯后主要修飾方式之一,乙酰化修飾和其他修飾之間的交叉調(diào)節(jié)對基因的轉(zhuǎn)錄控制至關(guān)重要[7]。蛋白質(zhì)乙酰化修飾需要乙酰基轉(zhuǎn)移酶的參與完成,KAT3b作為一種經(jīng)典乙酰基轉(zhuǎn)移酶可以通過調(diào)控蛋白質(zhì)乙酰化修飾參與腫瘤的發(fā)生和轉(zhuǎn)移,但其在食管癌中相關(guān)蛋白乙酰化修飾中的作用尚無研究報道[8]。本研究觀察乙酰基轉(zhuǎn)移酶抑制劑C646對食管癌細胞內(nèi)乙酰基轉(zhuǎn)移酶KAT3b、Survivin蛋白乙酰化水平的影響,探討KAT3b與Survivin乙酰化可能存在的內(nèi)在聯(lián)系以及在食管癌發(fā)生和發(fā)展中的可能作用機制。

資料與方法

1.細胞和試劑:人食管癌TE-1細胞購自上海賓穗生物科技有限公司;FK12培養(yǎng)基、胎牛血清等購自鄭州九龍生物制品有限公司;SDS-PAGE試劑盒、BCA蛋白定量試劑盒及MTT試劑盒等購自北京百奧萊博科技有限公司;KAT3b和Survivin等抗體購自艾美捷科技有限公司;乙酰基轉(zhuǎn)移酶抑制劑C646購自斯百全化學(xué)(上海)有限公司。

2.細胞培養(yǎng)和分組:凍存細胞水浴速溶,F12K培養(yǎng)基混勻,離心;棄上清,培養(yǎng)基混勻后轉(zhuǎn)入培養(yǎng)瓶;細胞孵箱常規(guī)培養(yǎng),將細胞培養(yǎng)至對數(shù)生長期后進行實驗。C646處理TE-1細胞為實驗組(C646組),有機溶劑DMSO處理TE-1細胞為對照組(DMSO組)。

3.實驗方法:(1)實時熒光定量聚合酶鏈反應(yīng)(real-time quantitative polymerase chain reaction, RT-qPCR)實驗:提取300ng RNA,應(yīng)用RNA反轉(zhuǎn)錄試劑盒反轉(zhuǎn)錄為互補DNA。應(yīng)用SYBR Green qPCR Master熒光定量試劑盒檢測mRNA的表達;PCR的反應(yīng)條件:94℃預(yù)變性4min;94℃變性30s;55℃退火30s;72℃延伸45s(30個循環(huán))。溶解曲線參照儀器自動程序。使用U6和GAPDH作為內(nèi)參,相對表達量以2-ΔΔCt計算。(2)Western blot法檢測:提取蛋白并測定總蛋白濃度;制備電泳蛋白上樣液,行凝膠電泳。電泳后,轉(zhuǎn)膜。加一抗4℃過夜。次日孵育二抗,重復(fù)洗膜后顯影。(3)免疫共沉淀實驗:提取細胞總蛋白,測定濃度。加入目的蛋白純抗體5μl和A/G瓊脂糖珠5ml,混勻后2×裂解緩沖液補充至總體積450μl,離心后,取上清液400μl置入離心管,4℃,15r/min,共沉淀12h。4℃離心,棄上清液。1×裂解緩沖液500μl洗滌A/G瓊脂糖珠。離心3min,棄上清液。重復(fù)洗滌3次;最后一次洗滌完畢后,棄去上清液。1×裂解緩沖液35μl和等體積的2×SDS上樣緩沖液混合,煮沸后離心;下一步行Western blot法。(4)MTT實驗:單細胞懸液計數(shù)后,以每孔8×103個細胞接種于96孔板。常規(guī)培養(yǎng)至每孔細胞密度達到80%進行轉(zhuǎn)染。12、24、48、72h后,每個時間點拿出一塊板,每孔加入5mg/ml MTT液30μl,繼續(xù)常規(guī)孵育4h。離心,棄上清。每孔加入二甲基亞砜(dimethylsulfoxide, DMSO)150μl,80r/min水平搖床搖勻5～10min。酶標儀檢測每孔的570nm的吸光度(A)值。(5)細胞劃痕實驗:收集各組細胞并配成單細胞懸液;以每孔8×103個細胞接種到96孔板。每孔100μl,共3組。常規(guī)培養(yǎng),待細胞鋪滿孔底后無菌移液槍頭垂直板面劃痕。每孔加入2ml無血清的培養(yǎng)基繼續(xù)培養(yǎng)48h,在倒置顯微鏡下測量劃痕的寬度。細胞遷移率(%)=(測量時劃痕寬度/初始劃痕寬度)×100%。(6)Transwell實驗:取轉(zhuǎn)染后鋪滿孔底的3組細胞,用0.25%不含EDTA的胰蛋白酶消化為單細胞懸液,收集后計數(shù)細胞。Matrigel膠提前融化為液態(tài)狀態(tài)備用。50mg/L Matrigel 1∶8稀釋液包被Transwell小室底部8μm孔徑的聚碳酸脂微孔濾膜,37℃過夜聚合成膠。小室經(jīng)過紫外線滅菌2h,抽去殘余的Matrigel膠液,用無血清的F12培養(yǎng)液在37℃條件下濕化1h。將Transwell小室按順序放入24孔板,無菌鑷子取出小室,室外加入含15%血清F12培養(yǎng)基600μl。小室內(nèi)加入200μl細胞懸液(細胞數(shù)為2×104個),培養(yǎng)液為不含血清的F12培養(yǎng)基,每組細胞重復(fù)6個樣本。24孔板放入CO2孵育箱內(nèi)常規(guī)培養(yǎng)48h。取出小室,磷酸鹽緩沖液(phosphate buffered saline, PBS)淋洗,擦去微孔膜內(nèi)層細胞。多聚甲醛固定后結(jié)晶紫染色。顯微鏡下拍照計數(shù)。

