甘薯細(xì)胞色素P450單加氧酶基因IbCYP714E1和IbCYP714E2的鑒定及表達(dá)分析

何敏紅,江夢(mèng)真,陳善蘭,孫宗建,朱宏波

(廣東海洋大學(xué) 濱海農(nóng)業(yè)學(xué)院,廣東湛江 524088)

赤霉素(GAs)是重要的植物激素,在調(diào)控植物莖伸長(zhǎng)、葉片擴(kuò)張、開(kāi)花、種子發(fā)芽和發(fā)育等各個(gè)方面都發(fā)揮著重要的作用[1-7]。關(guān)于植物赤霉素合成、代謝及信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)的機(jī)制研究已經(jīng)非常深入,相關(guān)基因在水稻、擬南芥等植物中已經(jīng)被克隆[8-10]。高等植物通過(guò)控制GA的生物合成、失活和信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)來(lái)調(diào)節(jié)活性GA水平。活性赤霉素(如GA1和GA4)的生物合成起始于牻牛兒基牻牛兒基焦磷酸(GGPP),由3種類(lèi)型的酶催化,分別是萜烯合成酶(TPSs)、細(xì)胞色素P450單加氧酶(P450s)和2-酮戊二酸依賴雙加氧酶(20DDs)。赤霉素(GAs)的失活涉及幾個(gè)不同的機(jī)制:GA2氧化酶(GA2ox)可以將活性GAs(GA1和GA4)及其前體(GA20和GA9)的C-2位羥基化[9,11-12];水稻Eui基因編碼的細(xì)胞色素P450單加氧酶OsCYP714D1可以通過(guò)16α,17-環(huán)氧化,使非C 13-羥基化的GAs(GA4、GA9和GA12)失活[13];擬南芥中,AtCYP714A1和AtCYP714A2蛋白被證明具有與水稻CYP714D1蛋白相同的功能[14],在毛白楊中,PtCYP714A3蛋白除了具備失活赤霉素的功能外,還同時(shí)參與植物對(duì)鹽脅迫的響應(yīng)[15];水稻的另外2個(gè)CYP714基因家族成員OsCYP714B1和OsCYP714B2編碼 GA13氧化酶,能夠?qū)A12的C-13位羥基化,是植物活性赤霉素失活的另外途徑[16]。

甘薯[Ipomoeabatatas(L.) Lam.]屬于旋花科甘薯屬,具有耐貧瘠、抗性強(qiáng)、高產(chǎn)穩(wěn)產(chǎn)、營(yíng)養(yǎng)豐富等特性,是世界上重要的糧食、飼料、工業(yè)原材料作物。甘薯基因組測(cè)序工作的完成,為甘薯基因克隆和功能驗(yàn)證研究提供了方便[17-20]。CYP714基因家族方面的研究主要集中在擬南芥、水稻和毛白楊等植物中,在其他植物中很少有報(bào)道。本研究利用甘薯基因組和轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù),鑒定了2個(gè)CYP714基因,分別定名為IbCYP714E1和IbCYP714E2,對(duì)其進(jìn)行了生物信息學(xué)分析,并通過(guò)實(shí)時(shí)定量PCR技術(shù)對(duì)2個(gè)基因在甘薯不同組織和不同非生物脅迫處理下的表達(dá)進(jìn)行研究。本研究為探索甘薯CYP714基因在參與赤霉素代謝和抗性機(jī)制方面提供了理論依據(jù)。

