施加外源抗壞血酸促進(jìn)馬鈴薯試管薯形成及其機(jī)制初步研究

雷春霞,葉明旺,李燦輝,龔 明*

(1 云南師范大學(xué) 生命科學(xué)學(xué)院,云南省馬鈴薯生物學(xué)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室,生物能源持續(xù)開發(fā)利用教育部工程研究中心,云南省生物質(zhì)能與環(huán)境生物技術(shù)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室,昆明 650500;2 云南師范大學(xué) 馬鈴薯科學(xué)研究院,云南省馬鈴薯生物學(xué)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室,昆明 650500)

馬鈴薯富含淀粉、蛋白質(zhì)和多種重要營(yíng)養(yǎng)物質(zhì),是世界上最重要的糧食作物之一[1-3]。馬鈴薯的塊莖形成是一個(gè)復(fù)雜的發(fā)育過程,涉及到多重環(huán)境因素與植物激素及信號(hào)分子的互作以及這種互作對(duì)大量關(guān)鍵基因及多條信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)與代謝途徑的調(diào)控。這一過程包括一系列生理生化變化,如內(nèi)源激素組成、含量及其比例的明顯變化、葉片光合速率的提高、同化物輸出的加快、蔗糖和淀粉含量的增加以及匍匐莖頂端特異蛋白的出現(xiàn)等。深入了解馬鈴薯塊莖形成的分子機(jī)理可為今后通過精準(zhǔn)分子育種手段來培育高產(chǎn)優(yōu)質(zhì)的馬鈴薯品種提供借鑒和新思路[4-6]。

馬鈴薯的塊莖形成由4個(gè)連續(xù)階段組成:(1)匍匐莖的形成和生長(zhǎng);(2)隨后頂端區(qū)域彎曲成鉤狀;(3)亞頂端區(qū)域膨大;(4)塊莖生長(zhǎng)[6-7]。在影響馬鈴薯結(jié)薯的因素中,光周期和溫度是最重要的環(huán)境因素,短日照(short days,SDs)和低溫誘導(dǎo)結(jié)薯[8-9]。此外,馬鈴薯塊莖的形成主要受其遺傳特性的控制。在相同的外部環(huán)境中,不同品種的馬鈴薯形成塊莖的能力不同[5]。馬鈴薯植株的發(fā)育階段也是決定塊莖形成的重要因素,它們必須達(dá)到一定的生理年齡才能響應(yīng)誘導(dǎo)塊莖形成的環(huán)境信號(hào)[6,10]。塊莖的形成需要生化途徑和形態(tài)發(fā)生的精確同步,這是由特定的基因表達(dá)和各種信號(hào)分子、特異蛋白、mRNA、miRNAs、植物激素和糖的產(chǎn)生所調(diào)控的[6,10]。參與馬鈴薯塊莖形成過程的關(guān)鍵基因包括Solanumtuberosumself-prunning6A(StSP6A)、Solanumtuberosumself-prunning5G(StSP5G)、SolanumtuberosumCONSTANS(StCO)等[6]。

抗壞血酸(ascorbic acid,AsA),又稱維生素C(vitamin C,VC),是植物細(xì)胞中最豐富的一種多功能非酶抗氧化劑,具有清除多種活性氧(reactive oxygen species,ROS)的巨大潛力,能夠在非逆境和逆境條件下調(diào)節(jié)植物的一些基本功能,如蛋白質(zhì)合成、細(xì)胞生長(zhǎng)和分裂、防御化合物的產(chǎn)生、衰老、活性氧解毒等[11-13]。抗壞血酸在線粒體中合成,然后被運(yùn)輸?shù)街参锏钠渌课籟14-15]。植物細(xì)胞中AsA含量隨生長(zhǎng)條件和發(fā)育階段而變化,其含量的變化可作為一種胞內(nèi)信號(hào)通過調(diào)節(jié)激素信號(hào)通路基因和防御基因的表達(dá)影響植物的生長(zhǎng)發(fā)育和抗逆性[15]。AsA不僅是控制細(xì)胞氧化還原平衡的關(guān)鍵成分,還是參與植物生長(zhǎng)發(fā)育的關(guān)鍵調(diào)控因子[16],但其是否參與馬鈴薯的塊莖形成,目前尚未見報(bào)道。

本文通過外源添加AsA處理研究了其對(duì)馬鈴薯塊莖形成的效應(yīng)及對(duì)10個(gè)結(jié)薯相關(guān)基因表達(dá)的影響,并研究了敲除結(jié)薯關(guān)鍵基因StSP6A對(duì)AsA誘導(dǎo)馬鈴薯結(jié)薯的影響,旨在揭示AsA是否以及如何參與馬鈴薯塊莖的誘導(dǎo)和形成及可能的分子機(jī)制。

1 材料和方法

1.1 材 料

試驗(yàn)材料為來自國(guó)際馬鈴薯中心(International Potato Center,CIP)的2個(gè)二倍體馬鈴薯種質(zhì)材料CIP-149(Solanumphureja)和CIP-178(S.ajanhuiri)及1份四倍體主栽品種合作88(C-88,S.tuberosum),均由云南師范大學(xué)馬鈴薯科學(xué)研究院保存和提供。

