酸解離溫敏性水凝膠藥物載體在腫瘤治療中的應用

楊 懷, 孫天賜, 閆 旭, 何 濤, 李曉萱

(1.合肥工業大學 化學與化工學院,安徽 合肥 230009; 2.合肥工業大學 食品與生物工程學院,安徽 合肥 230601)

0 引 言

癌癥治療一直是臨床需要攻克的重大難題之一。化療是癌癥治療的主要手段,目前臨床上的化療藥物有阿霉素、索拉菲尼和道諾霉素等。然而,實體腫瘤的多藥耐藥(multidrug resistance, MDR)會影響化療效果,MDR可在藥物治療中產生,也可由腫瘤內源性微環境(如酸性、缺氧和谷胱甘肽S轉移酶的上調)誘導[1-2]。同時,化療藥物本身的缺點也會影響化療效果,如腫瘤選擇性差、靶向性差以及對正常組織和器官有毒副作用等[3]。因此在化療過程中需要改變藥物的給藥方式,在提高療效的同時降低毒副作用。

水凝膠基本上是一種含有大量水的三維交聯網狀聚合物材料[4],其具有良好的生物相容性,已廣泛應用于生物醫學領域,如藥物傳遞[5]、細胞治療與組織工程[6-8]等。將化療藥物包載在水凝膠內,然后植入腫瘤部位,既可以延長藥物的作用時間從而提高療效,又可以減少藥物對正常組織和器官的毒副作用,是一種良好的腫瘤治療方式。原位成型水凝膠具有可注射性,在治療過程中可減小創面,與預成型水凝膠相比,是一種具有潛在應用價值的藥物負載材料。原位成膠通常采用化學和物理交聯2種方式。化學交聯水凝膠的凝膠化過程需要將單獨存儲的有機交聯劑加入到基質中,并且在一些情況下需要外部條件(如紫外光照射等)來啟動。物理交聯水凝膠是通過配位作用、鏈纏結和氫鍵等物理作用來構建的,相比之下,物理交聯水凝膠避免了有機交聯劑的加入,具有更好的生物相容性,在實際應用中更加方便[9]。雖然穩定的內部三維網絡結構可以賦予水凝膠良好的載藥能力,但也會阻礙藥物的按需釋放,因此研制一種具有穩定持久釋放功能的原位成膠的水凝膠載體具有非常重要的意義。

本研究通過可逆加成-斷裂鏈轉移(reversible addition-fragmentation chain transfer,RAFT)聚合制備了ABA型酸解離溫敏性嵌段聚合物水凝膠聚(N-異丙基丙烯酰胺130)-原酸酯-聚乙二醇90-原酸酯-聚(N-異丙基丙烯酰胺130),命名為POP,其中:A嵌段為聚N-異丙基丙烯酰胺,提供聚合物的疏水性和溫敏性[10-12];B嵌段為聚乙二醇(polyethylene glycol, PEG),提供聚合物的親水性以及生物相容性;原酸酯鍵位于親、疏水嵌段之間,在酸性環境中,原酸酯鍵不穩定而發生斷裂[13-14]。POP水凝膠可作為化療藥物阿霉素(Dox)的載體,載藥POP溶液通過注射器注入腫瘤部位后快速地原位轉化為水凝膠固體植入物,從而實現精準的藥物靶向遞送。同時,由于腫瘤部位pH值為6.0左右[15],水凝膠聚合物中的原酸酯鍵斷裂,凝膠網絡會逐漸崩塌降解,從而實現Dox的穩定持久釋放,延長Dox的作用時間并提高其生物利用度。因此,POP水凝膠有望提高腫瘤治療的成功率,為臨床上提高化療藥物的療效提供了一種有效的手段。

1 實驗部分

1.1 主要試劑與儀器

3-氨基-1,2丙二醇、三氟乙酸乙酯、對甲苯磺酸吡啶鎓(p-toluene sulfonic acid,P-TSA)、原甲酸三甲酯、聚乙二醇(PEG-4000)、4-氰基-4-(苯基硫代硫代硫代)戊酸N-琥珀酰亞胺酯(4-Cyano-4-(phenylcarbonothioylthio) pentanoic acid N-succinimidyl ester,CTA-NHS)、三乙胺、偶氮二異丁腈(azodiisobutyronitrile,AIBN)、N-異丙基丙烯酰胺(N-isopropylacrylamide,NIPAM)、二氯甲烷(dichloromethane,DCM)、四氫呋喃(tetrahydrofuran,THF)、乙酸乙酯(ethyl acetate,EA)、1,4-二氧六環、甲苯、N,N-二甲基甲酰胺,以上試劑均購于阿拉丁試劑(上海)有限公司。除NIPAM和AIBN在使用前需重結晶純化外,其他所有試劑均直接使用。

