黏蛋白5AC和黏蛋白5B在相關肺疾病發(fā)生發(fā)展中的作用機制研究進展

楊慶嬋，李寬，王詠梅

1 天津市海河醫(yī)院病理科，天津 300350；2 天津市呼吸疾病研究所；3 天津市海河醫(yī)院基礎醫(yī)學實驗部；4 天津市肺臟再生醫(yī)學重點實驗室

呼吸道上皮襯有黏液，是一種由水、離子、蛋白質(zhì)和大分子組成的凝膠。黏液會捕獲微生物和顆粒，并通過纖毛擺動或咳嗽將微生物和顆粒從肺部清除［1］，在氣道免疫中起著至關重要的作用。黏液的主要大分子成份是黏蛋白（Mucin， MUC），是由上皮合成的高分子量、重度糖基化的O-連接糖蛋白，有分泌型和膜結合型兩種類型。黏蛋白5AC（MUC5AC）和黏蛋白5B（MUC5B）是肺部主要的分泌型黏蛋白。多數(shù)黏液阻塞性肺疾病的發(fā)生發(fā)展，例如哮喘、囊性纖維化（cystic fibrosis， CF）和慢性阻塞性肺病（chronicobstructive pulmonary disease，COPD）等，均與MUC5B、MUC5AC 組成的小氣道黏液栓有關［2］；MUC5B 啟動子區(qū)域中的單核苷酸（rs35705950）多態(tài)性被認為是與特發(fā)性肺纖維化（idiopathic pulmonary fibrosis， IPF）發(fā)病相關的重要遺傳因素［3］；而黏液產(chǎn)生及其生理特性的改變也是導致部分重癥新型冠狀病毒肺炎（COVID-19）患者氣道癥狀持續(xù)存在的原因［4］。了解MUC5AC、MUC5B 在呼吸系統(tǒng)疾病發(fā)生發(fā)展中的信號通路和調(diào)節(jié)機制，深入研究MUC5AC 和MUC5B 的功能特性，使其有望成為新型藥物的作用靶點，為許多肺部疾病的治療開辟新的治療途徑。現(xiàn)將MUC5AC 及MUC5B 在相關肺疾病發(fā)生發(fā)展中的作用機制綜述如下。

1 氣道MUC的生物學功能

迄今為止，人類基因組中已被發(fā)現(xiàn)有21種MUC基因［5］，其編碼的黏蛋白有14 種存在于氣道中。其中有4 種黏蛋白在氣道蛋白表達中占優(yōu)勢：四種具有跨膜結構域且與細胞表面相關，即膜結合型黏蛋白（MUC1、MUC4、MUC16、MUC20）；兩種形成凝膠的分泌型黏蛋白（MUC5AC、MUC5B）和一種非凝膠形式的分泌型黏蛋白（MUC7）。分泌型黏蛋白在粘膜表面形成薄層，是黏液生理特性的物質(zhì)基礎并決定其黏彈性；而膜結合型黏蛋白附著在黏膜上，是纖毛周圍凝膠狀層的基礎，并參與細胞信號傳導、免疫調(diào)節(jié)、細胞運動、黏附和生長［1］。MUC5AC和MUC5B是呼吸道中兩種主要的凝膠形成粘蛋白，編碼MUC5AC 和MUC5B 的基因位于染色體11p15 上，它們的基因組結構由編碼復雜多域蛋白的單個大外顯子組成。MUC5AC 和MUC5B 的蛋白質(zhì)結構大致相似［6］，都是大分子量的（5-50 MDa），具有特征結構域的O-聚糖的糖蛋白［7］。廣泛的O-糖基化可以使黏蛋白骨架變硬，這對凝膠形成至關重要［1］。

