化學酶法對硫酸軟骨素類多糖的定量分析

陳婷婷, 李文靜, 楊桂霞, 周賢軒, 石春紅

(合肥工業大學 食品與生物工程學院,安徽 合肥 230601)

硫酸軟骨素(chondroitin sulfate,CS)是一類廣泛存在于動物結締組織中的酸性糖胺聚糖類大分子多糖,在生物體內多以蛋白聚糖側鏈形式存在[1-2]。硫酸軟骨素及軟骨素的碳鏈骨架由葡糖醛酸(GlcA)和N-乙酰半乳糖胺(GalNAc)以β-1,3和β-1,4糖苷鍵(4-GlcA-β-1,3-GalNAc-β-1)交替連接而成的重復二糖單元組成,一般有二糖單元20～100個[3-4]。軟骨素經硫酸化后得到硫酸軟骨素,根據其硫酸化位點的不同,可以將硫酸軟骨素分為以下不同類型[5]:硫酸化發生在GalNAc的C-4位、GalNAc的C-6位羥基上的分別是硫酸軟骨素A、硫酸軟骨素C;硫酸軟骨素E的GalNAc的C-4位和C-6位羥基均發生硫酸化;硫酸軟骨素B一般稱為硫酸皮膚素(DS),其結構是硫酸軟骨素A中GlcA被艾杜糖醛酸取代[6]。硫酸軟骨素因其結構多樣性而具有各種不同功能[7],硫酸軟骨素及其低分子量衍生物在治療風濕病、骨質疏松癥、關節炎、腰間盤突出等方面具有重要作用[8-10]。

硫酸軟骨素裂解酶(ChSase)可以將硫酸軟骨素、透明質酸等糖胺聚糖裂解為不飽和二糖及寡糖[11],主要存在于微生物中。根據其作用底物的不同可以分為ChSase ABC、ChSase AC、ChSase B、ChSase C等類型。其中:ChSase ABC可以降解硫酸軟骨素A、硫酸軟骨素B、硫酸軟骨素C及透明質酸;ChSase AC可將軟骨素、硫酸軟骨素A、硫酸軟骨素C及透明質酸降解為不飽和二糖和寡糖[12];ChSase B可以降解硫酸軟骨素B和透明質酸;ChSase C嚴格作用于硫酸軟骨素C和透明質酸。本研究使用的裂解酶AsChnAC酶解機制同ChSase AC,是一種硫酸軟骨素AC外切酶[13]。

本研究提供了一種復雜培養液中軟骨素類多糖質量濃度的定量檢測方法,通過多糖酶解與蒽酮-硫酸法相結合,測定軟骨素類多糖質量[14],測定過程如圖1所示。

首先通過超濾去除培養基中小分子雜質,再用相應的裂解酶將多糖分解為不飽和二糖或寡糖,這些低分子量糖可經超濾截留住大分子雜質,最后結合蒽酮-硫酸法測定糖質量濃度。

圖1 化學酶法定量示意圖

1 材料與方法

1.1 實驗材料

1.1.1 菌株

大腸桿菌 BL21、大腸桿菌K4ΔkfoE、大腸桿菌EcNΔkfiA∶∶Kan、大腸桿菌EcN、大腸桿菌BL21/pET28a(+)-AsChnAC,均由本實驗室保存。

1.1.2 材料與試劑

硫酸軟骨素C、異丙基-β-D-硫代半乳糖苷(IPTG)、三羥甲基氨基甲烷(Tris)、氯化鈉、咪唑、苯甲基磺酰氟(PMSF)、蒽酮、濃硫酸、重水(D2O)、Bradford試劑、40%丙烯酰胺、十二烷基硫酸鈉(SDS)、過硫酸銨(APS)、TEMED、超濾管、透析袋等。