安捷倫VNMR S600型核磁共振氫譜儀(proton nuclear magnetic resonance,1H NMR)(蘇州紐邁分析儀器股份有限公司);蔡司Supra 40掃描電子顯微鏡(scanning electron microscope,SEM)(北京普瑞賽司儀器有限公司);Agilent PL-GPC 50凝膠滲透色譜儀(gel permeation chromatography,GPC)(上海禹重實業有限公司)。

1.2 實驗過程

1.2.1 POP聚合物的合成

POP的合成過程如圖1所示,圖1中,聚合度x=130。

1) 丙二醇三氟乙酸乙酯(q1)的合成。將5 g 3-氨基-1,2丙二醇用25 mL DCM溶解,逐滴加入12 g三氟乙酸乙酯,室溫下攪拌反應24 h。反應完畢后,旋蒸除去DCM,剩余物用25 mL EA復溶,然后分別用質量濃度為6 kg/L的NaH2PO4水溶液和飽和NaCl水溶液萃取3次,收集上層有機溶液并用無水硫酸鎂干燥,濃縮后得到淡黃色油狀液體產物丙二醇三氟乙酸乙酯(q1)。

2) 原酸酯三氟乙酸乙酯(q2)的合成。將2 g q1、35.65 mg P-TSA、4.39 g原甲酸三甲酯溶解于10 mL DCM中,室溫下攪拌反應24 h。反應完畢后,旋蒸除去DCM,剩余物用25 mL EA復溶,然后用質量濃度為10 kg/L NaCl水溶液萃取3次并用無水硫酸鎂干燥,濃縮后得到白色油狀液體產物原酸酯-三氟乙酸乙酯(q2)。

圖1 POP聚合物的合成路線

3) 原酸酯-聚乙二醇-原酸酯(q3)的合成。將1 g q2、2.15 g聚乙二醇(PEG-4000)、30 mg P-TSA溶解于10 mL甲苯,120 ℃下攪拌反應12 h。反應完畢后,旋蒸除去甲苯,25 mL THF復溶,然后逐滴加入25 mL 質量濃度為4 kg/L的NaOH水溶液。室溫攪拌反應12 h后,旋蒸除去THF,剩余物用DCM萃取3次,然后用無水碳酸鉀干燥。經0 ℃正己烷中沉降和真空干燥后得到白色固體粉末原酸酯-聚乙二醇-原酸酯(q3)。

4) 雙硫酯-聚乙二醇-雙硫酯(q4)的合成。將1 g q3、0.35 g CTA-NHS和0.333 g三乙胺溶解在N,N-二甲基甲酰胺中,常溫下避光反應24 h后在0 ℃正己烷中沉降,然后真空干燥,得到紅色固體粉末雙硫酯-聚乙二醇-雙硫酯(q4)。

5) 嵌段聚合物聚POP的合成。POP聚合物是通過RAFT聚合反應得到的,反應過程如下:將0.1 g q4、1.28 g NIPAM、1.6 mg AIBN溶解于2.5 mL的1,4-二氧六環中,在3個冷凍—真空—解凍循環脫氧后,78 ℃攪拌反應10 h。反應結束后,在0 ℃正己烷中沉降,然后真空干燥得到白色線性聚合物粉末POP。

1.2.2 水凝膠的制備

將0.1 g POP聚合物加入到4 mL的pH=7.4磷酸鹽緩沖液(phosphate buffer solution,PBS)中,然后放置在4 ℃冰箱中靜置溶解,直至聚合物徹底溶于PBS(聚合物與PBS的質量比為1∶4),再將溶液置于37 ℃環境中,即可獲得酸解離溫敏性嵌段聚合物水凝膠。

