四磨湯對功能性消化不良大鼠CNP/NPR-B/cGMP信號通路的影響

周賽男，藺曉源，陳思清，周姝，韓運宗，劉琴，符佳

〔摘要〕 目的 通過研究四磨湯對功能性消化不良（functional dyspepsia， FD）模型大鼠CNP/NPR-B/cGMP信號通路的影響，進一步探討其作用機制。方法 將Wistar大鼠隨機分為對照組、模型組、低濃度四磨湯組、中濃度四磨湯組、高濃度四磨湯組以及莫沙必利組。參考文獻中的方法使用夾尾刺激聯合不規則飲食14 d制備FD大鼠模型。造模結束后，四磨湯低、中、高濃度組大鼠分別灌胃1.8、2.4、3.6 g/（kg·d）劑量的四磨湯藥液，莫沙必利組灌胃0.305 mg/（kg·d）劑量的莫沙必利藥液，對照組和模型組給予等體積蒸餾水，給藥14 d。觀測大鼠體質量變化；酚紅法檢測大鼠胃排空率；碳粉法檢測大鼠小腸推進率；ELISA法檢測血清中胃動素（motilin， MTL）、胃泌素（gastrin， GAS）、胃竇平滑肌C型利鈉肽（C-type natriuretic peptide， CNP）、環磷酸鳥苷（cyclic guanosine monophosphate， cGMP）的含量；RT-qPCR和Western blot分別檢測胃竇平滑肌CNP、B型尿鈉肽受體（type B urinary natriuretic peptide receptor， NPR-B）的基因和蛋白表達。結果 與對照組比較，模型組大鼠體質量降低（P<0.05），胃排空率與小腸推進率明顯減弱（P<0.05），血清MTL、GAS含量降低（P<0.05），胃竇平滑肌CNP、cGMP含量升高（P<0.05），CNP、NPR-B的mRNA和蛋白表達增加（P<0.05）。與模型組相比，四磨湯各劑量組大鼠體質量顯著增加（P<0.05），胃排空率和小腸推進率顯著提高（P<0.05），血清MTL和GAS含量顯著增加（P<0.05），胃竇平滑肌CNP、cGMP含量降低（P<0.05），CNP、NPR-B的mRNA和蛋白表達降低（P<0.05）。結論 四磨湯通過抑制CNP/NPR-B/cGMP信號通路以促進胃腸動力可能是其治療FD的作用機制之一。

〔關鍵詞〕 功能性消化不良；四磨湯；CNP/NPR-B/cGMP信號通路；大鼠；胃排空率；小腸推進率

〔中圖分類號〕R285.5? ? ? ?〔文獻標志碼〕A? ? ? ? 〔文章編號〕doi：10.3969/j.issn.1674－070X.２０23.07.003

Effects of Simo Decoction on CNP/NPR-B/cGMP signaling pathway in

rats with functional dyspepsia

ZHOU Sainan1， LIN Xiaoyuan1， CHEN Siqing2， ZHOU Shu2， HAN Yunzong2， LIU Qin2， FU Jia1*