MUC5AC在上呼吸道主要由表面上皮杯狀細胞產(chǎn)生，而MUC5B 主要由黏膜下腺的黏液細胞分泌。在遠端氣道，MUC5AC和MUC5B均由上皮表面的分泌細胞（Club 細胞）產(chǎn)生［1］。MUC5AC 和MUC5B 在維持健康的氣道上皮細胞中具有不同的作用。MUC5B 是健康人類氣道中的主要黏蛋白。動物研究［6］表明，Muc5b 對黏液纖毛清除功能（mucociliary clearance， MCC）和通過控制細菌感染和減輕炎癥來維持氣道健康至關重要。在小鼠模型［6，8］中muc5b 基因缺失會導致氣道金黃色葡萄球菌感染、黏液運輸受損以及中性粒細胞、嗜酸性粒細胞和巨噬細胞聚集。相比之下，MUC5AC 在健康氣道中的表達較低，但在人體應對病毒感染時可表達上調(diào)，充當病毒受體的誘餌，在炎癥反應中發(fā)揮重要作用［1］。

2 MUC5AC、MUC5B 在黏液阻塞性肺疾病發(fā)生發(fā)展中的作用機制

2.1 MUC5AC、MUC5B 在COPD 發(fā)生發(fā)展中的作用機制 COPD 是一種以氣流持續(xù)受限為特征的氣道阻塞性疾病，其發(fā)病機制主要包括氣道炎癥、氧化應激、蛋白酶/抗蛋白酶失衡、肺氣腫和氣道黏液分泌障礙［9］。黏液產(chǎn)生過多是COPD的主要標志，并與肺功能下降及臨床預后不良相關［10］。MUC5AC 和MUC5B 是與COPD 發(fā)病相關的主要黏蛋白［11］。研究［11］發(fā)現(xiàn)，COPD 患者痰液MUC5AC、MUC5B 水平均升高，MUC5AC 與MUC5B 的比率增加，且這種增加同COPD 嚴重程度及FEV1 降低相關［1］。因此，黏蛋白成分的改變可能在COPD發(fā)病機制中起重要作用。傳統(tǒng)研究認為COPD 的黏液表型是由MUC5AC驅(qū)動的，然而近年來的一系列研究表明，MUC5B 在COPD 的黏液表型中也發(fā)揮重要作用。MUC5B 是COPD 患者痰液中的主要聚合黏蛋白，對呼吸道先天免疫和MCC 至關重要。降低MUC5B 水平可能導致黏液阻塞氣道、MCC 損傷和增加感染風險［12］。進一步研究證明，MUC5B 可以促進COPD 小鼠模型氣道上皮細胞向杯狀細胞分化、黏液產(chǎn)生以及炎癥反應，并且MUC5B是通過干擾信號轉(zhuǎn)導和轉(zhuǎn)錄激活因子6（Signal transducers and activators of transcription， STAT6）-上皮特異性ETS 轉(zhuǎn)錄因子（SAM pointed domain-containing ETS transcription factor，SPDEF）通路或巨噬細胞的功能發(fā)揮作用的，而叉頭轉(zhuǎn)錄因子A2（FoxA2）在該通路中充當負調(diào)節(jié)劑。因此，推測MUC5B可能是治療黏液分泌過多的新型靶點［13］。而黏液溶解劑在體外可以降低人彈性蛋白酶誘導的MUC5AC 表達，從而減輕細菌黏附并改善體內(nèi)黏液清除［11］。此外，PRECIADO 等［14］發(fā)現(xiàn)香煙可以誘導MUC5B啟動子激活和基因表達，并且這種激活至少部分是由NF-κB 介導的，因此我們推測這可能與香煙煙霧導致COPD 氣道粘液分泌過多和氣道炎癥相關。