結(jié) 果

1.C646可濃度依賴性抑制食管癌TE-1細胞的活力:MTT法檢測結(jié)果表明,C646可濃度依賴性抑制食管癌TE-1細胞增殖活力,差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05);經(jīng)計算其半抑制濃度IC50=1.042μmol/L。確定1.0μmol/L為C646的最佳給藥濃度(圖1)。

圖1 MTT法檢測C646對食管癌TE-1細胞活力的影響與0μmol/L組比較,*P<0.05, **P<0.01

2.C646抑制KAT3b mRNA和蛋白表達:RT-qPCR檢測結(jié)果表明,C646組KAT3b mRNA相對表達量為0.24±0.03,DMSO組為1.37±0.04,C646組KAT3b mRNA相對表達量顯著降低,差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05,圖2)。Western blot法檢測結(jié)果顯示,C646組中KAT3b蛋白表達量明顯降低,兩組比較,差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05,圖3)。

圖2 C646對食管癌細胞KAT3b mRNA表達量的影響與DMSO組比較,*P<0.05

圖3 C646對食管癌細胞KAT3b蛋白表達量的影響

3.C646降低Survivin蛋白乙酰化水平:免疫共沉淀法和Western blot法檢測結(jié)果顯示,C646組KAT3b蛋白表達下降,且Survivin蛋白乙酰化水平顯著降低。與DMSO組比較,差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05,圖4)。

圖4 C646對食管癌細胞Survivin蛋白乙酰化水平的影響

4.C646抑制食管癌TE-1細胞的EMT:Western blot法檢測結(jié)果顯示,與DMSO組比較,C646可顯著上調(diào)TE-1細胞中上皮細胞標志蛋白E-鈣黏蛋白(E-cadherin)的表達,下調(diào)間質(zhì)細胞標志蛋白N-鈣黏蛋白(N-cadherin)以及EMT相關(guān)轉(zhuǎn)錄調(diào)控因子Snail和Slug的表達,兩組間比較差異有統(tǒng)計學(xué)意義(圖5)。

圖5 C646對食管癌細胞內(nèi)EMT相關(guān)蛋白表達的影響

5.C646抑制食管癌TE-1細胞的存活能力:MTT法檢測結(jié)果顯示,C646組中TE-1細胞的吸光度值顯著降低,抑制了TE-1細胞的存活能力,兩組間比較差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05,圖6)。

6. C646抑制食管癌TE-1細胞的遷移能力:細胞劃痕實驗結(jié)果顯示,C646組的劃痕愈合緩慢,距離近輕度縮短,抑制了TE-1細胞的遷移能力,兩組間比較差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05,圖7)。

