患有壞死性小腸結(jié)腸炎的早產(chǎn)兒腸道菌群分析

王英豪，戴立英

1 蘇州大學(xué)附屬第二醫(yī)院兒科，江蘇蘇州 215008；2 安徽省兒童醫(yī)院新生兒科

壞死性小腸結(jié)腸炎（necrotizing enterocolitis，NEC）是新生兒期最常見的胃腸道急癥，主要見于早產(chǎn)兒，極低出生體質(zhì)量（＜1 500 g）早產(chǎn)兒中發(fā)病率5%～10%［1］。NEC的病死率高達(dá)20%～30%［2-3］。NEC主要表現(xiàn)為不同程度腸壞死，以缺血性腸壞死為主要病理特征，治療不及時(shí)可并發(fā)腸外營(yíng)養(yǎng)相關(guān)的膽汁淤積和肝功能障礙、營(yíng)養(yǎng)不良、代謝性骨病、短腸綜合征、膿毒癥、嚴(yán)重感染和神經(jīng)認(rèn)知障礙［4］。目前，NEC的確切病因仍未完全了解，研究普遍認(rèn)為NEC的發(fā)病可能是多因素導(dǎo)致的，可能包括細(xì)菌定植異常、免疫不成熟、腸屏障功能不成熟、微血管發(fā)育不全等。健康的腸道環(huán)境可以有助于早產(chǎn)兒減少腸道炎癥和損傷。異常定植的細(xì)菌可導(dǎo)致早產(chǎn)兒腸道微生物群落紊亂。NEC早產(chǎn)兒的腸道菌群多樣性是否與正常新生兒不同，目前相關(guān)研究較少。為此，我們對(duì)患有NEC 早產(chǎn)兒的腸道菌群結(jié)構(gòu)進(jìn)行分析，旨在為后續(xù)NEC的診療提供理論依據(jù)。現(xiàn)將結(jié)果報(bào)告如下。

1 資料與方法

1.1 臨床資料 選擇2020 年1 月—7 月安徽省兒童醫(yī)院收治的早產(chǎn)兒66 例，發(fā)生NEC 44 例（觀察組，其中觀察1 組22 例、觀察2 組22 例）、未發(fā)生NEC 22例（對(duì)照組）。觀察組納入標(biāo)準(zhǔn)：①符合NEC臨床診斷標(biāo)準(zhǔn)，Ⅰ期為“可疑”期，X 線片以胃潴留和輕度腹脹為特征；Ⅱ期為“腸梗阻”期，主要表現(xiàn)為腸梗阻、水腫、腸壁積氣征等；Ⅲ期為疾病的晚期，進(jìn)展迅速惡化，易發(fā)生腸壞死、膿毒性休克、消化道出血，穿孔等嚴(yán)重并發(fā)癥；②明確診斷NEC Ⅱ或Ⅲ度的早產(chǎn)兒；③標(biāo)本收集前后均不使用免疫制劑及微生物制劑。排除標(biāo)準(zhǔn)：排除腸閉鎖、巨結(jié)腸等腸道發(fā)育畸形患兒。對(duì)照組納入標(biāo)準(zhǔn)：①同期在安徽省兒童醫(yī)院住院的早產(chǎn)兒；②對(duì)照組的日齡、胎齡、出生體質(zhì)量、喂養(yǎng)方式、出生方式等臨床特征與NEC 組基本匹配，避免引起潛在NEC 及菌群失調(diào)的因素；③標(biāo)本收集前后均不使用免疫制劑及微生態(tài)制劑。排除標(biāo)準(zhǔn)：排除腸閉鎖、巨結(jié)腸等腸道發(fā)育畸形患兒。觀察組中男10 例、女12 例，出生胎齡（35 ± 2）周，出生體質(zhì)量（2 274 ± 236）g；剖宮產(chǎn)率41%（9/22），母乳喂養(yǎng)率36%（8/22）；對(duì)照組中男10例、女12例，出生胎齡（35 ± 3）周，出生體質(zhì)量（2 358 ± 227）g，剖宮產(chǎn)率41%（9/22），母乳喂養(yǎng)率36%（8/22）。 本研究已通過安徽省兒童醫(yī)院倫理委員會(huì)批準(zhǔn)（EYLL-2017-023），并獲得患兒父母或監(jiān)護(hù)人書面知情同意。觀察組采取禁食、抗感染、維持內(nèi)環(huán)境穩(wěn)定、支持治療等綜合管理；對(duì)照組針對(duì)原發(fā)病進(jìn)行對(duì)癥治療、抗感染、維持內(nèi)環(huán)境穩(wěn)定、支持治療等綜合管理。