1.2.3 材料表征

材料的1H NMR結果由Agilent VNMRS600光譜儀記錄,使用氘代DMSO作為溶劑;Zeiss Supra 40型SEM用于研究水凝膠的微觀結構;聚合物的數均分子量和多分散性采用Agilent PL-GPC 50型GPC測量;儲能G′、損耗模量G″和黏度在配備20 mm平行板配置的Anton Paar MCR302 流變儀上進行。

1.2.4 水凝膠溫敏性和酸解離性

室溫下,取400 μL配置好的POP溶液于3 mL玻璃瓶中,然后將其置于37 ℃恒溫培養箱,使其成膠。30 min后,向內滴加3滴微酸性去離子水(pH=5.5),在預定時間內(0、12、24、48、72 h)取出拍照,并使用SEM記錄水凝膠的微觀特征。

1.2.5 載藥水凝膠的體外藥物釋放研究

精密稱取適量的Dox溶于PBS(pH=7.4)中,使用島津UV-2600光譜儀記錄Dox的紫外可見光譜,在最佳波長(480 nm)下讀取吸光度值并制作Dox的標準曲線。水凝膠的藥物釋放是在不同pH值下進行的,過程如下:精密稱取適量的Dox,配置成Dox質量濃度為1 mg/mL的POP溶液。取300 μL POP溶液封于透析袋并將其浸入載有10 mL不同pH值(pH=5.5、6.5、7.4)的釋放介質(PBS)中,然后放入37 ℃恒溫振蕩培養箱(轉速為120 r/min)中;在預定的時間(1、2、4、6、12、24、36、48、60、72 h)取出2 mL釋放介質,并隨即添加相同體積的新鮮介質,使用紫外可見光譜儀記錄在波長480 nm處各時間點Dox的吸光度值,再根據Dox的標準曲線計算各時間點對應的質量濃度。每組實驗重復3次。Dox的累積釋放率(Q)的計算公式為:

Q=(10ρr+2ρr-1)/30%

(1)

其中:ρr為該時間點測量的質量濃度;ρr-1為上一個時間點測量的質量濃度。

1.2.6 水凝膠安全性

將0.1 mL POP溶液經皮下注射到小鼠的背部,第15天處死小鼠,通過組織學分析來評估水凝膠對主要器官(心、肝、脾、肺、腎)的潛在毒性。

所有動物研究均按照實驗方案進行,所有相關實驗均經安徽醫科大學動物護理和使用機構委員會(IACUC)批準(LLSC20150134)。

1.2.7 載藥水凝膠對腫瘤的抑制

為了建立小鼠背部腫瘤模型,將2.0×106HepG2細胞經皮下注射到小鼠背部,喂食2周后,腫瘤體積約為100 mm3。實驗分為3組(n=5),分別為POP水凝膠、Dox溶液、POP-Dox復合水凝膠。其中Dox的質量濃度為1 mg/mL。將水凝膠經皮下注射到腫瘤部位,純Dox溶液經尾靜脈注射到小鼠體內。第7天處死小鼠取出腫瘤,通過蘇木精-伊紅染色法(hematoxylin-eosin staining,H&E)來評估藥物對腫瘤的抑制程度。

1.2.8 統計學分析

使用Origin Pro 8.0軟件分析平均值和標準差。

2 結果與討論

2.1 POP聚合物的結構分析

q1和q2的合成可參考文獻[13]。POP聚合物合成中各步反應產物的1H NMR譜圖如圖2所示。

從圖2a可以看出,化學位移在5.78×10-6～5.82×10-6處為原酸酯基團的特征峰,化學位移在3.48×10-6～3.61×10-6處出現的峰是q3中PEG段亞甲基的特征峰。

圖2 POP聚合物合成中各步反應產物的1H-NMR譜圖

從圖2b可以看出,將RAFT聚合的鏈轉移基團雙硫酯鍵引入到q3中,化學位移在7.03×10-6～8.20×10-6處是CTA-NHS中苯環的特征峰。從圖2c可以看出,化學位移在1.02×10-6、1.35×10-6～1.63×10-6、1.94×10-6～2.05×10-6、3.82×10-6處均是PNIPAM的質子信號峰,表明成功將NIPAM聚合到分子鏈中,從而合成目標產物POP聚合物。同時結合GPC數據(Mn=33 343,聚合物分散性指數(polymer dispersity index,PDI)為1.19,從而確定了POP聚合物的結構式為(聚(N-異丙基丙烯酰胺130)-原酸酯-聚乙二醇90-原酸酯-聚(N-異丙基丙烯酰胺130)。