1. The First Hospital of Hunan University of Chinese Medicine， Changsha， Hunan 410007， China;

2. Hunan University of Chinese Medicine， Changsha， Hunan 410208， China

〔Ａｂｓｔｒａｃｔ〕 Objective To investigate the effects of Simo Decoction on CNP/NPR-B/cGMP signaling pathway in rats of functional dyspepsia （FD） model， so as to further explore its mechanism of action. Methods Wistar rats were randomly divided into control group， model group， mosapride group， low-， medium-， and high-dose Simo Decoction groups. The FD rat model was established by tail-clipping stimulation combined with irregular diet for 14 d. After modeling， the rats in low-， medium-， and high-dose Simo Decoction groups were intragastrically administered with 1.8， 2.4， and 3.6 g/（kg·d） Simo Decoction， respectively. Mosapride group was received 0.305 mg/（kg·d） mosapride solution by gavage， while control and model groups were given an equal volume of distilled water， and all the administration lasted for 14 d. The changes in body weight of the rats were observed; the gastric emptying rate was measured by the phenol red method; the small intestinal propulsive rate was measured by the carbon powder method; the levels of motilin （MTL）， gastrin （GAS）， C-type natriuretic peptid （CNP）， and cyclic guanosine monophosphate （cGMP） in serum were determined by ELISA; the gene and protein expressions of CNP and Type B urinary natriuretic peptide receptor （NPR-B） in gastric antrum smooth muscle were examined by RT-qPCR and Western blot， respectively. Results Compared with control group， the rats in model group showed a decrease in body weight （P<0.05）， significantly decreased gastric emptying and small intestinal propulsive rates （P<0.05）， lower MTL and GAS levels in serum （P<0.05）， higher CNP and cGMP levels in gastric antrum smooth muscle （P<0.05）， and increased mRNA and protein expressions of CNP and NPR-B （P<0.05）. Compared with model group， the body weight， gastric emptying rate， small intestinal propulsive rate， and the levels of MTL and GAS in serum in Simo Decoction groups were significantly higher （P<0.05）， while the levels of CNP and cGMP in gastric antrum smooth muscle and mRNA and protein expressions of CNP and NPR-B were lower （P<0.05）. Conclusion Simo Decoction may exert its therapeutic effects on FD by inhibiting CNP/NPR-B/cGMP signaling pathway and promoting gastrointestinal motility.

〔Ｋｅｙｗｏｒｄｓ〕 functional dyspepsia; Simo Decoction; CNP/NPR-B/cGMP signaling pathway; rats; gastric emptying rate; small intestinal propulsive rate

功能性消化不良（functional dyspepsia， FD）是生活中比較常見的功能性胃腸疾病之一，通常與食物攝入有關[1]。有統計發現，FD全球綜合患病率為21.8%，近年來呈上升趨勢[2]?，F階段，國內外對FD發病機制的認識還不統一，一般認為是多種因素綜合作用的結果。如胃腸動力出現功能性障礙、內臟神經敏感性升高、感染幽門螺桿菌及精神壓力增大等，導致病發核心環節腦腸軸功能發生紊亂，胃腸激素分泌異常，繼而引起FD癥狀[3-5]。利尿鈉肽（natriuretic peptide， NP）家族中的C型利尿鈉肽（CNP）主要存在于血管內皮細胞中，涉及血管平滑肌的松弛以及細胞增殖和遷移的調節等功能[6]。研究顯示，CNP通過細胞外液傳遞，可以作用于胃腸道平滑肌上的B型利尿肽受體（type B urinary peptide receptor， NPR-B），并與之結合，導致環磷酸鳥苷（cyclic guanosine mono？鄄phosphate， cGMP）含量提升，進而激活CNP/NPR-B/cGMP通路，促進平滑肌舒張[7-9]。CNP/NPR-B/cGMP信號通路狀態的改變，與胃腸道運功失調以及FD有著密切的聯系[10]。

針對FD，現代醫學治療多以質子泵抑制劑、組胺2受體拮抗劑、促動力劑和中樞神經調節劑等藥物進行干預[2]，療效顯著，毒副作用同樣明顯，如質子泵抑制劑與組胺2受體拮抗劑等藥物，長期使用會抑制胃酸產生，引發維生素B12吸收不良[11]。此外，部分人會產生頭痛、腹脹、惡心等現象[12]。以辨證論治理念為主的中醫學，在治療FD時有著獨特的效果，毒副作用弱，效果明顯[13-15]。中醫學上將FD辨證分為肝脾氣滯證、肝郁脾虛證、脾胃虛寒證、肝胃不和證、寒熱錯雜證和脾胃濕熱證等多種證型[16]。FD與肝、脾密切相關，肝氣郁結會導致脾胃升降失司，從而導致脾胃運動功能失調，導致FD肝脾氣滯證的發生，因此，肝脾氣滯證是FD的一個重要分型[17]。