材料預(yù)培養(yǎng):所用試驗(yàn)材料為離體培養(yǎng)條件下的馬鈴薯無菌苗,剪取供試材料組培苗的單節(jié)莖段轉(zhuǎn)接到培養(yǎng)瓶(MS+30 g/L蔗糖+8 g/L瓊脂,pH=5.8)中,每個(gè)培養(yǎng)瓶接入10個(gè)單節(jié)莖段,置于(25±2) ℃、600 μmol/(m2·s)光照強(qiáng)度及16 h/8 h光周期條件下培養(yǎng),1月齡的組培苗可用于下一步試驗(yàn)研究。

1.2 外源AsA處理對(duì)馬鈴薯試管薯形成的影響

為研究AsA對(duì)馬鈴薯塊莖形成的影響,利用外源添加AsA處理二倍體材料CIP-178和CIP-149及四倍體品種C-88。將預(yù)培養(yǎng)材料的單節(jié)莖段轉(zhuǎn)接到含30 g/L蔗糖并分別添加了終濃度為0(對(duì)照,CK),1、5、10、20、50 mmol/L AsA的1/2 MS固體培養(yǎng)基上,置于誘導(dǎo)塊莖形成的全黑暗(18±2) ℃條件下培養(yǎng),14 d后統(tǒng)計(jì)結(jié)薯個(gè)數(shù)并計(jì)算結(jié)薯率, 結(jié)薯率的計(jì)算方法為平均每100個(gè)莖段中結(jié)薯的個(gè)數(shù),每個(gè)處理有3個(gè)重復(fù)。

1.3 不同pH值處理對(duì)CIP-149試管薯形成的影響

將含不同濃度(0、1、5、10和20 mmol/L)AsA的1/2 MS固體培養(yǎng)基離心并收集上清, 測(cè)定各個(gè)上清溶液的pH值。在1/2 MS培養(yǎng)基中加入1 mol/L的HCl,將培養(yǎng)基pH值調(diào)為上述添加了不同濃度AsA的對(duì)應(yīng)pH值。

將預(yù)培養(yǎng)材料CIP-149的單節(jié)莖段轉(zhuǎn)接到上述不同pH值、含3%(W/V)蔗糖的1/2 MS固體培養(yǎng)基中,在(18±2) ℃條件下的全黑暗培養(yǎng)間培養(yǎng)14 d后統(tǒng)計(jì)結(jié)薯個(gè)數(shù)并計(jì)算結(jié)薯率。

1.4 AsA處理?xiàng)l件下馬鈴薯塊莖形成關(guān)鍵基因的RT-qPCR分析

以預(yù)培養(yǎng)1月齡的CIP-149為材料,將剪去葉片的單節(jié)莖段轉(zhuǎn)接到分別添加了0(對(duì)照)或1 mmol/L AsA的1/2 MS培養(yǎng)基(含30 g/L蔗糖)中,在全黑暗及(18±2) ℃條件下培養(yǎng)。在5個(gè)時(shí)間點(diǎn)(0、3、9、12和16 d)剪取代表了馬鈴薯塊莖形成5個(gè)典型階段的樣品用于總RNA提取,分別是腋芽(0 d)、長(zhǎng)大的腋芽或剛長(zhǎng)出的匍匐莖(3 d)、約1 cm長(zhǎng)的匍匐莖頂端(9 d)、約1 cm長(zhǎng)的帶有匍匐莖的剛剛膨大的塊莖(12 d)及約1 cm長(zhǎng)的帶有匍匐莖的生長(zhǎng)塊莖(16 d,圖1)。

組培苗. CIP-149組培苗;0 d. 腋芽;3 d. 稍大的腋芽;9 d. 長(zhǎng)約1 cm的匍匐莖頂端;12 d. 膨大的匍匐莖頂端;16 d. 生長(zhǎng)中的塊莖。圖1 分別在5個(gè)時(shí)間點(diǎn)對(duì)馬鈴薯塊莖形成不同階段的匍匐莖/塊莖頂端取樣用于RNA提取Microplant. Tissue culture seedling of CIP-149; 0 d. Axillary bud; 3 d. Slightly larger axillary bud; 9 d. About 1 cm long stolon tip; 12 d. Swelling stolon tip; 16 d. The growing tuber.Fig.1 Tips of stolons/tubers at different stages of potato tuber formation were harvested for RNA extraction at five time points

使用Tiangen RNAprep Pure Plant Plus Kit試劑盒(Tiangen,北京)提取總RNA,使用PrimeScriptTMRT試劑盒(TaKaRa,北京),將800 ng總RNA逆轉(zhuǎn)錄為cDNA第一鏈。基于本實(shí)驗(yàn)室研究及相關(guān)文獻(xiàn)[5-6,17-18]挑選出10個(gè)馬鈴薯關(guān)鍵結(jié)薯相關(guān)基因[StSP6A、StSP5G、StCO、Solanumtuberosumcyclingdoffactor(StCDF)、SolanumtuberosumphytochromeB(StPHYB)、Solanumtuberosumsucrosetransporter4(StSUT4)、Solanumtuberosumcalcium-dependentproteinkinase1(StCDPK1)、SolanumtuberosumGA20-oxidase(StGA20ox)、SolanumtuberosumBEL5(StBEL5)和Potatohomeobox(POTH)]進(jìn)行表達(dá)量測(cè)定(表1)。