1 材料和方法

1.1 試驗(yàn)材料

試驗(yàn)材料為甘薯[Ipomoeabatatas(L.) Lam.]品種‘濟(jì)薯26’,分別于扦插后2個(gè)星期取葉(leaves,L)、莖(stem,S)、莖尖(stem tip,ST)和初生根(primary root,PrR),于扦插2個(gè)月后取花(flower,F)、果實(shí)(fruit,FR)、塊根(tuberous root,TR)、柴根(pencil root,PR)。干旱和鹽脅迫處理采取Hoagland營(yíng)養(yǎng)液水培的方式種植培養(yǎng),鹽脅迫處理為200 mmol/L氯化鈉(NaCl)、干旱脅迫處理為250 mmol/L甘露醇,處理時(shí)間為6 h和30 h,以Hoagland全營(yíng)養(yǎng)液培養(yǎng)作為對(duì)照組(CK),取樣部位為初生根,每個(gè)處理3次重復(fù),液氮冷凍后-80 ℃冰箱保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1IbCYP714基因的鑒定及理化性質(zhì)分析在甘薯基因組數(shù)據(jù)庫(kù)(https://sweetpotao.com)獲得的‘泰中6號(hào)’(I.batatas‘Taizhong 6’)基因組數(shù)據(jù)以及‘廣薯87’全長(zhǎng)轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)作為參考基因組進(jìn)行比對(duì)及后續(xù)分析。以擬南芥CYP714蛋白序列為參考,利用TBtools軟件中的BLAST程序從甘薯基因組搜索IbCYP714基因。同時(shí)利用獲得的IbCYP714基因的氨基酸序列對(duì)其進(jìn)行后續(xù)的理化性質(zhì)分析。使用Expasy(https://web.expasy.org/protparam/)在線工具對(duì)IbCYP714蛋白分子量、等電點(diǎn)、親水性等理化性質(zhì)進(jìn)行預(yù)測(cè)和分析。利用Cell-PLoc 2.0 (http://www.csbio.sjtu.edu.cn/bioinf/plant-multi/)進(jìn)行亞細(xì)胞定位預(yù)測(cè)。根據(jù)甘薯基因組GFF注釋信息,使用GSDS在線軟件(http://gsds.gao-lab.org/)分析IbCYP714基因的外顯子和內(nèi)含子結(jié)構(gòu)。

1.2.2 IbCYP714的進(jìn)化分析根據(jù)已獲得的擬南芥、水稻、毛白楊以及甘薯的CYP714氨基酸序列,使用MEGA7.0軟件的ClustaW算法對(duì)擬南芥、水稻、毛白楊和甘薯CYP714氨基酸進(jìn)行序列比對(duì),采用鄰接法(neighbor-joining,NJ),默認(rèn)參數(shù)構(gòu)建進(jìn)化樹(shù)。利用Swiss-Model網(wǎng)站對(duì)甘薯、水稻、擬南芥、毛白楊等CYP714蛋白質(zhì)三級(jí)結(jié)構(gòu)進(jìn)行預(yù)測(cè)。

1.2.3IbCYP714基因啟動(dòng)子分析用Tbtools軟件提取甘薯CYP714基因起始密碼子CDS序列上游2 000 bp區(qū)域作為啟動(dòng)子并提交至在線軟件PlantCARE(http://bioinformatics.psb.ugent.be/webtools/plantcare-/htm1)進(jìn)行IbCYP714基因啟動(dòng)子順式作用元件預(yù)測(cè),對(duì)PlantCare分析結(jié)構(gòu)進(jìn)行篩選簡(jiǎn)化后,用TBtools軟件對(duì)結(jié)果進(jìn)行可視化。

1.2.4IbCYP714基因的表達(dá)分析使用Snapgene軟件設(shè)計(jì)IbCYP714基因的引物,引物序列為IbCYP714E1(5′-GATCTCCAGGAGGCCACTTC-3′,5′-GCCTCTGCGCCTTCAAGAAC-3′)、IbCYP714E2(5′-GAGCCATGGCAAGACAAGTAC-3′,5′-CCGTTGGATGTGAGGATGCC-3′),交由生工生物工程(上海)公司進(jìn)行合成,以ARF(5′-CTTTGCCAAGAAGGAGATGC-3′,5′-TCTTGT-CCTGACCACCAACA-3′)作為內(nèi)參基因進(jìn)行特異性表達(dá)分析。用Trizol法提取總RNA,再利用反轉(zhuǎn)錄盒(vazyme,南京)將RNA反轉(zhuǎn)錄合成cDNA,進(jìn)行熒光定量PCR。采用2-ΔΔCT法[21]處理數(shù)據(jù),每個(gè)樣本技術(shù)重復(fù)3次,基因的相對(duì)表達(dá)量使用(平均值±標(biāo)準(zhǔn)差)表示。