四磨湯是治療肝脾氣滯證FD的一種常用中成藥[18-20]，最早出自《嚴氏濟生方》，由人參、烏藥、檳榔、沉香組成，有破氣降逆的功效，用于治療FD作用確切，效果明顯[14]，但機制不明。因此，為了進一步明確四磨湯治療FD的作用靶點，本研究通過復制肝脾氣滯證FD大鼠模型，觀察四磨湯對胃動素（motilin， MTL）、胃泌素（gastrin， GAS）及CNP/NPR-B/cGMP信號通路的影響，現報道如下。

1 材料

1.1? 動物

從湖南斯萊克景達實驗動物有限公司購買42只SPF級Wistar大鼠（體質量180～220 g）。適應性飼養1周，飼養條件：溫度22 ℃、濕度50%～60%，所有大鼠自由飲食、飲水。本研究經湖南中醫藥大學第一附屬醫院動物倫理委員會批準（審批號：ZYFY20201015），實驗動物使用許可證號：SCXK（湘）2019-0004。

1.2? 藥物

四磨湯中藥飲片：人參6 g、烏藥6 g、檳榔9 g、沉香6 g，均購自湖南中醫藥大學第一附屬醫院中藥房，經鑒定符合《中華人民共和國藥典》標準，按傳統方法煎煮濃縮成高、中、低不同濃度的藥液備用。莫沙必利：片劑，5 mg/片（江蘇豪森藥業集團有限公司，生產批號：124220502）。

1.3? 主要試劑與儀器

瓊脂糖（西班牙BIOWEST，批號：111860）；mRNA逆轉錄試劑盒（北京康為世紀生物科技有限公司，批號：CW2569）；NPR-B Rabbit Antibody （55113-1-AP）、山羊抗小鼠二抗（批號：SA00001-1）、山羊抗兔二抗（批號：SA00001-2）均購自美國Proteintech公司；胃動素motilin， MTL，批號：CSB-E08208r）、胃泌素（gastrin， GAS，批號：CSB-E12743r）均購自武漢華美生物工程有限公司；cGMP（批號：ml003133）、NPR-B（批號：ml003270）均購自上海酶聯生物科技有限公司。

2 方法

2.1? 分組與模型制備

將Wistar大鼠隨機選取7只作為對照組，其余實驗組大鼠均參照文獻[21-22]中的方法復制肝脾氣滯證FD模型：每天（7：00、10：00、13：00、16：00）于大鼠尾巴遠端三分之一處用鼠夾夾住，力度適中，避免破皮，每次刺激大鼠約0.5 h。實驗期間，大鼠正常飲水，隔日禁食，持續14 d。將造模處理過的大鼠隨機分為模型組、低濃度四磨湯組、中濃度四磨湯組、高濃度四磨湯組、莫沙必利組，每組7只。通過大鼠行為學、胃排空率及小腸推進率判斷是否造模成功[21-23]。

2.2? 給藥與取材

從第15天開始動物給藥，給藥劑量以成人每天用量按體表面積法[24]換算成大鼠的等效劑量，四磨湯低、中、高濃度組大鼠分別灌胃1.8、2.4、3.6 g/（kg·d）劑量的四磨湯藥液，莫沙必利組灌胃0.305 mg/（kg·d）劑量的莫沙必利藥液，每天灌胃1次，灌胃容積均為1 mL/100 g體質量。對照組和模型組予以等劑量蒸餾水灌胃，連續14 d。禁食24 h后末次給藥，給藥1 h后灌胃胃排空和小腸推進試驗所用溶液，0.5 h后用3%戊巴比妥鈉5 mL/kg腹腔注射麻醉，麻醉完成后剖開腹腔，肝門靜脈取血，將全血標本置于室溫靜置2 h后于4 ℃ 3000 r/min離心15 min，離心半徑為9 cm，吸取上清液，于-80 ℃條件下保存。隨后進行胃排空和小腸推進試驗，然后漂洗胃竇組織，一部分放入多聚甲醛中固定，另一部分生理鹽水漂洗后放于液氮中速凍5 min，隨后于-80 ℃冰箱中保存。