2.2 POP水凝膠溫敏性行為分析

N-異丙基丙烯酰胺(NIPAM)具有溫敏性,當溫度升高時,POP聚合物分子中的PNIPAM鏈逐漸轉變為疏水性物質。同時,PEG鏈作為親水性物質,聚合物鏈在水溶液中形成膠束聚集體,進而形成水凝膠。通過對水凝膠流變學性質的測定,探討了水凝膠的溫敏性。溫敏性結果如圖3、圖4所示。

圖3 熱成膠形貌

從圖3a可以看出,當溫度從17.4 ℃升高到27.2 ℃,POP溶液從溶液變成凝膠,微觀形貌為典型的孔道結構(圖3b)。

從圖4a可以看出,26 ℃前G″大于G′,26 ℃后G′大于G″,表明POP水凝膠的最低成膠溫度約為26 ℃,低于人體體溫(37 ℃)。

從圖4b可以看出,剪切速率越大,POP溶液的黏度越小,表明POP水凝膠具有剪切變稀特性。

圖4 POP水凝膠流變學性質

以上結果表明,POP溶液可以注射到人體內,并響應人體溫度從而變成水凝膠固體植入物。

2.3 POP水凝膠的酸解離行為分析

水凝膠的酸解離結果如圖5所示,從圖5a可以看出,水凝膠在12 h已經發生部分解離,但凝膠結構基本保存,72 h基本解離完全,變成了懸濁液。從圖5b可以看出,POP水凝膠三維網絡在12 h僅發生部分崩塌,72 h完全崩塌。結果表明,在酸性環境中,由于聚合物鏈中的原酸酯鍵發生斷裂,從而導致凝膠網絡結構被破壞,水凝膠發生解離。

圖5 POP水凝膠在不同時間點的酸解離結果

2.4 載藥水凝膠的體外釋放行為分析

體外的藥物釋放結果如圖6所示,從圖6可以看出,在pH=5.5的環境中水凝膠中藥物的釋放速度最快,72 h釋放率為67.5%;其次是在pH=6.5的環境中,72 h釋放了50.2%;在pH=7.4的環境中釋放速度最慢,72 h的釋放率為38%,僅有pH=5.5的環境中釋放量的1/2左右。

結果表明,藥物在水凝膠中的釋放具有很強的pH值依賴性,環境的pH值越低,藥物釋放的速度越快,說明POP水凝膠對Dox具有良好的穩定持久釋放作用。

圖6 POP-Dox水凝膠的體外藥物釋放曲線

2.5 POP水凝膠的生物安全性評價

器官切片的H&E染色結果如圖7所示。由圖7可知,將POP水凝膠注射入小鼠皮15 d后,小鼠的主要器官均未發現明顯的病理性異常,表明POP水凝膠具有良好的生物安全性,可用于生物應用。

圖7 小鼠主要器官的H&E染色圖像

2.6 載藥水凝膠對腫瘤的治療效果分析

腫瘤組織切片的H&E染色結果如圖8所示。

圖8 HepG2腫瘤的體內抑制效果

從圖8a可以看出,經POP-Dox水凝膠處理后,腫瘤組織中出現的凋亡細胞面積最大,相比之下,Dox治療組表現出較弱的誘導細胞凋亡的能力,而POP水凝膠治療組基本未發生細胞凋亡。從圖8b可以看出,POP-Dox水凝膠治療組的腫瘤凋亡面積(約68.9%)明顯大于Dox治療組(約27.6%)和POP治療組(幾乎無效果)。結果表明,POP水凝膠可以響應腫瘤的微酸環境而發生解離,從而穩定持久釋放藥物、抑制腫瘤,是一種良好的藥物載體。

3 結 論

本研究合成了一種酸解離溫敏性嵌段聚合物水凝膠POP,POP水凝膠具有良好的酸解離性和溫度敏感性,可作為藥物的載體,實現藥物的穩定持久釋放。與此同時,POP水凝膠具有良好的生物安全性,對腫瘤的微酸環境具有良好的響應性,可以作為化療藥物載體治療腫瘤。因此,本研究成果有望提高化療藥物的生物利用度,并為其臨床廣泛應用提供理論和實驗依據。