2 結(jié)果與分析

2.1 基因理化性質(zhì)分析

根據(jù)水稻和擬南芥CYP714基因保守序列,從甘薯基因組中鑒定出2個(gè)CYP714基因,定名為IbCYP714E1(OQ184947)和IbCYP714E2(OQ184948),分別位于甘薯第2和第3染色體,內(nèi)含子數(shù)均為4個(gè),開(kāi)放讀碼框?yàn)? 554個(gè)和1 563個(gè)堿基,編碼518個(gè)和521個(gè)氨基酸(圖1和表1)。蛋白質(zhì)理化分析結(jié)果表明:2個(gè)編碼蛋白質(zhì)分子量分別為58 036.42,57 881.43 kD,理論等電點(diǎn)分別為7.18、8.77,均為堿性蛋白,總平均親水性(GRAVY)均為負(fù)值,為親水蛋白,兩蛋白被亞細(xì)胞定位于細(xì)胞質(zhì)中(表1)。

表1 IbCYP714E1和IbCYP714E2基因理化性質(zhì)分析Table 1 Analysis of physicochemical properties of IbCYP714E1 and IbCYP714E2 genes

圖1 IbCYP714E1和IbCYP714E2基因結(jié)構(gòu)分析Fig.1 Structural analysis of IbCYP714E1 and IbCYP714E2 gene

2.2 系統(tǒng)進(jìn)化分析及蛋白質(zhì)三級(jí)結(jié)構(gòu)預(yù)測(cè)

為進(jìn)一步了解該基因蛋白的功能和進(jìn)化特征,使用MEGA 7.0軟件對(duì)甘薯CYP714蛋白與各參考物種CYP714蛋白序列進(jìn)行比對(duì),2個(gè)甘薯CYP714蛋白含有與水稻、擬南芥和毛白楊一致的保守結(jié)構(gòu)域:氧結(jié)合和激活位點(diǎn)、ERR三聯(lián)體基序和Haeme結(jié)合位點(diǎn)(圖2,A)。2個(gè)甘薯CYP714蛋白三級(jí)結(jié)構(gòu)與水稻OsCYP714D1(EUI)和OsCYP714B1蛋白三級(jí)結(jié)構(gòu)相似(圖2,B)。采用鄰接法(neighbor-joining,NJ)構(gòu)建系統(tǒng)進(jìn)化樹(shù)。將甘薯、擬南芥、水稻和毛白楊CYP714蛋白聚為4個(gè)類(lèi)群,2個(gè)甘薯IbCYP714蛋白與3個(gè)毛白楊PtCYP714E2、PtCYP714E4和PtCYP714E5蛋白聚為一個(gè)類(lèi)群(圖3)。

圖2 IbCYP714E1和IbCYP714E2蛋白多序列聯(lián)配及三級(jí)結(jié)構(gòu)預(yù)測(cè)Fig.2 Multi-sequence alignment and tertiary structure of IbCYP714E1 and IbCYP714E2 genes

圖3 IbCYP714E1和IbCYP714E2基因系統(tǒng)進(jìn)化分析Fig.3 Phylogenetic analysis of IbCYP714E1 and IbCYP714E2 genes

2.3 基因啟動(dòng)子順式作用元件分析

通過(guò)對(duì)IbCYP714E1和IbCYP714E2基因啟動(dòng)子序列進(jìn)行順式作用元件預(yù)測(cè),發(fā)現(xiàn)IbCYP714E1和IbCYP714E2基因除了含有通用順式作用元件(CAAT)、核心啟動(dòng)子元件(TATA、TATA-box)外,還含有與光反應(yīng)、植物激素調(diào)控、生物和非生物脅迫及與植物生長(zhǎng)發(fā)育相關(guān)的轉(zhuǎn)錄因子等4種類(lèi)型的順式作用原件,說(shuō)明甘薯CYP714基因可能參與到甘薯的生長(zhǎng)發(fā)育及生物和非生物脅迫的應(yīng)答和調(diào)控(圖4)。

IbCYP714E1和IbCYP714E2基因啟動(dòng)子區(qū)域內(nèi)的激素和逆境相關(guān)元件分布,不同顏色方框代表不同功能的元件。圖4 IbCYP714E1和IbCYP714E2基因啟動(dòng)子順式作用元件分析Distribution of hormone- and stress-related elements in the promoter region of IbCYP714E1 and IbCYP714E2 gene, and different colored boxes represent elements with different functions.Fig.4 Analysis of cis-acting elements of IbCYP714E1 and IbCYP714E2 gene promoter