表1 用于RT-qPCR分析的馬鈴薯塊莖形成相關(guān)基因信息Table 1 Information of genes related to potato tuber formation for RT-qPCR analysis

采用TB GreenTMPremix Ex TaqTMII(TaKaRa,北京)在Roche Light Cycler 960(Roche Diagnostics, Basel,Switzerland)上進(jìn)行RT-qPCR。反應(yīng)體系為:10 μL(1 μL模板cDNA,上下游引物各0.4 μL,5 μL SYBR Green PCR Master Mix和3.2 μL ddH2O)。

采用內(nèi)參基因L2[19],對(duì)目標(biāo)基因的表達(dá)量進(jìn)行校正。引物由Primer3 web(https://bioinfo.ut.ee/primer3-0.4.0/)設(shè)計(jì)(表2)。RT-qPCR反應(yīng)程序?yàn)?95 ℃預(yù)孵育600 s,95 ℃ 10 s,55 ℃ 15 s,2步擴(kuò)增45個(gè)循環(huán),最后一步進(jìn)行60～97 ℃熔解曲線分析。在RT-qPCR分析中,有3個(gè)獨(dú)立的生物樣重復(fù)和3個(gè)技術(shù)重復(fù)。采用比較CT法(2-ΔΔCT法)對(duì)RT-qPCR數(shù)據(jù)進(jìn)行量化[20]。

1.5 StSP6A純合突變體敲除載體的構(gòu)建

質(zhì)粒構(gòu)建: 表達(dá)SpCas9的雙元載體pKESE401及中間載體pCBC-DT1T2見前文[28]。從Spud DB數(shù)據(jù)庫(kù)(http://solanaceae.plantbiology.msu.edu)下載獲得馬鈴薯StSP6A基因序列(基因ID:Soltu.DM.05G026370.1)。利用靶位點(diǎn)在線設(shè)計(jì)工具CRISPR-P 2.0(http://crispr.hzau.edu.cn/CRISPR2/)設(shè)計(jì)StSP6A的靶位點(diǎn),篩選出其中2條20 nt的sgRNA(sigle guide RNA)序列,構(gòu)建的敲除載體引物分別為DT1F,TCGAAGTAGTGATTGGGTTGCATAACAA-CTTGTGAGTTTTAGAGCTAGAAATAGC和DT2R,TTCTAGCTCTAAAACTTCACTAGGTCTGTTGAT-CTCAATCTCTTAGTCGACTCTAC。

DT1F和DT2R用于擴(kuò)增pCBC-DT1T2。將擴(kuò)增產(chǎn)物純化后, 通過無縫克隆試劑盒(ClonExpress II One Step Cloning Kit,Vazyme)連接到被BsaI酶切的pKESE401中[29]。構(gòu)建的CRISPR/Cas9載體如圖2,A所示。

A. StSP6A的基因結(jié)構(gòu)以及靶位點(diǎn)原理圖,其中2個(gè)gRNAs序列用黑線劃線,PAM用紅線劃線;B. 轉(zhuǎn)基因株系的突變模式。所有轉(zhuǎn)基因株系后面都有對(duì)突變類型的描述:i=插入,d=刪除。i和d對(duì)應(yīng)的數(shù)字表示堿基對(duì)變化的數(shù)量。插入用綠色字母表示(G,A,C,T),刪除用綠色“”表示。圖2 StSP6A靶位點(diǎn)(A)及其突變模式(B)示意圖A. The schematic diagram of StSP6A with target sites. Two gRNAs sequences were underlined by black lines, and PAMs were marked by red lines. B. The StSP6A mutation patterns in transgenic lines. All transgenic lines are followed by a description for the mutation type: i = insertion and d = deletion. The number associated with i and d indicates the number of base pair changes. Insertion was shown in green letter(G, A, C, T), and deletion are indicated by a green “”.Fig.2 The schematic diagram of StSP6A target sites(A) and the mutation patterns(B) in transgenic lines