1.2 實驗方法

1.2.1 誘導純化硫酸軟骨素裂解酶AsChnAC

將攜帶表達硫酸軟骨素裂解酶AsChnAC質粒的大腸桿菌BL21/pET28a(+)-AsChnAC單克隆過夜培養并轉移到2 L新鮮LB培養液中,37 ℃振蕩培養至A600>0.6。加400 μL 1 mol/L IPTG于22 ℃過夜誘導。誘導后的菌液在轉速6 000 r/min下4 ℃離心20 min,收集菌體。用BufferA(25 mmol/L Tris,500 mmol/L NaCl,30 mmol/L咪唑)重懸菌體。向上述溶液加100 mmol/L PMSF后超聲破碎,破碎的細胞液于12 000 r/min、4 ℃離心20 min,收集上清液。上清液以1 mL/min的流速通過Ni-NTA柱,用BufferA(25 mmol/L Tris,500 mmol/L NaCl,30 mmol/L咪唑)洗雜,BufferB(25 mmol/L Tris,500 mmol/L NaCl,250 mmol/L咪唑)洗脫。在25 mmol/L Tris、500 mmol/L NaCl溶液中透析,收集蛋白組分。純化后的蛋白進行SDS-PAGE電泳,并使用Bradford法測其蛋白質量濃度[15]。

1.2.2 蒽酮-硫酸法

樣品與蒽酮反應試劑(含0.1%蒽酮和80%濃硫酸)以體積比1∶3混勻,每種樣品設置3個平行組,將混合液于100 ℃水浴15 min、冰浴15 min,測定620 nm處吸光度值。

1.2.3 硫酸軟骨素C標準曲線的繪制

稱取硫酸軟骨素C溶于ddH2O,配制成20 mg/mL的母液,將硫酸軟骨素C稀釋至0.1、0.2、0.4、0.6、0.8、2.0 mg/mL,每個質量濃度梯度設置3個平行組,蒽酮-硫酸法測620 nm處吸光度值,OriginPro繪制標準曲線,計算線性回歸方程。

1.2.4 AsChnAC裂解硫酸軟骨素C定量分析

將30 mg/ml 硫酸軟骨素C(溶于20 mmol/L Tris-HCl,pH值為7.0)與0.2 mg/mL AsChnAC等體積混合,在37 ℃下分別水浴反應10、30、50、90、720、960 min,100 ℃煮沸3 min,13 000g離心2 min,收集上清液。取400 μL上清液加入0.5 mL 10 kDa超濾管,14 000g離心30 min,收集過濾液。倒置超濾管,1 000g離心2 min,收集濃縮液。蒽酮-硫酸法測硫酸軟骨素C質量。

1.2.5 核磁共振氫譜分析

稱取20 mg 硫酸軟骨素C溶于500 μL D2O,將待測樣品裝入0.5 mm核磁管進行核磁共振氫譜(proton nuclear magnetic resonance,1H NMR)檢測。分別稱取20 mg硫酸軟骨素C溶于1mL LB培養液和1 mL BL21菌液上清,干燥完全后,溶于500 μL D2O,將待測樣品裝入0.5 mm核磁管進行1H NMR檢測。

1.2.6 質譜分析

將20 mg/mL 硫酸軟骨素C與0.2 mg/mL AsChnAC等體積混合,37 ℃水浴反應16 h。反應液于100 ℃煮沸3 min,13 000g離心2 min,收集上清。上清用透析膜(MWCO 1 kDa)在去離子水中透析4 h。將上述樣品進行質譜分析。