2.3? 指標檢測

2.3.1? 一般狀態觀察? 在整個實驗期間，定期觀察大鼠狀態，記錄體質量變化，根據體質量計算大鼠的增重。

2.3.2? 胃排空率和小腸推進率測定[25]? 每組大鼠隨機挑選3只，使用酚紅-甲基纖維素溶液2 mL （25 mg酚紅溶入50 mL 1.5%甲基纖維素溶液中）灌胃，0.5 h之后麻醉大鼠，剖開腹部，捆扎幽門和胃賁門，取出完整鼠胃，然后沿胃大彎將胃剖開，使用蒸餾水對鼠胃內容物進行沖洗，并將沖洗液定容至20 mL。再加入等體積0.5 mol/L NaOH溶液，混勻，放置1 h。取5 mL上清液，加入0.5 mL 20%三氯乙酸，于3 500 r/min，離心半徑為9 cm，離心10 min，取上清液，用分光光度計測定其吸光度（A）。另取10%酚紅-甲基纖維素溶液2 mL，依次加入18 mL蒸餾水、20 mL 0.5 mol/L NaOH溶液，以及4 mL 20%三氯乙酸混合均勻，測定吸光度（A）。大鼠胃排空率=（1-實測酚紅A/標準酚紅A值）×100％。各組剩余的4只大鼠禁食24 h后，按照1 mL/100 g體質量用量，使用炭粉混懸液（10%活性炭+10%阿拉伯膠）灌胃，0.5 h之后麻醉大鼠，剖開腹腔，用鑷子取出整個小腸，于托盤上緩緩拉直，再用直尺測量幽門至回盲部的腸管的小腸推進指標，小腸推進率=炭粉前端至幽門括約肌距離（cm）/幽門括約肌至小腸末端距離（cm）×100%。

2.3.3? HE染色? 將胃黏膜組織進行石蠟包埋并切片，然后放入60 ℃下烤片12 h。在二甲苯中浸泡3次，每次20 min。隨后，分別在100%、100%、95%、85%、75%乙醇溶液中浸泡5 min，并用蒸餾水洗滌5 min。將切片先用蘇木素染色3 min，用PBS洗滌再返藍。接著再用伊紅染色3 min，再次用蒸餾水洗滌。最后將切片放入梯度乙醇（95%～100%）中進行脫水，每個梯度濃度的乙醇持續5 min。脫水后，連續兩次放入二甲苯中10 min清洗，最后用中性樹膠包埋，并在顯微鏡下觀察。

2.3.4? ELISA檢測血清中MTL、GAS和胃竇組織中CNP、cGMP的含量? 取出-80 ℃血清消融，采用ELISA法檢測大鼠血清中MTL、GAS的濃度。取小部分胃竇平滑肌樣本消融，用1×PBS將殘留在樣本上血污洗去，剪成小塊放，再加入1×PBS，勻漿，反復消融勻漿液，然后過夜，次日2～8 ℃ 5 000 r/min，離心5 min，離心半徑為9 cm，取上清液待測。采用ELISA檢測試劑盒檢測大鼠胃竇平滑肌CNP與cGMP的含量。具體步驟按照ELISA試劑盒說明書進行。

2.3.5? RT-qPCR法檢測各組胃竇組織CNP、NPR-B的mRNA表達? Trizol法提取胃竇平滑肌組織RNA，根據Trizol試劑盒的指示提取組織中的總RNA。取5 ？滋L提取的總RNA和1 ？滋L的loading buffer進行瓊脂糖凝膠電泳，以檢測RNA質量，以紫外分光光度計測量RNA濃度。根據RNA反轉錄試劑盒的指示，將mRNA轉錄成cDNA。使用實時熒光定量PCR檢測目的基因，內參為GAPDH。在NCBI上搜索目的基因的序列，運用Primer 5軟件設計引物，并由上海生工合成，具體引物序列如表1所示。RT-qPCR擴增程序設定為：95 ℃下預變性10 min，95 ℃下變性15 s，65 ℃下退火延伸30 s，進行40個循環。在反應結束后，降至4 ℃，停止反應并保證RT-qPCR產物的穩定。進行RT-qPCR測量以獲得每個樣本的平均CT值。最后用2-？葒？葒CT法計算基因相對表達量。

