半邊楓不同溶劑提取物治療類風濕關節炎大鼠的研究

王 波 陳金堂 林有斌 沈繼全 季衛平

類風濕關節炎(rheumatoid arthritis, RA)是一種以膝關節滑膜增生為典型病理特征、與外在因素感染無關的對稱性疾病,全世界每年的發病人數約1.5億[1,2]。常見癥狀包括患側膝關節晨僵,伴有發紅、發熱和腫脹。嚴重者除皮膚類風濕結節外,還可出現乏力、發熱、體重減輕等全身癥狀。RA關節的骨和軟骨被破壞,肌腱和韌帶變弱[3,4]。RA的確切病因仍然不確定,并且沒有針對其根本原因的治療方法。畬藥半邊楓別名鴨掌柴、樹參,為五加科樹參屬植物樹參的根,畬民多以畬藥名半邊楓入藥,在《浙南本草新編》和《中國畬藥學》均有收載[5,6]。據典籍記載,半邊楓味甘、辛,性溫,具有祛風除濕和活血消腫的功效,主治風濕痹痛、偏癱、跌打損傷和瘡腫等[7,8]。初期病位在肢體皮肉,以邪實為主,病久病位在筋骨臟腑,痰瘀內生,相互交結,痹阻經絡,流注筋骨、關節和肌肉等[9,10]。本實驗采用不完全弗氏佐劑充分乳化后的牛Ⅱ型膠原誘導大鼠而產生膠原誘導性關節炎(collagen-induced arthritis, CIA)。研究半邊楓治療CIA大鼠關節炎癥和骨質損傷的藥用價值,進一步為畬藥半邊楓應用于臨床提供理論參考價值。

材料與方法

1.主要試劑與儀器:畬藥半邊楓(批號:2202024)購自麗水市人民醫院中藥房,經副主任中藥師鑒定為五加科植物樹參Dendropanax dentiger (Harms) Merr.的根,地塞米松注射液購自鄭州卓峰制藥有限公司,牛Ⅱ型膠原蛋白及不完全弗氏佐劑購自美國Chondrex公司,DAB辣根過氧化物酶顯色試劑盒、蘇木精-伊紅(hematoxylin-eosin, HE)染色試劑盒、QuickBlockTM封閉液和脫鈣液(10%硝酸溶液)購自上海碧云天生物技術有限公司,COX-2抗體和NF-κB p65抗體購自武漢三鷹技術有限公司,多聚甲醛購自安徽白鯊生物科技有限公司。M3全自動生化分析儀購自天津微納芯科技有限公司;組織切片機購自德國LEICA儀器有限公司(型號RM22445);5430R低溫高速離心機購自Eppendorf 德國;XH-C渦旋混合器購自江蘇正吉儀器有限公司;HH-6數字顯示恒溫水浴購自常州國華電氣設備有限公司;TDZ4-WS離心機購自長沙湘鑫離心機有限公司;DKZ-450A電熱恒溫振蕩水箱購自上海森新實驗儀器有限公司;TE4101-L電子天平購自賽多利斯科學儀器(北京)有限公司。

2.半邊楓化學成分分離與制備:取半邊楓藥材500g磨碎,加70%乙醇回流提取2h,共回流提取3次后合并倒出的提取液,在旋轉蒸發儀中濃縮成糊狀浸膏,接著于冷凍干燥機中冷凍干燥。隨后按順序分別用石油醚(30～60℃)、乙酸乙酯、正丁醇、水進行液-液萃取,重復3～4次并合并萃取液,用旋轉蒸發儀濃縮成黏稠浸膏,并冷凍干燥后形成半邊楓4個不同溶劑提取的干浸膏,復溶后計算出生藥量2g/ml,保存于-20℃冰箱待用。

3.動物分組及處理:SPF級雄性SD大鼠購自溫州醫科大學實驗動物中心[實驗動物生產許可證號:SCXK(浙)2020-0001],體質量為180～220g,并在溫州醫科大學實驗動物中心完成飼養[動物實驗設施許可證號:SYXK(浙)2015-0009]。大鼠飼養溫度為22±2℃,實驗前喂食標準顆粒飼料和水,適應性喂養7天。動物實驗按照溫州醫科大學動物倫理學委員會的規章制度進行(倫理學審批號:wydw2019-651)。適應7天后將56只雄性大鼠根據隨機數字表法分成7組,即石油醚(petroleum ether group, SG)組、乙酸乙酯(ethylacetate group, YG)組、正丁醇(butanol group, ZG)組和水部位(water group, WG)組、地塞米松(dexamethasone group, DEX)組、CIA組、對照組,每組各8只。

4.CIA模型的建立及分組治療:將牛Ⅱ型膠原蛋白與等體積的不完全弗氏佐劑混合后充分乳化。動物實驗第0天于大鼠尾根部皮下注射0.2ml混合乳劑,第7天于相同部位再次注射0.1ml混合乳劑加強免疫。各組于實驗第7天發病后開始連續灌胃給藥23天。對照組和CIA組連續灌胃0.5% CMC-Na溶液,DEX組連續灌胃劑量為0.05mg/kg DEX混懸于0.5% CMC-Na溶液,SG組、YG組、ZG組和WG組中半邊楓不同溶劑提取物的灌胃劑量均按2g/ml的生藥量配比給藥。