圖7 C646對食管癌TE-1細胞遷移能力的影響

7.C646抑制食管癌TE-1侵襲能力:Transwell實驗結(jié)果顯示,C646組穿膜細胞數(shù)顯著減少,抑制了TE-1細胞的侵襲能力,兩組間比較差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05,圖8)。

圖8 C646對食管癌TE-1細胞侵襲能力的影響結(jié)晶紫染色,×400。A.C646;B.DMSO

討 論

食管癌整體預(yù)后較差,5年生存率僅為20%～35%,盡管手術(shù)和放化療方案優(yōu)化方面取得了進步,但總體獲益甚少[9]。腫瘤的高侵襲轉(zhuǎn)移性是導(dǎo)致患者高病死率的主要原因,其中癌基因活化與抑癌基因失活是導(dǎo)致腫瘤在臨床治療中失敗的關(guān)鍵因素[10]。因此,有效抑制癌細胞的存活能力,預(yù)防食管癌的侵襲和轉(zhuǎn)移是提升其術(shù)后遠期生存率的重要方法之一。

Survivin是一種抗凋亡基因,其表達的蛋白是多種惡性腫瘤中的獨特分子標志物[11]。Survivin的過表達可以抑制腫瘤細胞的凋亡,促進其增殖分化和血管生成[12]。研究發(fā)現(xiàn),Survivin可以抑制骨肉瘤和腦膜瘤細胞的凋亡,導(dǎo)致其異常增殖,且Survivin與兩者侵襲、耐藥和復(fù)發(fā)相關(guān)[13,14]。乙酰化是表觀遺傳學(xué)中較常見的一種蛋白修飾方式,參與多種腫瘤的發(fā)生和發(fā)展。既往研究多關(guān)注于組蛋白的乙酰化修飾在腫瘤中的作用機制,而近年來研究發(fā)現(xiàn),多種非組蛋白也可以發(fā)生乙酰化修飾,且與腫瘤的發(fā)生和發(fā)展密切相關(guān)[15,16]。研究發(fā)現(xiàn),Survivin在食管癌組織中發(fā)生了乙酰化修飾,且其乙酰化與食管癌分期、分化及淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移相關(guān),然而,Survivin乙酰化修飾促進食管癌發(fā)生和發(fā)展的具體機制仍不清楚[17]。通過體外實驗進一步證實食管癌細胞內(nèi)Survivin呈高乙酰化狀態(tài),說明Survivin作為一種非組蛋白同樣可以發(fā)生乙酰化修飾,而且其可能參與了食管癌的增殖、侵襲和轉(zhuǎn)移,這與前期研究結(jié)果一致[18]。

乙酰基轉(zhuǎn)移酶參與蛋白質(zhì)的乙酰化修飾,且在腫瘤的發(fā)生和發(fā)展過程中起到了至關(guān)重要的作用[19]。KAT3b屬于乙酰轉(zhuǎn)移酶P300/CBP家族中的代表性成員,可以催化多種組蛋白和非組蛋白發(fā)生乙酰化,同時自身也參與并調(diào)控細胞周期、自噬及多種腫瘤的發(fā)生及轉(zhuǎn)移[20]。研究發(fā)現(xiàn),KAT3b在腎癌組織中呈高表達,且下調(diào)其表達可以促進腎癌786-O細胞的凋亡,抑制細胞的增殖、侵襲和遷移[21]。前期研究表明,KAT3b在食管癌組織中呈高表達,且其陽性表達與食管癌的分期、分化及淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移相關(guān)[17]。這提示KAT3b可能通過自身功能或者靶向調(diào)控其他基因的途徑,促進了食管癌發(fā)生和發(fā)展。