馬鈴薯的農(nóng)桿菌(Agrobacteriumtumefaciens)轉(zhuǎn)化:本研究使用的材料為二倍體馬鈴薯CIP-149,農(nóng)桿菌轉(zhuǎn)化按照之前的方法[28,30],并進(jìn)行如下修改:預(yù)培養(yǎng)2 d后,將外植體與攜帶有雙靶載體pKSE401的農(nóng)桿菌在含有2 mg/L NAA(α-napthaleneacetic acid, α-萘乙酸)和1 mg/L ZT(zeatin trans isomer,玉米素,Phytotechlab)的LB培養(yǎng)基上共培養(yǎng)2 d,然后更換到含0.1 mg/L NAA+2 mg/L ZT的愈傷組織誘導(dǎo)培養(yǎng)基上誘導(dǎo)2周,最后更換到0.01 mg/L NAA和1 mg/L ZT誘導(dǎo)再生培養(yǎng)基上進(jìn)行誘導(dǎo),每2周更換1次培養(yǎng)基,直至出芽。將再生苗切下,扦插至含50 mg/L卡那霉素(kanamycin sulfate)和200 mg/L特美汀(timentin,Phytotechlab)的篩選培養(yǎng)基上進(jìn)行篩選。經(jīng)過2輪篩選后,提取正常生根的再生苗的DNA,用橫跨靶位點(diǎn)的特異性引物進(jìn)行擴(kuò)增。特異性引物為5′-AGGCGGCATGTCTTCTAGAG-3′和5′-TAAACCCCTCTACCCCTCCA-3′。將PCR產(chǎn)物純化后克隆到pBM16A載體(Biomed,北京)中, 轉(zhuǎn)化感受態(tài)大腸桿菌(Escherichiacoli)。從每個(gè)轉(zhuǎn)化子的DNA中選擇10個(gè)菌落在生工生物技術(shù)公司(上海)進(jìn)行測(cè)序。采用Geneous 4.8.3軟件進(jìn)行序列分析。

通過上述轉(zhuǎn)化過程,共獲得125株轉(zhuǎn)基因植株。對(duì)每個(gè)轉(zhuǎn)基因植株的靶位點(diǎn)進(jìn)行測(cè)序,每株10個(gè)無性系,共得到3個(gè)StSP6A純合突變體(sp6a85、sp6a107和sp6a113)。突變類型如圖2,B所示。

1.6 外源AsA處理對(duì)StSP6A純合變體sp6a85、sp6a107和sp6a113試管薯形成的影響

為研究外源添加AsA對(duì)StSP6A純合突變體馬鈴薯塊莖形成的影響,利用獲得的CIP-149的StSP6A敲除突變體,將CIP-149野生型對(duì)照和StSP6A純合突變體(Sp6a85、sp6a107和sp6a113)的單節(jié)莖段轉(zhuǎn)接到含30 g/L蔗糖并添加了0、1、5、10和20 mmol/L AsA的1/2 MS固體培養(yǎng)基上,在(18±2) ℃全黑暗培養(yǎng)條件下培養(yǎng)14 d后統(tǒng)計(jì)結(jié)薯率。

1.7 數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)分析

利用SPSS 22.01進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。數(shù)據(jù)采用單因素方差分析(ANOVA),并以至少3次重復(fù)的平均值±標(biāo)準(zhǔn)差表示。在*P<0.05和**P<0.01水平評(píng)估差異顯著性。

2 結(jié)果與分析

2.1 外源AsA處理對(duì)馬鈴薯試管薯形成的影響

以2個(gè)二倍體馬鈴薯CIP-149、CIP-178和1個(gè)四倍體品種C-88為材料,研究在含30 g/L蔗糖的1/2 MS培養(yǎng)基中加入AsA對(duì)其塊莖形成的影響。結(jié)果表明,在培養(yǎng)基中加入終濃度為1、5、10、20和50 mmol/L的AsA時(shí),CIP-149的結(jié)薯率呈現(xiàn)先增加后降低的趨勢(shì)(圖3,A)。與0 mmol/L AsA的對(duì)照相比,CIP-149在0～5 mmol/L AsA濃度下的結(jié)薯率隨濃度增加結(jié)薯率顯著提高(圖3,A)。其中,1和5 mmol/L AsA處理下的結(jié)薯率分別是對(duì)照的3.6倍和5.84倍,此后隨AsA濃度增高,結(jié)薯率逐漸下降。對(duì)其生長(zhǎng)表型的觀察表明,隨加入的AsA濃度逐漸升高,匍匐莖逐漸變短,50 mmol/L AsA條件下,結(jié)薯率為0,莖段幾乎全部枯死(圖3,B)。

*和**分別表示P<0.05和P<0.01水平差異顯著。下同。圖3 外源抗壞血酸處理對(duì)馬鈴薯CIP-149結(jié)薯率和生長(zhǎng)表型的影響* and ** indicate significant difference at P <0.05 and P <0.01 levels, respectively. The same as below.Fig.3 Effects of exogenous ascorbic acid treatments on tuberization percentage and growth phenotype of CIP-149 potato plantlets

AsA對(duì)CIP-178和C-88結(jié)薯的影響與CIP-149類似。結(jié)果顯示,在培養(yǎng)基中加入終濃度為1、5、10和20 mmol/L的AsA時(shí),CIP-178和C-88的結(jié)薯率均呈現(xiàn)先增加后降低的趨勢(shì)(圖4)。與0 mmol/L AsA的對(duì)照相比,CIP-178在1 mmol/L和5 mmol/L AsA濃度下的結(jié)薯率均顯著增加,分別是對(duì)照的4.47倍和3倍(圖4,A);C-88在1和5 mmol/L AsA濃度下的結(jié)薯率均顯著增加,分別是對(duì)照的4倍和16.67倍(圖4,B)。20 mmol/L AsA條件下,CIP-178和C-88的結(jié)薯率均為0。