2.4 IbCYP714E1和IbCYP714E2基因在不同組織和非生物脅迫下的表達(dá)分析

2個(gè)基因在甘薯不同組織中的表達(dá)存在一定的差異,IbCYP714E1基因主要在葉片、柴根和初生根中表達(dá)量較高,而IbCYP714E2基因表達(dá)量較高的組織是柴根和花(圖5)。

不同字母表示0.05水平上存在差異顯著;*表示0.05水平上存在顯著差異,**表示在0.01水平上存在極顯著差異。圖5 IbCYP714E1和IbCYP714E2基因在不同組織和非生物脅迫下的表達(dá)分析Different letters indicate significant difference at the 0.05 level. * indicates significant difference at the 0.05 level, ** indicates highly significant difference at the 0.01 level.Fig.5 Expression analysis of IbCYP714E1 and IbCYP714E2 genes in different tissues and under abiotic stresses

水培條件下對(duì)初生根進(jìn)行非生物脅迫處理,IbCYP714E1基因在干旱和鹽脅迫6 h和30 h表達(dá)量均極顯著高于對(duì)照。

IbCYP714E2基因在干旱脅迫下,2個(gè)時(shí)間段基因的表達(dá)量與對(duì)照沒(méi)有顯著差異,而鹽脅迫下6 h表達(dá)量顯著增加,30 h表達(dá)量與對(duì)照沒(méi)有顯著差異(圖5)。

3 討 論

植物CYP714基因?qū)儆诩?xì)胞色素P450家族中的亞家族成員,在赤霉素代謝過(guò)程中具有重要的作用[22],水稻OsCYP714D1/Eui基因和擬南芥中的AtCYP714A1、AtCYP714A2基因編碼GA 16α,17-環(huán)氧化酶,能夠?qū)A12,GA9和GA4失活[13-14],水稻OsCYP714B1與OsCYP714B1編碼GA13氧化酶,是另外一個(gè)重要的GA失活酶[16],毛白楊中的PtCYP714A3基因在水稻中過(guò)量表達(dá)后,除了降低水稻株高外,還能夠提高水稻的抗鹽能力。本研究鑒定到2個(gè)甘薯CYP714基因IbCYP714E1和IbCYP714E2具備模式植物CYP714基因亞家族的特征序列,啟動(dòng)子分析表明,2個(gè)基因的啟動(dòng)子區(qū)域均具備與光反應(yīng)、植物激素調(diào)控、生物和非生物脅迫等結(jié)合原件,尤其IbCYP714E2基因具備赤霉素響應(yīng)元件,說(shuō)明這兩個(gè)基因可能是甘薯赤霉素代謝的關(guān)鍵基因,同時(shí)可能參與甘薯抗逆性反應(yīng)。

擬南芥中的2個(gè)CYP714基因被證明具有降解赤霉素的功能,基因的表達(dá)在組織上有疊加性和差異性[14],甘薯的2個(gè)CYP714基因也有類(lèi)似結(jié)果,說(shuō)明2個(gè)基因在調(diào)控甘薯赤霉素活性方面存在著一定的分工。IbCYP714E1主要在初生根、柴根和葉片上表達(dá)量較大,而IbCYP714E2主要在柴根和花中表達(dá)量較大,2個(gè)基因在不同類(lèi)型根中的表達(dá)量的差異,說(shuō)明它們?cè)趨⑴c甘薯塊根的分化過(guò)程中可能起到一定作用。2個(gè)基因均能受到干旱和鹽脅迫的誘導(dǎo),與啟動(dòng)子分析的結(jié)果吻合,同時(shí)也說(shuō)明2個(gè)基因參與非生物脅迫的應(yīng)答反應(yīng),這方面的研究與毛白楊PtCYP714A3基因的研究結(jié)果[15]比較接近,說(shuō)明甘薯CYP714基因在非生物脅迫應(yīng)答方面也發(fā)揮一定的作用。關(guān)于甘薯IbCYP714E1和IbCYP714E2基因在甘薯赤霉素代謝及非生物脅迫方面的分子機(jī)制,需要進(jìn)行進(jìn)一步的過(guò)表達(dá)和RNAi等方面的研究,本試驗(yàn)為甘薯赤霉素代謝機(jī)理和生理機(jī)制及相關(guān)性狀分子育種研究提供了理論依據(jù)。