1.2.7 硫酸軟骨素C和軟骨素質量濃度測定

分別挑取大腸桿菌K4ΔkfoE、大腸桿菌EcN、大腸桿菌EcNΔkfiA∶∶Kan單克隆于3 mL M9C中,37 ℃振蕩過夜。分別將上述菌液按1%的量轉接至50 mL M9C中,37 ℃振蕩培養約20 h。菌液于12 000 r/min離心10 min收集上清。稱取硫酸軟骨素C溶于EcNΔkfiA∶∶Kan菌液上清中配制成1 mg/mL的溶液。分別取3 mL上述硫酸軟骨素C溶液、K4ΔkfoE菌液上清、EcN菌液上清、EcNΔkfiA∶∶Kan菌液上清與300 μL 200 mmol/L Tris-HCl(pH值為7.0)溶液混勻?；靹蚝蠓謩e用0.22 μm濾器過濾,以去除殘余菌體。取上述過濾后的溶液加入10 kDa 0.5 mL超濾管,一次400 μL,14 000g離心30 min后棄濾液,重復此過程直至3 mL溶液加完。加400 μL 20 mmol/L Tris-HCl,14 000g離心20 min,重復2次,去除培養液中小分子雜質。向超濾管加150 μL 20 mmol/L Tris-HCl(pH值為7.0),沖洗膜兩側,倒置超濾管,1 000g離心2 min,再加20 mmol/L Tris-HCl(pH值為7.0)定容至200 μL。加300 μL 2 mg/mL AsChnAC于定容后的溶液中,37 ℃水浴反應16 h后,100 ℃煮3 min,13 000g離心2 min,收集上清。將上清加入10 kDa 0.5 mL超濾管,14 000g離心30 min,得到過濾液。過濾液干燥完全,加100 μL ddH2O重懸,重懸液用蒽酮-硫酸法測其多糖質量濃度。

1.2.8 樣品損失率及軟骨素質量濃度的計算

以硫酸軟骨素C溶液計算樣品損失率,公式如下:

軟骨素質量濃度計算公式為:

2 結果與分析

2.1 1H NMR結果分析

將硫酸軟骨素C進行1H NMR檢測,結果如圖2所示。

圖2 硫酸軟骨素C的1H NMR分析

從圖2可以看出,圖譜無雜峰,且CS—C共有7個特征峰,其中化學位移在1.99×10-6處是硫酸軟骨素C中N-乙?；谆奶卣鞣?通常可以用來粗略定量該糖質量。LB培養液中硫酸軟骨素C的核磁共振圖譜和大腸桿菌 BL21培養液中硫酸軟骨素C的核磁共振圖譜與硫酸軟骨素C標準品的圖譜對比,發現復雜培養基中的硫酸軟骨素C的核磁共振圖譜有較多雜峰,特別是N-乙?；谆奶卣鞣逍盘柺艿絿乐馗蓴_,說明其中復雜成分干擾了NMR對硫酸軟骨素C的定量分析。因此,1H NMR法不能用于測定復雜培養基LB培養液中的硫酸軟骨素C質量濃度。

2.2 硫酸軟骨素裂解酶的誘導表達與純化

將表達得到的蛋白收集純化,進行SDS-PAGE電泳,AsChnAC酶蛋白SDS-PAGE分析結果如圖3所示,圖3中:泳道1為Protein Marker;泳道2為AsChnAC蛋白。

由圖3可知,純化后得到較單一的目的蛋白,純化后收集的AsChnAC蛋白用Bradford法測得,其質量濃度為2 mg/mL。

圖3 AsChnAC酶蛋白SDS-PAGE電泳圖

2.3 硫酸軟骨素C標準曲線繪制

濃硫酸將多糖水解為單糖,與蒽酮反應生成深綠色復合物,在620 nm處有最大吸光度值,吸光度值與糖質量存在明顯線性關系。以硫酸軟骨素C質量為橫坐標,吸光度值為縱坐標,繪制標準曲線。硫酸軟骨素C的標準曲線如圖4所示。

圖4 硫酸軟骨素C標準曲線

由圖4可知,在所測質量濃度范圍內,硫酸軟骨素C質量與吸光度值呈正相關。

2.4 硫酸軟骨素C裂解的定量分析

硫酸軟骨素C在不同消化時間點超濾收集的寡糖質量如圖5a所示。由圖5a可知,硫酸軟骨素C與AsChnAC裂解酶等體積混合,于37 ℃水浴反應不同時間,酶解液上清經超濾得到的過濾液用蒽酮-硫酸法定量。硫酸軟骨素C在被AsChnAC分解90 min后寡糖質量不再明顯增加。

倒置超濾管得到未被分解的硫酸軟骨素C,未分解的硫酸軟骨素C質量占總硫酸軟骨素C質量的比例與時間呈負相關,如圖5b所示。由圖5b可知,隨時間的增加,未分解的硫酸軟骨素C質量占總硫酸軟骨素C質量的比例逐漸下降,表明硫酸軟骨素C被AsChnAC裂解為寡糖。在酶解960 min后,酶解率可達96.5%。