圖4 外源抗壞血酸處理對(duì)馬鈴薯結(jié)薯率的影響Fig.4 Effects of exogenous ascorbic acid treatments on tuberization frequency of potato plantlets

上述結(jié)果表明,外源添加AsA能夠顯著誘導(dǎo)馬鈴薯塊莖形成,1 mmol/L和5 mmol/L AsA處理均可顯著提高3個(gè)馬鈴薯材料的結(jié)薯率,其中,CIP-149和C-88的適宜誘導(dǎo)濃度為5 mmol/L,CIP-178的適宜誘導(dǎo)濃度為1 mmol/L。

2.2 不同pH值處理對(duì)馬鈴薯試管薯形成的影響

AsA是一種天然的有機(jī)酸,加入培養(yǎng)基以后,會(huì)導(dǎo)致培養(yǎng)基pH值下降。將添加了不同體積摩爾濃度AsA的1/2 MS固體培養(yǎng)基離心,測(cè)定其上清的pH值,結(jié)果顯示,隨AsA濃度增加,培養(yǎng)基pH值逐漸降低(表3)。

表3 含不同濃度AsA的培養(yǎng)基pH值Table 3 pH values of media containing different concentrations of AsA

為闡明AsA誘導(dǎo)馬鈴薯塊莖形成過程中pH的效應(yīng),在含3%(W/V)蔗糖的1/2 MS培養(yǎng)基中加入1 mol/L的HCl,將培養(yǎng)基分別調(diào)為表3所示的幾個(gè)pH值。剪取預(yù)培養(yǎng)CIP-149的單節(jié)莖段轉(zhuǎn)接至不同pH值的培養(yǎng)基中,檢測(cè)改變培養(yǎng)基pH對(duì)馬鈴薯結(jié)薯的影響。結(jié)果顯示,隨pH下降,CIP-149的結(jié)薯率呈現(xiàn)先增加后降低的趨勢(shì),在pH 4.23(對(duì)應(yīng)5 mmol/L AsA)時(shí)的結(jié)薯率最高(24%),為對(duì)照的2.18倍(圖5,A)。而外源添加5 mmol/L AsA的結(jié)薯率(81.11%)為對(duì)照的5.84倍(圖3,A)。表明在外源添加AsA處理誘導(dǎo)結(jié)薯的過程中,AsA導(dǎo)致的培養(yǎng)基pH下降也可以誘導(dǎo)結(jié)薯率的增加,但AsA本身起更重要的作用。

圖5 培養(yǎng)基不同pH值對(duì)CIP-149試管薯形成的影響Fig.5 Effects of different pH values in culture medium on microtuber formation of CIP-149

2.3 AsA誘導(dǎo)試管薯形成過程中關(guān)鍵結(jié)薯相關(guān)基因的表達(dá)分析

馬鈴薯的塊莖形成需要環(huán)境、生化和遺傳因素的共同作用,是生化途徑激活/抑制和形態(tài)發(fā)生的精確同步,這兩個(gè)過程都由特定的基因表達(dá)模式控制[5,31]。圖3,A和圖4的結(jié)果表明,AsA處理可以顯著誘導(dǎo)馬鈴薯的塊莖形成,表明AsA可能導(dǎo)致一些與塊莖形成相關(guān)基因表達(dá)的變化。基于目前該領(lǐng)域的研究進(jìn)展,研究選取了10個(gè)參與馬鈴薯塊莖形成的關(guān)鍵基因(表1),通過RT-qPCR分析了它們?cè)贏sA誘導(dǎo)馬鈴薯塊莖形成過程中的表達(dá)情況(圖6)。由于1 mmol/L AsA處理可以顯著提高馬鈴薯CIP-149的結(jié)薯率(圖3,A),但對(duì)馬鈴薯組培植株生長(zhǎng)影響不明顯(圖3,B),因此,研究以該濃度檢測(cè)AsA處理對(duì)10個(gè)結(jié)薯相關(guān)基因表達(dá)的影響。

圖6 外源抗壞血酸處理對(duì)馬鈴薯CIP-149試管薯誘導(dǎo)和形成過程中塊莖形成相關(guān)基因表達(dá)的影響Fig.6 Effect of exogenous ascorbic acid on expression of tuberization-related genes during microtuber induction and formation in potato CIP-149

StSP6A是控制馬鈴薯塊莖形成的關(guān)鍵基因,短日照激活其表達(dá)。在長(zhǎng)日照條件下,StCO轉(zhuǎn)錄因子通過激活StSP5G,抑制StSP6A的表達(dá)。在短日照條件下,由于缺乏StSP5G,葉片中的StSP6A被激活,然后,StSP6A蛋白通過韌皮部從葉片運(yùn)輸?shù)劫橘肭o。