5.大鼠左后足厚度的測量和關節炎指數評分:使用游標卡尺測量大鼠左后足厚度評估左后足的腫脹程度。評分標準:0分:無明顯紅斑、腫脹;1分:局限于踝關節和腳趾的紅斑和輕度腫脹;2分:從踝關節到足中部出現紅斑和中度腫脹;3分:紅斑和嚴重腫脹從腳踝一直延伸到跖關節;4分:四肢腫脹伴有關節的強直性畸形。每隔3～4天觀察各組大鼠兩后足的腫脹程度并進行關節炎指數評分。

6.病理學檢查:①HE染色:采用HE染色方法觀察組織形態學變化。麻醉過量處死大鼠后取右下肢,剝去膝關節表層肌肉在10%甲醛溶液中固定3天,置入脫鈣液(10%硝酸溶液)脫鈣3天后流水沖洗1天,再包埋在石蠟中切成薄片用HE染色。②免疫組化:大鼠組織切片后在磷酸鹽緩沖液(phosphate buffer saline, PBS)中脫蠟、再水化和沖洗。用3%過氧化氫滅活內源過氧化物。將枸櫞酸鈉緩沖液加熱20min后室溫冷卻修復組織切片中的抗原,用5%山羊血清封閉,接著滴加一抗COX-2抗體和NF-κB p65抗體4℃過夜孵育,接著二抗室溫孵育1h,沖洗后在室溫下用DAB溶液孵育3min并用蘇木精復染。最后用EVOS M5000顯微鏡對圖像進行觀察及分析。

7.臟器指數:分離胸腺和脾臟組織,控干水分,隨后分別稱量各組織器官的重量,最后記錄各部分數值。臟器指數=臟器質量(mg)/大鼠體質量(mg)。

8.影像學觀察:將對照組、CIA組、DEX組及乙酸乙酯組中標本行Micro-CT成像,觀察三維重建后踝關節結構形態差異。

結 果

1.大鼠常規狀況:實驗過程中,對照組大鼠精神良好,活動活躍,毛發順滑;CIA組大鼠精神較差,后足腫脹明顯出現跛行,毛發粗亂;SG組、YG組、ZG組、WG組和DEX組大鼠精神狀態尚可,活動量尚可,反應較靈敏,毛發松散,少部分可自由行走。

2.關節炎指數評分:第7天后部分大鼠出現后足炎癥,炎癥部位不同,表現為從足趾、足背等開始的腫脹。在治療過程中,除對照組外,各組大鼠的關節紅腫持續,部分給藥末期出現后足明顯畸形與強直。與對照組比較,CIA組、SG組、YG組、ZG組、WG組、DEX組大鼠在0、1、2、3和4周的關節炎指數差異均有統計學意義(P<0.05);其中0、1和2周進行組間比較,可見CIA組、SG組、YG組、ZG組、WG組和DEX組差異無統計學意義(P>0.05)。3周和4周進行組間比較,可見YG組及DEX組較CIA組降低,差異均有統計學意義(P<0.05,表1)。

表1 各組大鼠第0～4周左足關節評分

3.大鼠左足墊厚度測定:各周均可見CIA組、SG組、YG組、ZG組、WG組和DEX組大鼠較對照組存在差異,差異有統計學意義(P<0.05)。分別在0、1、2周互相比較,結果顯示,CIA組、SG組、YG組、ZG組、WG組和DEX組大鼠差異無統計學意義(P>0.05)。3周后進行組間比較發現,YG組與DEX組較CIA組存在差異,差異有統計學意義(P<0.05,表2,圖1)。

表2 各組大鼠第0～4周左足墊厚度變化

4.大鼠臟器指數比較:與CIA組比較,YG組、DEX組胸腺指數改善比較,差異均有統計學意義(P<0.05)。與CIA組比較,YG組、DEX組脾臟指數比較,差異有統計學意義(P<0.05,表3)。

表3 各組大鼠胸腺和脾臟指數結果

5.各組大鼠左足足踝關節Micro-CT掃描成像:如圖2所示,對照組大鼠踝關節骨質正常,關節間隙及結構適中,關節面平滑。CIA組大鼠踝關節結構模糊,骰骨、楔骨、距骨和跟骨等程度較重的蟲蝕增生樣骨質特點致使踝關節間隙狹窄,關節結構破壞程度高,關節面粗糙,部分相鄰關節面融合。多個跖關節面粗糙,構成關節的骨質呈蟲蝕樣改變。DEX組及YG組大鼠踝關節骨質均有不同程度的損傷,關節面不光滑,結構模糊且不完整。