1.2 三組患兒腸道菌群檢測(cè) 觀察1 組在診斷NEC 24 h 內(nèi)、對(duì)照組于入院24 h 內(nèi)收集糞便標(biāo)本，觀察2 組在治療后（NEC 臨床癥狀明顯好轉(zhuǎn)，全量喂養(yǎng)時(shí)）采用一次性無菌糞便采集管從患兒尿布上收集糞便標(biāo)本。采用16S rRNA 基因高通量測(cè)序技術(shù)檢測(cè)三組患兒糞便腸道菌群DNA，明確腸道菌群種類，測(cè)算三組腸道菌群多樣性指數(shù)（Shannon 指數(shù)、Sobs 指數(shù)、Simpson 指數(shù)及Chao 值）。① 糞便DNA提取：糞便DNA 的提取采用試劑盒的方法，所用試劑盒為德國(guó)QIAGEN 公司生產(chǎn)的QIAamp Stool Mini Kit。完成基因組DNA 提取后，采用1%瓊脂凝膠電泳檢測(cè)抽取的基因組DNA。② PCR 擴(kuò)增：指定測(cè)序區(qū)域，合成含有barcode 的特異引物。用于16S rRNA V3 區(qū) PCR 擴(kuò)增的引物：338F：（5’-ACTCCTACGGGAGGCAGCAG-3’），806R：（5’-GGACTACHVGGGTWTCTAAT-3'）。③ Miseq 測(cè)序及生物信息分析：Miseq 測(cè)序得到的PE reads 首先根據(jù)overlap 關(guān)系進(jìn)行拼接，同時(shí)對(duì)序列質(zhì)量進(jìn)行質(zhì)控和過濾，區(qū)分樣本后進(jìn)行OUT 聚類分析和物種分類學(xué)分析，基于OUT 聚類分析結(jié)果，可以對(duì)OUT 進(jìn)行多種多樣性指數(shù)分析以及對(duì)測(cè)序深度的檢測(cè)；基于分類學(xué)信息，利用Circos 軟件測(cè)算每組樣本的物種組成比例。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 采用SPSS 22.0 統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)處理。正態(tài)分布計(jì)量資料以±s表示，組間比較采用獨(dú)立樣本t檢驗(yàn)；計(jì)數(shù)資料以%表示，組間或細(xì)菌種屬者統(tǒng)計(jì)學(xué)差異采用Mann-Whitney 檢驗(yàn)。P＜0.05為差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 三組患兒腸道菌群類型比較 觀察1 組和對(duì)照組共有63 種菌群種類，獨(dú)有菌群種類分別為27、23 種。觀察2 組和對(duì)照組共有67 種相同菌群種類，獨(dú)有菌群種類分別為23、23 種。觀察1 組患兒腸道菌群的優(yōu)勢(shì)菌群主要為腸球菌（40%）、厚壁菌門（21%）、變形菌門（23%）、雙歧桿菌（10%）；觀察2 組患兒腸道菌群的優(yōu)勢(shì)菌群主要為大腸桿菌（28%）、腸球菌（21%）、雙歧桿菌（28%）、厚壁菌門（8%）、變形菌門（5%）；對(duì)照組腸道菌群的優(yōu)勢(shì)菌群主要為大腸桿菌（42%）、腸球菌（25%）、雙歧桿菌（30%）、厚壁菌門（2%）。觀察1 組與對(duì)照組患兒腸道菌群種類構(gòu)成比較，P＜0.05；觀察1 組與觀察2 組患兒腸道菌群種類構(gòu)成比較，P＜0.05。