在匍匐莖頂端,StSP6A形成一種促進(jìn)塊莖形成的塊莖形成激活復(fù)合體[9,17-18,21-22]。本試驗(yàn)中,在馬鈴薯塊莖形成的不同階段,StSP6A的表達(dá)量極顯著增加,尤其是在塊莖形成誘導(dǎo)條件下培養(yǎng)12 d和16 d,對(duì)照組(0 mmol/L AsA)在第12天和16天的表達(dá)量較0 d分別增加8 864.9倍和9 222.9倍,1 mmol/L AsA處理組在第12天和16天的表達(dá)量較0 d分別增加8 393.8倍和8 971.1倍(圖1和圖6,A)。AsA處理在塊莖形成前期的第3天(略大的腋芽)和第9天(生長(zhǎng)的匍匐莖)(圖1和圖6,A)可顯著提高StSP6A的表達(dá)水平,其表達(dá)量分別是對(duì)照的13.6倍和5.4倍,表明AsA處理可在馬鈴薯塊莖誘導(dǎo)和早期形成過程中快速提高StSP6A的表達(dá)水平。

StSP5G作為StSP6A轉(zhuǎn)錄的抑制因子負(fù)調(diào)控馬鈴薯的塊莖形成[23]。結(jié)果表明,StSP5G在塊莖形成前(第3天和第9天,圖1)的表達(dá)量都低于0 d,第3天對(duì)照組和AsA處理組的表達(dá)量分別為0 d的48.86%和29.9%。第9天分別為0 d的29.88%和36.2%。但在塊莖開始膨大和塊莖生長(zhǎng)階段(第12天和第16天,圖1),StSP5G的表達(dá)量有大幅度的上調(diào),且AsA處理組的表達(dá)量均顯著高于對(duì)照組(圖6,B)。

StCO在長(zhǎng)日照條件下抑制StSP6A基因的表達(dá),負(fù)向調(diào)控馬鈴薯的塊莖形成[21-22]。在試驗(yàn)的塊莖誘導(dǎo)和形成過程中,對(duì)StCO表達(dá)分析的結(jié)果表明,在塊莖誘導(dǎo)和形成的3～16 d(圖1),StCO的表達(dá)水平在對(duì)照組和AsA處理組中總體上都低于0 d;且在9～16 d期間,AsA處理組的StCO表達(dá)量均顯著低于對(duì)照組(圖6,C)。

StCDPK在馬鈴薯塊莖形成初期表達(dá)量急劇升高并受高濃度蔗糖誘導(dǎo)[24]。結(jié)果表明,在塊莖誘導(dǎo)和形成的3～16 d(圖1),StCDPK在對(duì)照組和AsA處理組的表達(dá)量整體上呈先急劇上升后下降的趨勢(shì);其中,第9天的表達(dá)量最高,對(duì)照組和AsA處理組第9天的表達(dá)量可達(dá)0 d的1 553.3倍和1 633.8倍(圖6,D)。

GA20氧化酶(GA20ox1)是GAs合成途徑中的關(guān)鍵調(diào)控酶,StGA20ox1的表達(dá)水平與塊莖形成時(shí)間呈負(fù)相關(guān),該基因轉(zhuǎn)錄的增強(qiáng)延緩了塊莖的形成,而表達(dá)的抑制則加速了塊莖形成[25,32]。結(jié)果表明,StGA20ox在塊莖誘導(dǎo)形成的0～12 d表達(dá)量呈上升趨勢(shì),在第16天表達(dá)量略有下降;在3～16 d,AsA處理組StGA20ox表達(dá)量均顯著低于對(duì)照組(圖6,E)。

StBEL5-POTH1異源二聚體抑制GA20ox1啟動(dòng)子活性,降低GAs水平[26]。在本試驗(yàn)中,StBEL5在塊莖誘導(dǎo)形成的3～16 d的表達(dá)量除第3天低于0 d外,AsA處理組和對(duì)照組的StBEL5表達(dá)量總體上呈持續(xù)增加的趨勢(shì), 但處理組和對(duì)照組之間差異不顯著(圖6,F)。POTH的表達(dá)量在0～16 d總體上變化幅度不大(圖6,G)。

StCDF1作為生物鐘組件抑制StCO的表達(dá)[22]。結(jié)果表明,在AsA處理組中,在塊莖誘導(dǎo)形成的3～16 d,StCDF1的表達(dá)量均明顯低于0 d;此外,除在第3天AsA處理組中的StCDF1表達(dá)量略高于對(duì)照組之外,在9～16 d AsA處理組中的StCDF1表達(dá)量均顯著低于對(duì)照組(圖6,H)。

StPHYB是一種能感知光周期的光受體,控制光周期依賴的塊莖形成[5,8]。StSUT4通過調(diào)控基因如StSP6A、StCO等的表達(dá)以及抑制葉片蔗糖輸出來抑制馬鈴薯的塊莖形成[27]。在本試驗(yàn)中,StPHYB和StSUT4在塊莖誘導(dǎo)形成的3～16 d,AsA處理組和對(duì)照組的表達(dá)量變化較小,總體上表現(xiàn)為表達(dá)量下降或不變(圖6,I和圖6,J)。這可能與本試驗(yàn)在全黑暗條件下的培養(yǎng)有關(guān),具體表達(dá)變化調(diào)控機(jī)制尚待進(jìn)一步研究。