圖5 不同消化時間硫酸軟骨素C定量分析

2.5 硫酸軟骨素C和軟骨素質量濃度分析

硫酸軟骨素C經AsChnAC酶解后的質譜分析如圖6所示。由圖6可知,所得實測二糖的m/z值為457.7、480.1,符合預期二糖的m/z值(458.07和480.04)。質譜分析結果顯示,高分子硫酸軟骨素被酶切成了二糖,其他寡糖成分極少,在質譜分析中沒有明顯信號。

通過AsChnAC酶解法和蒽酮-硫酸法,測定了復雜培養基中的硫酸軟骨素C質量濃度以及EcN、K4ΔkfoE菌株上清液中未純化的軟骨素質量濃度。大腸桿菌EcNΔkfiA∶∶Kan為敲除了kfiA基因的EcN菌株,為本實驗室保存。由于kfiA基因的敲除,該菌株無法合成莢膜多糖,因此可以作為陰性對照。以硫酸軟骨素C標準品溶液作為外標,反映了待測樣品的損失率,根據損失率算出軟骨素類多糖的質量濃度如圖7所示。

圖6 硫酸軟骨素C酶解后質譜分析

圖7 培養液中軟骨素類多糖的質量濃度

將硫酸軟骨素C溶液的A620代入損失率計算公式,得到損失率為23.1%。將EcN、K4ΔkfoE上清的A620代入軟骨素質量濃度計算公式,得到EcN上清中軟骨素類多糖質量濃度為10.1 mg/L,K4ΔkfoE上清中軟骨素的質量濃度為31.5 mg/L。

3 討 論

硫酸軟骨素的傳統制備方法主要是從動物的軟骨組織中提取[16],存在結構不均勻、動物源致病菌等問題[17]。軟骨素與大腸桿菌K4的莢膜多糖結構類似[18]。近年來,通過微生物發酵生產軟骨素,并進一步制備出硫酸軟骨素,逐漸成為研究熱點[19]。該方案具有潛在的顯著降低成本、低污染、工藝簡單、產品質量穩定等優點。大腸桿菌K4是軟骨素類似物的主要生產菌株,其產物是果糖軟骨素。本研究使用敲除了kfoE基因的K4ΔkfoE菌株,其產物去除了該菌莢膜多糖中的果糖基團,是制備硫酸軟骨素的重要原材料[20]。但是在測定該菌產生的軟骨素質量時,微生物培養液中的復雜成分(如培養基單糖成分、代謝產物、肽聚糖成份等)會干擾軟骨素多糖的定量分析。因此,有必要開發一種方法快速定量檢測發酵液中硫酸軟骨素類多糖質量濃度。

硫酸軟骨素的分子量范圍為20～80 kDa,AsChnAC酶蛋白屬于硫酸軟骨素裂解酶AC,在葡糖醛酸C4位斷裂β-1,4糖苷鍵,生成不飽和雙鍵[13,21]。本文使用專一性的酶解方法去除雜質的干擾,結合蒽酮-硫酸法可以簡便準確地測定復雜培養液中的多糖質量濃度。使用截留分子量為10 kDa的超濾管先將培養液中的小分子干擾物去除,再用裂解酶AsChnAC將硫酸軟骨素類多糖降解為不飽和寡糖。通過超濾得到寡糖過濾液,進一步排除了大分子雜質的干擾,最后使用蒽酮-硫酸法可以方便地測出軟骨素類多糖質量濃度。

該方法提供了一種發酵液中軟骨素類多糖質量濃度的定量檢測方法。該方法偶聯了酶專一性分解軟骨素與化學分析方法,只需通過2個步驟,即可將復雜成分中造成定量干擾的小分子、大分子雜質去除,可以快速地測定復雜培養液中的軟骨素類多糖質量濃度。該方法具有普適性,利用不同專一性的多糖裂解酶,該方法也可以擴展使用于其他多糖的定量分析。