食管組織中Survivin蛋白發(fā)生乙酰化同樣需要乙酰基轉(zhuǎn)移酶的參與,但催化其發(fā)生乙酰化的乙酰基轉(zhuǎn)移酶尚未明確。既往研究證實,抑制乙酰基轉(zhuǎn)移酶的表達可以使腫瘤細胞內(nèi)乙酰化蛋白的乙酰化狀態(tài)發(fā)生改變,進而改變腫瘤的生物學(xué)行為[22]。理論上,抑制乙酰基轉(zhuǎn)移酶的表達會改變食管癌組織中Survivin蛋白乙酰化修飾狀態(tài),進而改變食管癌的生物學(xué)行為。在沉默或下調(diào)乙酰基轉(zhuǎn)移酶促進相關(guān)蛋白發(fā)生去乙酰化作用機制中,沉默KAT3b有可能發(fā)揮更高的去乙酰化的作用,但在食管癌中,KAT3b作為乙酰基轉(zhuǎn)移酶是否參與Survivin乙酰化修飾的關(guān)系尚不明確。

C646作為一種乙酰基轉(zhuǎn)移酶抑制劑,可以特異性抑制乙酰基轉(zhuǎn)移酶KAT3b,也可以顯著降低組蛋白H3和H4乙酰化水平,且可抑制曲古霉素A誘導(dǎo)的蛋白乙酰化。本研究以食管癌TE-1細胞為研究對象,應(yīng)用C646對食管癌細胞進行處置,通過MTT法檢測證實,C646可呈濃度依賴性地抑制食管癌TE-1細胞增殖活力。乙酰基轉(zhuǎn)移酶抑制劑在體內(nèi)可以抑制多種乙酰基轉(zhuǎn)移酶的活性,但其往往具有針對性的主要抑制一種乙酰基轉(zhuǎn)移酶的活性和表達。通過RT-qPCR和Western blot法檢測了C646處置后的食管癌TE-1細胞內(nèi)乙酰基轉(zhuǎn)移酶KAT3b的表達情況,結(jié)果顯示,C646可以顯著抑制KAT3b mRNA和蛋白的表達。這說明C646可以有針對性地抑制KAT3b的活性和表達,是KAT3b的特異性抑制劑。進一步檢測Survivin乙酰化水平,結(jié)果顯示,KAT3b表達下調(diào)后,食管癌細胞內(nèi)Survivin乙酰化明顯降低,提示KAT3b作為乙酰基轉(zhuǎn)移酶參與了Survivin的乙酰化修飾,可能是調(diào)控Survivin進而改變食管癌生物學(xué)功能的一個重要上游分子。

上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化(epithelial mesenchymal transformation, EMT)是促進腫瘤侵襲轉(zhuǎn)移的重要機制,腫瘤細胞逐漸失去細胞極性和黏附力繼而獲得間質(zhì)細胞的高遷移能力,進而加速腫瘤的侵襲轉(zhuǎn)移,是多種惡性腫瘤侵襲轉(zhuǎn)移的早期標志物[23]。EMT在腫瘤侵襲和遷移過程中起到關(guān)鍵作用的基因分子主要包括E-cadherin、N-cadherin、Snail和Slug蛋白表達,也是預(yù)測腫瘤侵襲和轉(zhuǎn)移的重要標志物[24]。EMT標志蛋白及相關(guān)轉(zhuǎn)錄調(diào)控因子如Snail、Slug等表達及其功能受蛋白翻譯后修飾如乙酰化、磷酸化和泛素化等調(diào)控,繼而介導(dǎo)腫瘤的發(fā)生、發(fā)展[25]。本研究證實,C646干預(yù)后的食管癌細胞中E-cadherin的表達上調(diào),而N-cadherin及Snail和Slug蛋白表達下降。此外,采用細胞功能學(xué)實驗進一步證實C646抑制了食管癌細胞的存活、遷移和侵襲能力。以上研究結(jié)果表明,C646干預(yù)食管癌TE-1細胞后抑制了乙酰基轉(zhuǎn)移酶KAT3b的活性,使其催化的Survivin蛋白發(fā)生去乙酰化進而調(diào)控了EMT標志蛋白及相關(guān)轉(zhuǎn)錄因子的表達,進而抑制了食管癌TE-1細胞的存活、侵襲和遷移能力。

綜上所述,乙酰基轉(zhuǎn)移酶抑制劑C646可通過下調(diào)乙酰基轉(zhuǎn)移酶KAT3b靶向調(diào)控Survivin蛋白乙酰化修飾,進一步通過調(diào)控EMT過程中起到關(guān)鍵作用的因子,進而抑制食管癌的增殖、侵襲和遷移能力,為食管癌的臨床治療提供了新方法。