2.4 AsA處理對(duì)StSP6A純合突變體試管薯形成的影響

以上結(jié)果表明,在馬鈴薯塊莖誘導(dǎo)形成過程中,StSP6A表達(dá)急劇上調(diào)(圖6,A),AsA處理能顯著提高馬鈴薯的結(jié)薯率(圖3,A、圖4,A和圖4,B),也能顯著提高StSP6A的表達(dá)量(圖6,A)。為明確StSP6A在AsA誘導(dǎo)塊莖形成中的作用,通過CRISPR-Cas9介導(dǎo)的基因組編輯敲除StSP6A基因,獲得3個(gè)StSP6A純合突變體sp6a85、sp6a107和sp6a113(圖2)。

從圖7可看出,雖然1～10 mmol/L外源AsA處理可顯著促進(jìn)野生型(WT)CIP-149的塊莖形成,但在0、1、5、10和20 mmol/L AsA處理下,敲除StSP6A的純合變體sp6a85、sp6a107和sp6a113的塊莖形成都受到了強(qiáng)烈抑制,表明StSP6A參與了自然結(jié)薯和AsA誘導(dǎo)的結(jié)薯調(diào)控。

A. WT和StSP6A純合突變體(sp6a85、sp6a107和sp6a113)在不同濃度AsA處理下的結(jié)薯率;B. 不同濃度AsA處理對(duì)WT及StSP6A純合突變體sp6a85試管薯形成影響的表型觀察。圖7 外源AsA對(duì)馬鈴薯CIP-149野生型(WT)及敲除StSP6A的純合突變體結(jié)薯率和生長(zhǎng)表型(sp6a85)的影響A. Tuberization frequency of WT and the StSP6A null-mutants (sp6a85, sp6a107 and sp6a113) under different concentrations of AsA treatments; B. Phenotypical observation of effects of different concentration of AsA treatment on microtuber formation in WT and the StSP6A null-mutant sp6a85.Fig.7 Effects of exogenous AsA treatments on tuberization percentage and growth phenotype (sp6a85) of CIP-149 wild type(WT) and knockout of StSP6A null-mutants of the potato CIP-149

3 討 論

AsA是植物細(xì)胞中最豐富的抗氧化劑, 除具有較高的抗氧化活性外,AsA也是細(xì)胞和細(xì)胞器氧化還原狀態(tài)的中心調(diào)節(jié)劑,參與調(diào)節(jié)光合作用、生長(zhǎng)發(fā)育、細(xì)胞壁生物合成、種子萌發(fā)、開花時(shí)間、果實(shí)軟化和衰老、采后貯藏、信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)和增強(qiáng)植物對(duì)不利環(huán)境的抗性等[11,33-36];另一方面,馬鈴薯塊莖形成過程中匍匐莖頂端的塊莖發(fā)育是由特定的基因表達(dá)模式控制的復(fù)雜過程[31]。然而,AsA是否參與馬鈴薯塊莖誘導(dǎo)和形成的調(diào)控,目前尚不清楚。本研究結(jié)果表明,外源AsA處理3個(gè)馬鈴薯材料CIP-149、CIP-178和C-88均能使其結(jié)薯率顯著提高,并且結(jié)薯率都呈現(xiàn)了一個(gè)先升高后降低的趨勢(shì),表明適宜濃度(1～5 mmol/L)的AsA處理能誘導(dǎo)和促進(jìn)馬鈴薯塊莖的快速形成。這個(gè)結(jié)果不僅豐富了對(duì)AsA生物學(xué)功能的認(rèn)識(shí),而且由于AsA的易得和廉價(jià),也為提高工廠化生產(chǎn)的馬鈴薯脫毒微型種薯產(chǎn)量提供了一條可行的路徑。

馬鈴薯的塊莖形成過程涉及到多重環(huán)境因素與植物激素及信號(hào)分子的互作以及這種互作對(duì)大量關(guān)鍵基因及多條信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)與代謝途徑的調(diào)控;其中,StSP6A基因及其編碼蛋白在馬鈴薯塊莖的誘導(dǎo)和形成過程中起關(guān)鍵作用[6,21-23]。本研究表明,在馬鈴薯塊莖誘導(dǎo)形成過程中,StSP6A的表達(dá)顯著增強(qiáng);此外,AsA處理可以顯著提高StSP6A的表達(dá)水平,尤其是在塊莖形成前期。通過CRISPR-Cas9介導(dǎo)的基因組編輯敲除StSP6A基因,可消除外源AsA誘導(dǎo)StSP6A純合突變體sp6a85、sp6a107和sp6a113的結(jié)薯效應(yīng)。這些結(jié)果都清楚表明,StSP6A的表達(dá)深度參與了AsA誘導(dǎo)的塊莖形成過程。

StCO可通過轉(zhuǎn)錄激活StSP6A的負(fù)調(diào)控因子StSP5G負(fù)向調(diào)控StSP6A的表達(dá)[5]。本研究表明,在9～16 d,AsA處理組中StCO的表達(dá)量均顯著低于對(duì)照組。StSP5G在塊莖形成前(第3天和第9天)的表達(dá)量都低于0 d,暗示著StCO和StSP5G作為馬鈴薯塊莖形成的負(fù)調(diào)控因子可能參與了AsA誘導(dǎo)的塊莖形成。