2.2 MUC5AC、MUC5B 在哮喘發(fā)生發(fā)展中的作用機制 哮喘的主要癥狀包括喘息、呼吸困難、胸悶和咳嗽，這些都是由氣道平滑肌收縮、MCC 受損引起的。而氣道上皮杯狀細胞增生和化生則會導致MUC 儲存和分泌發(fā)生變化，最終導致黏液阻塞氣道，這是哮喘發(fā)生的重要病理生理特征［15］。MUC5AC和MUC5B作為氣道分泌的主要黏蛋白，它們的組成變化影響著黏液的生理特性［16］。有研究表明哮喘患者MUC5AC 基因表達增加，且MUC5AC 和MUC5B 的比例發(fā)生變化。但目前關于MUC5B 的變化仍存在爭議，KIRKHAM 等［17］研究發(fā)現(xiàn)哮喘患者痰液中MUC5AC 和MUC5B 蛋白水平均增加。而另一項研究［18］認為哮喘患者（包括急性發(fā)作患者）氣道MUC5AC濃度增加，但MUC5B濃度是降低的。在哮喘患者隊列研究中，MUC5AC與MUC5B比率增加與2型炎癥反應（嗜酸性粒細胞＞2%）相關。

參與哮喘炎癥反應的是2型免疫細胞，包括2型T 輔助細胞（Th2）和先天淋巴細胞（iLC2s），它們協(xié)調(diào)哮喘患者的氣道發(fā)生重塑。這些細胞在過敏性炎癥期間產(chǎn)生白細胞介素（interleukin， IL）-13，誘導氣道上皮細胞mRNA 和miRNA 表達發(fā)生特征性變化［15］。LIU 等［19］研究證明哮喘大鼠氣道中MUC5AC蛋白水平增加與氣道炎癥因子IL-1β 水平升高有關。由于MUC5AC 和MUC5B 的分泌是影響哮喘的重要因素之一，因此探索調(diào)控其表達的關鍵信號通路在靶向治療支氣管哮喘患者杯狀細胞增多和黏液分泌過多中具有重要意義。IL-13 通過依次激活Janus 激酶1（Janus kinase 1， JAK1）、STAT6 增加人氣道上皮細胞和小鼠哮喘模型中MUC5AC 的表達［20］；相反，IL-13 通過抑制FoxA2 信號傳導途徑負相調(diào)節(jié)MUC5AC［21］。而在移植的胚胎肺中進行的一項研究發(fā)現(xiàn)，Notch信號參與調(diào)節(jié)氣道分泌細胞中MUC5AC的表達，Notch 配體數(shù)量增加或Notch1 受體持續(xù)活躍導致黏液細胞數(shù)量增多［22］。而阻斷Notch3 信號后哮喘患者氣道上皮細胞中MUC5AC 產(chǎn)生減少［23］。因此需要更多的研究來確定Notch 信號調(diào)節(jié)氣道上皮細胞MUC5AC 表達的確切分子機制，為藥物靶向治療提供更多新思路。

2.3 MUC5AC、MUC5B 在CF 發(fā)生發(fā)展中的作用機制 CF 是由編碼囊性纖維化跨膜傳導調(diào)節(jié)因子（cystic fibrosis transmembrane conductance regulator，CFTR）基因突變引起的，CFTR 功能障礙主要會導致氯化物分泌減少和鈉吸收增加，以及碳酸氫鹽分泌減少導致的鈣黏蛋白交聯(lián)過多，氣道中的黏液脫水，黏液變得更黏稠并降低了纖周層的高度，尤其是在感染因子或毒素侵入機體階段。這些變化導致黏液清除效率降低，從而形成了感染、炎癥和損傷的惡性循環(huán)，最終導致肺功能進行性惡化［24］。CF 患者的黏液具有以下特征：中性粒細胞浸潤；銅綠假單胞菌、金黃色葡萄球菌和曲霉菌等病原體易感；脫水凝膠基質(zhì)將微生物固定，從而促進生物膜的形成，以及抑制中性粒細胞的運動，造成感染難以清除。因此在影像學上表現(xiàn)為支氣管擴張；病理學表現(xiàn)為中性粒細胞為主炎癥、黏液分泌細胞數(shù)量增加和氣道纖維化；在臨床上表現(xiàn)為咳嗽，膿性痰，咯血，呼吸困難，肺部反復感染以及肺功能迅速喪失［20］。