2.3.6? Western blot法檢測各組胃竇組織CNP、NPR-B蛋白的表達? 首先，將胃竇平滑肌組織置于EP管中，用RIPA裂解液提取樣本中的總蛋白，BCA蛋白定量試劑盒測定蛋白濃度。蛋白變性后電泳，轉膜，封閉。使用一抗CNP（1∶5 000）、NPR-B（1∶1 000）孵育，4 ℃過夜，次日洗3次，每次15 min。GAPDH（1∶2 000）為內參。緊接著，使用二抗HRP-goat anti-mouse IgG（1∶5 000）或者HRP goat anti-rabbit IgG（1∶6 000）對樣本進行孵育。80 min后，孵育結束，將樣本洗3次，每次10 min。將樣本置入化學發光成像系統成像，之后用Quantity One軟件對條帶進行灰度分析。

2.4? 統計學方法

使用SPSS 26.0軟件進行統計學分析處理，本研究數據均符合正態分布則以“ｘ±s”表示，方差齊時多組間數據比較用方差分析，兩兩比較使用LSD檢驗，方差不齊則使用Tamhane's 檢驗。P<0.05表示差異有統計學意義。

3 結果

3.1? 四磨湯對FD大鼠增重、胃排空及小腸推進的影響

模型組大鼠第14天的增重、胃排空率以及小腸推進率相對于對照組大鼠均顯著下降（P<0.05）；與模型組相比，四磨湯各劑量組大鼠體質量增加明顯（P<0.05），胃排空率與小腸推進率明顯增加（P<0.05），其中以高濃度四磨湯組最為顯著。莫沙必利組與高濃度四磨湯組的作用效果相似。詳見圖1。

3.2? HE染色對FD大鼠胃黏膜組織形態的影響

對照組細胞排列整齊，組織平整。與對照組相比，模型組大鼠的絨毛上皮糜爛，有炎性細胞浸潤，黏膜增厚。四磨湯各劑量組大鼠胃黏膜組織形態有所恢復。隨著四磨湯濃度增加，胃黏膜層的上皮細胞逐漸恢復正常形態，絨毛上皮糜爛程度減小，炎性細胞浸潤減少，黏膜厚度有所恢復。詳見圖2。

3.3? 四磨湯對FD大鼠血清中MTL、GAS和胃竇組織中CNP、cGMP含量的影響

與對照組相比，模型組大鼠血清MTL與GAS的含量降低（P<0.05）、CNP與cGMP含量升高（P<0.05）；與模型組相比，四磨湯各劑量組大鼠血清MTL與GAS含量上升（P<0.05）、CNP與cGMP含量降低，均為高濃度四磨湯組變化最為顯著，且莫沙必利組與高濃度四磨湯組的作用效果接近。詳見圖3。

3.4? 四磨湯對FD大鼠胃竇組織CNP、NPR-B mRNA表達的影響

與對照組相比，模型組CNP及NPR-B的mRNA表達升高（P<0.05）；與模型組相比，四磨湯各劑量組CNP及NPR-B mRNA表達降低（P<0.05），其中高濃度四磨湯組CNP及NPR-B mRNA含量最低，趨近于莫沙必利組。詳見圖4—6。

3.5? 四磨湯對FD大鼠胃竇組織CNP、NPR-B蛋白表達的影響

與對照組比較，模型組的CNP、NPR-B蛋白的表達升高（P<0.05）；與模型組比較，四磨湯各劑量組CNP、NPR-B蛋白的表達降低（P<0.05），其中高濃度四磨湯組CNP、NPR-B蛋白的表達最低，干預效果趨近莫沙必利。詳見圖7。