2.2 三組患兒腸道菌群多樣性比較 觀察1 組、觀察2 組及對(duì)照組患兒腸道菌群Shannon 指數(shù)分別為0.93 ± 0.50、0.91 ± 0.51、1.10 ± 0.34；Sobs 指數(shù)分別為19.36 ± 7.08、21.23 ± 6.43、21.96 ± 4.76；Simpson 指數(shù)分別為0.51 ± 0.26、21.23 ± 6.43、0.46 ± 0.16；Chao 值分別為22.16 ± 7.62、24.25 ±7.10、25.44 ± 6.97。三組腸道菌群多樣性指數(shù)間比較，P均＞0.05。

3 討論

NEC 是一種危及生命的消化系統(tǒng)疾病，常發(fā)生于早產(chǎn)兒，以腸缺血壞死為特征，除了發(fā)病率和病死率較高，腸狹窄粘連、膽汁淤積、短腸綜合征、發(fā)育不良和神經(jīng)發(fā)育遲緩等長(zhǎng)期并發(fā)癥發(fā)病率較高。腸道微生物群落擁有數(shù)千種細(xì)菌，它們?cè)诰S持體內(nèi)微生物平衡方面起著至關(guān)重要的作用，NEC 作為一種典型的腸道感染性疾病，腸道微生物菌群失調(diào)參與NEC 的發(fā)病機(jī)制［5］。PATEL 等［6］研究表明正常菌群可在上皮細(xì)胞表面的生長(zhǎng)繁殖形成生物屏障，優(yōu)先占領(lǐng)生存空間，抑制外來致病菌的定植，當(dāng)腸道菌群正常的定植過程遭到破壞或延遲，將導(dǎo)致菌群結(jié)果發(fā)生改變，使正常菌群與宿主間的生態(tài)平衡失調(diào)，一些正常菌群成為機(jī)會(huì)致病菌，觸發(fā)炎癥反應(yīng)，導(dǎo)致NEC的發(fā)生。

雖然腸道微生物菌群對(duì)NEC 的發(fā)展至關(guān)重要，但它們?cè)谄浒l(fā)病機(jī)制中的確切作用仍不清楚［7］。在過去的幾十年里，高通量測(cè)序已經(jīng)成為評(píng)估糞便和其他人體基質(zhì)中微生物群落的一種非常流行的方法［8］，最常見的是通過對(duì)細(xì)菌16S rRNA 基因進(jìn)行測(cè)序，使研究人員能夠獲得腸道內(nèi)微生物多樣性信息，以幫助識(shí)別與疾病相關(guān)的微生物組變化。在本研究中我們使用高通量測(cè)序技術(shù)，針對(duì)16S rRNA 基因的v3～v5 區(qū)發(fā)現(xiàn)觀察組治療前后和對(duì)照組菌群豐度無明顯差異，且NEC 組和對(duì)照組之間的Shannon 指數(shù)和Chao1 指數(shù)沒有顯著差異，表明菌群多樣性的缺乏并非NEC 發(fā)生的關(guān)鍵因素，與DOLLINGS 等［9］研究一致。同時(shí)通過本研究測(cè)序結(jié)果發(fā)現(xiàn)觀察組治療前后和對(duì)照組菌群種類存在顯著差異，其中觀察組（治療前）以腸球菌、厚壁菌門、變形菌門為主，而觀察組（治療后）和對(duì)照組以腸球菌、雙歧桿菌為主，提示厚壁菌門及變形菌門優(yōu)勢(shì)，且雙歧桿菌減少可能導(dǎo)致NEC發(fā)生。 LINDBERG 等［4］對(duì)5例NEC患兒和5 例匹配對(duì)照患兒糞便樣本進(jìn)行16S rRNA 基因測(cè)序分析，發(fā)現(xiàn)NEC 患兒中變形桿菌豐度較高，雙歧桿菌豐富較低，與本研究一致。STEWART 等［10］采用16S rRNA 基因測(cè)序技術(shù)對(duì)13 例NEC 患兒術(shù)后切除腸段和16 例自發(fā)性穿孔術(shù)后切除腸段對(duì)比研究發(fā)現(xiàn)，NEC 患兒切除腸段中變形桿菌及厚壁菌門相對(duì)豐度較高，且微生物多樣性較低。有研究表明胎齡越小NEC 發(fā)病率越高［11］，確診時(shí)的中位胎齡往往隨著胎齡的增加而減少，提示在發(fā)育中的腸道中，微生物定植和微生物識(shí)別受體的表達(dá)水平之間的聯(lián)合作用可能對(duì)NEC 的發(fā)生很重要。在對(duì)動(dòng)物模型和手術(shù)切除的早產(chǎn)兒腸道研究表明，變形桿菌在腸道中通過識(shí)別G-脂多糖并激活TLR-4 后，可通過誘導(dǎo)微生物相關(guān)分子模式（microbe-associated molecular patterns， MAMPs）激活特定的TLRs，開啟特異性免疫反應(yīng)，通過激活轉(zhuǎn)錄因子NF-κβ 啟動(dòng)炎癥級(jí)聯(lián)反應(yīng)，反過來引起腸上皮細(xì)胞凋亡和炎癥因子（IL-1、IL-6、TNF-α）過度釋放，更容易引起細(xì)胞因子介導(dǎo)的腸系膜血管炎癥，破壞腸道免疫功能，造成腸組織局部缺血壞死，被認(rèn)為是NEC發(fā)病的關(guān)鍵［12-13］。