GRONEBERG 等［25］報道，CF 患者和健康對照組相比，MUC5AC和MUC5B免疫組織化學染色表現(xiàn)無明顯差異，但CF患者主氣道和支氣管表面上皮杯狀細胞增生部位MUC5AC 呈陽性。KIRKHAM 等［17］研究發(fā)現(xiàn)與健康對照組相比，CF 患者痰液中MUC5B蛋白表達增加。氣道表面上皮MUC5AC 和黏膜下腺體MUC5B 表達增加導致黏蛋白分泌到呼吸道的速度增加，從而導致黏液栓形成、感染和炎癥。進一步研究黏蛋白基因中遺傳或表觀遺傳學變化或CFTR突變與黏蛋白變化之間的聯(lián)系對CF管理和治療、防止肺移植或死亡具有重要意義。

3 MUC5AC、MUC5B 在IPF 發(fā)生發(fā)展中的作用機制

IPF 是最常見的特發(fā)性間質(zhì)性肺疾病，它被定義為一種原因不明、病變局限于肺部的特殊類型慢性纖維化性間質(zhì)性肺炎，其特征為氣體交換障礙、進行性呼吸困難和總體預后不良。肺纖維化的關鍵病理生理機制包括反復發(fā)生的特發(fā)性肺泡上皮損傷、不可控制的膠原沉積及MUC5B 過表達導致的黏液纖毛功能障礙、缺氧和宿主防御改變等。MUC5B 是控制氣道和肺泡感染以及維持肺部免疫穩(wěn)態(tài)所必需的成分：在博萊霉素誘導的肺損傷小鼠模型中，肺部MUC5B 表達會導致肺纖維化加重、黏液纖毛清除率降低并促進蜂窩囊腫形成［26］。蜂窩囊腫是IPF 患者肺部的一種含黏蛋白結構，MUC5B 是其中主要的凝膠形成黏蛋白，蜂窩囊腫的形成導致肺泡氣體交換功能障礙［27］。黏液溶解劑可清除肺部的炎癥細胞并減少膠原纖維的產(chǎn)生，因此恢復受損的MCC 有助于預防和治療肺纖維化［28］。研究發(fā)現(xiàn)IPF患者MUC5B的表達比健康對照組高14.1 倍，并且它主要位于遠端氣道、呼吸道細支氣管和蜂窩囊腫等IPF 病變部位［29］。有研究［30］報道，MUC5B 基因序列中含有50側翼區(qū)的DNA 片段包含了幾個用于結合轉(zhuǎn)錄因子的推定序列，例如NF-κB 和激活蛋白1（AP-1），它們可以與MUC5B 啟動子結合并隨后誘導MUC5B 表達，這兩種轉(zhuǎn)錄因子都參與了肺損傷和纖維化期間T細胞細胞因子的產(chǎn)生，這可能在IPF的發(fā)病機制中發(fā)揮關鍵作用［27］。

遺傳學也進一步證實了MUC5B 和IPF 的相關性。IPF最重要的遺傳風險因素是位于11號染色體p 末端的MUC5B 啟動子rs35705950 多態(tài)性，這種多態(tài)性見于38%的IPF患者及34%的家族性間質(zhì)性肺炎患者［29］。CHEN 等［31］研究發(fā)現(xiàn)具有MUC5B 啟動子rs35705950 多態(tài)性的IPF 患者，其內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應激可以通過ERN2-XBP1S 途徑上調(diào)MUC5B 表達。PELJTO 等［32］對2個獨立IPF患者隊列的生存率進行回顧性研究發(fā)現(xiàn)具有MUC5B 啟動子rs35705950 多態(tài)性的 IPF 患者預后反而得到改善，生存率提高。因此，在未來的臨床治療試驗中檢測MUC5B多態(tài)性具有一定的臨床價值。