4 討論

FD是一種慢性胃腸道疾病，目前暫無有效的治愈方法，只能通過藥物治療、飲食療法、定期鍛煉等手段緩解FD的癥狀[26]。FD極大地影響了人們的生活質量和社會功能，因此，通過治病求本的傳統中醫藥方式治療FD極其重要。近年來，西醫將FD按癥狀分類為胃脘痛綜合征和餐后窘迫綜合征[27]。目前，FD中醫證型分類有多種，肝脾氣滯證是其主要證型之一，臨床上常用四磨湯治療肝脾氣滯證FD，效果明顯[6，18，20]，但其具體作用機制仍不明確，因此，進一步研究肝脾氣滯證FD的發病機制具有重要意義。經典方劑四磨湯治療胃腸道疾病已有數百年歷史，全方消補并用，以恢復氣機和諧有序為本[28-29]。方劑中的一些單體成分，如檳榔堿、橙皮苷等已被證實為影響胃腸功能的高效成分[30-31]。本實驗采用夾尾刺激法造模，造成大鼠進食減少，不思飲食，甚至厭食等消化不良狀態；加以不規則飲食干預，使大鼠胃腸道功能失常，出現對外來刺激反應遲鈍，不活躍，糞便松軟，被毛枯黃、發暗、蓬松，體質量增長速度較對照組明顯下降等癥狀，與肝脾氣滯證FD的疾病狀態一致，很好地模擬了中醫肝脾氣滯證FD疾病狀態。研究表明，四磨湯在增強慢性應激小鼠的胃腸動力、MTL和膽囊收縮素的表達上有很好的效果[32]。因此，采用低、中、高濃度的四磨湯對模型大鼠進行灌胃處理，并且將莫沙必利作為陽性對照品。

CNP屬于NP的重要成員之一，屬于最早于豬腦組織中被分離出來的、有活性的多肽類激素[33]。人們在軟骨細胞和內皮細胞中發現了高表達的CNP，心血管系統內的其他細胞，包括心肌細胞和成纖維細胞也產生CNP[34]。人們對CNP的關注點主要在于其作為心臟和心血管的旁分泌介質來發揮調節作用[34-35]。近年來，發現胃腸道等器官也有一定量表達[36-37]。利尿鈉肽受體（natriuretic peptide receptor， NPR）是一種酶聯受體，對細胞內第二信使cGMP的活性有調節作用[9]。有文獻報道，CNP可以通過結合NPR-B，促進cGMP的表達，以高度復雜的方式進一步激活下游通路，促進平滑肌舒張松弛[7-8，38]。據此本研究提出假設，肝脾氣滯證FD發病機制與CNP/NPR-B/cGMP信號通路發生改變有關。在本研究中，與對照組比較肝脾氣滯證FD模型組大鼠體質量增加受到了抑制，并且小腸推進能力和胃排空能力也明顯減弱，表明FD大鼠模型造模成功。此外，大鼠血清中MTL、GAS含量降低，胃竇平滑肌組織中CNP、cGMP、NPR-B的表達水平升高，結果佐證提出的假設：肝脾氣滯證FD的發病機制與CNP/NPR-B/cGMP信號通路有關，調節該通路可能是改善肝脾氣滯證FD的有效方法之一。

本研究結果顯示，與模型組比較，四磨湯各組大鼠增重明顯，其中高濃度四磨湯組增重最為顯著。與模型組大鼠相比，四磨湯各組大鼠胃排空及小腸推進能力均明顯提升，而血清中MTL、GAS含量升高，胃竇平滑肌組織中CNP、cGMP、NPR-B的水平降低，且所有檢測中，以高濃度四磨湯效果最為顯著，與莫沙必利的作用效果類似。說明四磨湯可能通過調節CNP/NPR-B/cGMP信號通路使肝脾氣滯證FD基本恢復正常。

綜上所述，使用四磨湯干預，能抑制CNP表達，影響NPR-B翻譯，從而降低cGMP水平，表明四磨湯可能通過CNP/NPR-B/cGMP信號通路緩解大鼠的肝脾氣滯證FD。

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（本文編輯? 蘇? 維）