本研究中經(jīng)治療后的NEC 患兒和非NEC 患兒雙歧桿菌豐度較高，提示雙歧桿菌豐度較高的早產(chǎn)兒不容易發(fā)生NEC［14-15］。腸道微生態(tài)失調(diào)作為NEC發(fā)展的高危因素，使得益生菌作為單菌株或多菌株活微生物補(bǔ)充劑在早產(chǎn)和足月新生兒中進(jìn)行了大量研究，其中以雙歧桿菌和乳酸桿菌是最為常見。LUESCHOW 等［16］一項(xiàng)對(duì)小鼠NEC 模型研究表明雙歧桿菌可通過減少炎癥細(xì)胞因子釋放，降低腸上皮細(xì)胞通透性和增強(qiáng)腸上皮細(xì)胞中的緊密連接，改善腸道上皮屏障來預(yù)防NEC 的發(fā)生。另外一項(xiàng)動(dòng)物觀察表明在妊娠和哺乳期間，小鼠通過母體給予嗜酸乳桿菌和雙歧桿菌可促進(jìn)腸道發(fā)育，改善腸道屏障功能，減少斷奶前炎癥反應(yīng)［17］。李忠堂等［18］以87 例NEC 早產(chǎn)兒為研究對(duì)象，分析其病原體特點(diǎn)，觀察不同治療方法對(duì)患兒血清炎癥因子的影響，并通過Logistic 回歸分析影響NEC 患兒預(yù)后的危險(xiǎn)因素，發(fā)現(xiàn)雙歧桿菌干預(yù)可顯著降低NEC 早產(chǎn)兒血清IL-1β、IL-10 水平及TLR-4 表達(dá)。楊小慶等［19］對(duì)220 例早產(chǎn)兒隨機(jī)接受雙歧桿菌補(bǔ)充研究指出，接受雙歧桿菌補(bǔ)充早產(chǎn)兒胃潴留、腹脹及NEC 發(fā)生率均較未補(bǔ)充早產(chǎn)兒低。HAGEN 等［20］一項(xiàng)多中心對(duì)照試驗(yàn)發(fā)現(xiàn)出生后第一個(gè)月單獨(dú)給予雙歧桿菌的早產(chǎn)兒NEC發(fā)生率明顯降低。

綜上所述，NEC 患兒與正常早產(chǎn)兒的腸道菌群種類構(gòu)成沒有差異。與正常早產(chǎn)兒比較，NEC 患兒腸道菌群厚壁菌門及變形菌門的豐度增加，雙歧桿菌豐度減少。腸道菌群多樣性可能不是NEC 發(fā)生發(fā)展的關(guān)鍵，補(bǔ)充外源性雙歧桿菌可能有效減少早產(chǎn)兒NEC的發(fā)生。