圖2 各組大鼠Micro-CT掃描成像圖A.對照組;B.CIA組;C.DEX組;D.YG組

7.各組大鼠患膝組織病理學改變(HE染色):如圖3所示,對照組大鼠的滑膜細胞規則排列,散在少量炎性細胞,無明顯滑膜細胞增生;CIA組大鼠滑膜細胞顯著增生,呈多層不規則分布,見大量炎性細胞浸潤;DEX組及YG組大鼠滑膜細胞增生,炎性細胞浸潤及滑膜細胞的分布結構較CIA組有明顯好轉。

圖3 各組大鼠患膝組織病理學結果(HE染色,×200)A.對照組;B.CIA組;C.DEX組;D.YG組

8.大鼠足踝組織切片免疫組化:如圖4和表4所示,與對照組比較,CIA組COX-2和NF-κB表達均增加,差異有統計學意義(P<0.05),并且陽性點多集中于大鼠患側后肢關節的滑膜襯里層內;與CIA組比較,YG組、DEX組患側后肢關節滑膜處COX-2和NF-κB表達減少明顯,差異有統計學意義(P<0.05)。YG組與DEX組COX-2和NF-κB之間表達量比較,差異無統計學意義(P>0.05)。

圖4 COX-2和NF -κB蛋白在各組大鼠足踝組織中的表達情況(免疫組織化學染色,×200)

表4 各組足踝組織切片COX-2和NF-κB免疫組化陽性點結果

結 果

RA是一種以非化膿性增生性滑膜炎為主的對稱性自身免疫性疾病。CIA大鼠在預期時間內表現出明顯的后足腫脹特征和對稱的RA樣多后足征象。CIA大鼠因關節炎引起的腫脹,后足不能承受重量,在實驗后期出現足部畸形。本研究廣泛研究了半邊楓不同溶劑提取物對CIA大鼠的治療作用,并將DEX治療作為陽性對照。YG組和DEX組能有效降低大鼠滑膜細胞增殖和炎性細胞浸潤。Micro-CT成像結果顯示,半邊楓乙酸乙酯組對CIA大鼠踝骨破壞的減退效應。DEX組和YG組踝關節骨有不同程度的損傷,關節面不光滑,結構模糊且不完整。通過對各組之間的數據分析,可得出半邊楓乙酸乙酯提取物的藥效雖不及臨床標準藥物糖皮質激素組有效,但對治療RA還是有效的。

數百年來,中草藥一直用于治療RA和其他炎癥性疾病。畬藥半邊楓別名樹參,已有研究將其作為中藥湯的一部分來治療關節炎。郭元敏等[11]采用樹參麻木湯+對63例門診患者進行治療,經過長達1年的隨訪,表明樹參麻木湯明顯緩解關節炎癥狀。劉日才等[12]對58例門診患者采用樹參麻黃防己湯進行治療,表明樹參麻黃防己湯具有良好的鎮痛消腫作用,能夠明顯緩解RA患者的癥狀。鄭莉萍等[13]對半邊楓的粗提物不同萃取部位進行了抗氧化活性研究,發現半邊楓乙酸乙酯提取物表現出很好的1,1-二苯基-2-三硝基苯肼(2,2-diphenyl-1-picrylhydrazyl, DPPH)自由基清除能力。與這些報道一致,本研究發現半邊楓乙酸乙酯提取物可以有效降低關節腫脹,減少骨質破壞等。

目前關于RA的病因學尚未完全明確,但RA中的炎性細胞因子非常活躍,研究顯示,COX-2、TNF-α、IL-1β等炎性細胞因子和NF-κB通路與RA的病理過程密切相關[14]。NF-κB是一種多效性轉錄因子,在調節促炎性細胞因子和基質金屬蛋白酶的表達中發揮重要作用。與CIA組比較,YG組和DEX組患側后肢關節滑膜處COX-2和NF-κB表達減少明顯,提示經初篩后的半邊楓乙酸乙酯提取物具有與標準陽性藥物地塞米松相同的有效抑制大鼠關節炎癥NF-κB通路及有效下調COX-2表達的功效,這意味著半邊楓乙酸乙酯提取物具有良好的抗RA炎癥進展的功效。

現有治療RA的藥物可減輕劇烈疼痛和炎癥等癥狀,但隨著用藥次數的增加,鎮痛作用逐漸減弱[15, 16]。在CIA大鼠中,T淋巴細胞和B淋巴細胞的過度表達以及T淋巴細胞信息傳遞的異常導致注射全乳化牛Ⅱ型膠原后后肢腫脹等嚴重炎性反應[17]。由于具有Th1表型的T淋巴細胞在B淋巴細胞的調節中也起輔助作用,會影響B淋巴細胞的分泌,刺激脾臟分泌更多的B淋巴細胞來抵抗機體的炎性反應,從而增加大鼠胸腺和脾臟的代償能力[18～20]。因此,YG能有效抑制CIA大鼠細胞免疫和體液免疫引起的炎癥。

本研究結果表明,半邊楓乙酸乙酯提取物能有效減輕RA大鼠中關節腫脹、減少踝關節骨質破壞、抑制免疫器官、抑制炎性組織中COX-2和NF-κB的表達,具有良好的藥用價值。