StCDPK1在馬鈴薯塊莖形成初始階段的匍匐莖膨大部分高表達(dá)[24]。本結(jié)果也表明StCDPK在塊莖形成之前的第9天,表達(dá)量達(dá)到了0 d的1 500倍以上,表明StCDPK在馬鈴薯塊莖形成過程中發(fā)揮重要作用。

GAs是一種高效的植物生長(zhǎng)調(diào)節(jié)劑,能夠影響植物的發(fā)育進(jìn)程[37]。GAs對(duì)馬鈴薯塊莖形成具有抑制作用[6]。GA合成途徑中的關(guān)鍵調(diào)控酶GA20ox1負(fù)向調(diào)控馬鈴薯的塊莖形成,過表達(dá)StGA2ox1導(dǎo)致塊莖形成提前,抑制其表達(dá)則塊莖形成推遲[25]。本研究表明,在3～16 d,AsA處理組的表達(dá)量均顯著低于對(duì)照組,暗示AsA可能通過調(diào)控StGA20ox的表達(dá)來調(diào)控馬鈴薯塊莖形成。

Chen等發(fā)現(xiàn)StBEL5和POTH1協(xié)同互作抑制StGA20ox1的表達(dá),進(jìn)而降低塊莖形成期間GAs的合成[26]。本研究表明,StBEL5在塊莖誘導(dǎo)形成的9～16 d,表達(dá)量總體上呈持續(xù)增加的趨勢(shì)。馬鈴薯POTH1基因受光誘導(dǎo)表達(dá)[6]。本研究結(jié)果顯示,POTH在塊莖誘導(dǎo)形成的0～16 d,AsA處理組和對(duì)照組中的表達(dá)量變化相對(duì)不大,這可能與試驗(yàn)材料是在離體條件下的全黑暗環(huán)境中培養(yǎng)有關(guān)。

自然條件下,馬鈴薯的塊莖形成是一個(gè)受光周期調(diào)控的生理過程[5,18]。本研究試驗(yàn)材料是在離體條件下的全黑暗環(huán)境中培養(yǎng)(這也是離體條件下誘導(dǎo)馬鈴薯微型薯形成的標(biāo)準(zhǔn)條件),因此,有關(guān)受生物鐘調(diào)控的基因如StCO、StCDF、StPHYB和StSUT4的表達(dá)與正常光周期條件下的結(jié)果并不完全一致,這種在全黑暗培養(yǎng)條件下結(jié)薯相關(guān)基因的表達(dá)模式與塊莖形成的關(guān)系有待進(jìn)一步深入研究。

AsA是一種存在于所有生物體內(nèi)的基本化合物,在植物生長(zhǎng)發(fā)育、激素信號(hào)以及應(yīng)激防御網(wǎng)絡(luò)等多個(gè)方面具有重要作用[38]。在植物的生長(zhǎng)發(fā)育過程中,不同基因在不同時(shí)期的有序表達(dá)調(diào)控著植物的形態(tài)建成和生長(zhǎng)期轉(zhuǎn)變[39]。本結(jié)果表明,AsA處理使不同塊莖形成相關(guān)基因的表達(dá)在塊莖形成的不同階段得到增強(qiáng)或抑制,說明AsA可能是在塊莖形成相關(guān)基因的上游發(fā)揮作用,并通過調(diào)控這些基因的表達(dá)來誘導(dǎo)結(jié)薯。基于以上結(jié)果,筆者提出了一個(gè)可能的模型來說明AsA參與調(diào)控馬鈴薯塊莖形成相關(guān)基因表達(dá)、進(jìn)而調(diào)控馬鈴薯的塊莖形成(圖8)。

紅色標(biāo)記為馬鈴薯塊莖誘導(dǎo)形成過程中表達(dá)上調(diào)的基因,藍(lán)色標(biāo)記為表達(dá)下調(diào)或表達(dá)基本不變的基因。圖8 AsA通過激活/抑制塊莖形成相關(guān)的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路誘導(dǎo)馬鈴薯塊莖形成的可能模型Red marks indicate the genes with up-regulated expression, whereas blue marks represent the genes that are down-regulated or whose expression unchanged during induction and formation of potato tubers.Fig.8 A possible model for the AsA-induced tuber formation in potato by activating/inhibiting the tuberization-related signal transduction pathways

綜上所述,外源AsA處理可誘導(dǎo)馬鈴薯塊莖形成,AsA誘導(dǎo)的塊莖形成可能與AsA調(diào)控的塊莖形成信號(hào)通路及相關(guān)基因的表達(dá)有關(guān),特別是StSP6A在AsA處理過程中的塊莖形成早期表達(dá)量極顯著上調(diào)。敲除StSP6A可消除外源AsA誘導(dǎo)的結(jié)薯作用。這些結(jié)果表明,AsA誘導(dǎo)馬鈴薯塊莖形成是通過調(diào)控與塊莖形成相關(guān)的基因表達(dá)和激活信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路來實(shí)現(xiàn)的,而StSP6A在AsA誘導(dǎo)馬鈴薯塊莖形成中起著關(guān)鍵作用。