目前關于MUC5AC 和IPF 關系的報道很少，且仍然存在爭議，MUC5AC 參與黏膜損傷后的上皮傷口愈合以及細胞應激、損傷和修復途徑的激活，這表明它可能在修復IPF 氣道上皮失衡方面發(fā)揮了關鍵作用。MUC5AC啟動子中NF-kB結合位點被確定為IL-1β 和IL-17A 調(diào)控MUC5AC 表達的關鍵部位，而這兩種物質(zhì)在IPF 患者的支氣管肺泡灌洗液（BALF）中表達增加［27］。據(jù)報道，與IPF 疾病有關的細胞因子IL-9 也可以通過呼吸道上皮細胞中的JAK/STAT 通路激活MUC5AC［33］。中性粒細胞彈性蛋白酶是肺纖維化進展中的一個關鍵效應物，它通過增強mRNA 穩(wěn)定性來增加MUC5A CmRNA 表達水平［27］。但是，LAURENT 等［34］研究發(fā)現(xiàn)，IPF 患者與對照組相比，肺損傷部位的杯狀細胞中MUC5AC表達降低。而KANEKO 等［35］比較了IPF 和健康者BALF 中MUC5AC 的分泌，發(fā)現(xiàn)并無差異，但是該研究樣本數(shù)太小，需要擴大樣本量進一步驗證其結論。

4 MUC5AC、MUC5B 在COVID-19 發(fā)生發(fā)展中的作用機制

COVID-19是由新型冠狀病毒（2019-nCoV）引起的以肺部炎性病變?yōu)橹鞯募膊　Ｖ囟菴OVID-19 患者在初次感染后，呼吸道癥狀可能仍會持續(xù)數(shù)月，包括咳嗽和呼吸急促。黏液產(chǎn)生及其生理特性的改變可能是導致COVID-19 氣道癥狀持續(xù)存在的原因。在部分COVID-19 患者中，氣道黏蛋白MUC5AC 和MUC5B 表達異常，有學者推測黏蛋白變化使氣道上皮容易發(fā)生損傷并影響肺泡氣體交換功能。在小鼠模型中，呼吸機引起氣道損傷使MUC5AC 表達增加，在該研究中，MUC5AC豐度的變化與氣道阻塞和肺水腫有關。作者認為MUC5AC 是呼吸機損傷的驅(qū)動因素，因為缺乏MUC5AC 的小鼠肺水腫和炎癥不太嚴重［36］。一項對COVID-19 患者氣道上皮單細胞進行RNA 測序的研究［37］表明，Club 細胞中MUC5AC和MUC5B的轉(zhuǎn)錄豐度增加，并推測黏蛋白分泌增加可能會加重炎癥反應并導致繼發(fā)感染。腫瘤壞死因子（TNF）-α 可能在COVID-19 黏液產(chǎn)生中發(fā)揮關鍵作用。TNF-α可誘導一系列下游細胞因子并調(diào)節(jié)MUC5AC和MUC5B的表達。在小鼠模型中，給予2周TNF-α 可以增加氣道MUC5AC 的表達。因此，TNF-α 通過直接或間接調(diào)節(jié)黏蛋白并導致COVID-19 黏液異常［4］。MUC5AC 可通過增強中性粒細胞的轉(zhuǎn)運功能加重肺損傷進程。因此，通過控制炎癥因子和降低MUC5AC 的表達有希望成為治療急性肺損傷的靶點［38］。

綜上所述。MUC5AC 及MUC5B 在黏液阻塞性肺疾病、IPF 及COVID-19 的發(fā)生發(fā)展中發(fā)揮重要作用。可以通過霧化吸入高滲鹽溶液進行水合作用或者通過脫氧酶α降低黏液的黏度和彈性。病理性氣道黏液的靶向治療不僅可以改善患者咳嗽和呼吸困難的癥狀，還可以減少與疾病相關的急性發(fā)作頻率并減緩疾病進展。雖然目前對MUC5AC 和MUC5B調(diào)節(jié)機制、信號通路以及各種氣道疾病關系的研究有了很大進步，但許多重要問題仍有待解決。了解黏蛋白及其基因表達如何在正常氣道上皮細胞中進行功能調(diào)節(jié)，以及影響基因調(diào)節(jié)的遺傳背景和環(huán)境因素同疾病的關系，以及如何控制黏蛋白的產(chǎn)生或者防止其生產(chǎn)過剩仍然是一項重大挑戰(zhàn)。