氮肥對2個楊樹品種碳氮代謝的影響

杜常健,張 敏,張 磊,胡建軍

(林木遺傳育種國家重點實驗室,國家林業和草原局林木培育重點實驗室,中國林業科學研究院林業研究所,北京 100091)

楊樹是重要的造林、經濟樹種,在世界及中國分布范圍極廣。隨著經濟的迅速發展,木材的需求量將越來越大,必須大力發展人工林。在集約經營的人工用材林中,由于林木長期的養分吸收以及不恰當的管理措施,造成人工林地土壤氮素匱乏,難以滿足林木正常生長的生理需求,因此土壤氮素有效性已成為限制林木生長的主要因素[1],選育高氮利用和耐低氮的林木品種是解決這一問題的有效途徑。

氮素是植物生長發育必需的大量元素之一,是氨基酸、蛋白質、核苷酸、葉綠素和許多細胞成分等的重要組成成分[2]。氮素利用與生物量的積累之間的聯系機制尚不清楚。碳、氮代謝是植物生長發育最為重要的2個基礎代謝途徑。碳代謝過程包括碳的固定、碳水化合物的合成與利用等過程,固定二氧化碳(CO2)以產生糖、有機酸和儲存碳水化合物。氮代謝過程包括氮素的吸收、同化、轉運和氨基酸的合成,最后用于植物的生長。植物已經進化出一種復雜的調節機制來協調碳氮代謝,氮代謝的進行需要碳代謝提供碳骨架和能量,而氮代謝通過光合和光呼吸途徑顯著影響碳的固定和同化[3]。碳代謝與氮代謝之間具有高度相關關系,并且林木體內的碳氮代謝是影響木材形成的主要原因。

由于氮代謝的每一個進程都受到自然環境和基因型差異等條件調控,不同的植物品種間氮代謝及生長性狀具有豐富的遺傳變異。但是在林木育種研究方面,目前還較少關注氮利用效率的不同品種差異,忽視了氮利用效率基因型的研究。而選擇高氮利用效率的林木基因型,是實現提高木材產量的有效策略?！ぜt’楊屬于美洲黑楊 (Populusdeltoides),具有生長快、氮利用能力較強、干形好等特性,目前世界上人工栽培的楊樹品種有90%以上都源于黑楊派[4]?！ㄟ|1號’楊屬于小葉楊 (Populussimonii),是中國鄉土樹種,具有耐寒、耐旱、耐弱堿性、根系發達和抗風力強等特性,為中國東北及西北地區重要的防護林[5],但是小葉楊生長緩慢,氮利用能力較差。選擇生長特性差異顯著的兩個楊樹品種可以幫助我們解析不同楊樹品種氮利用差異的機制,從而協助解決未來楊樹育種和推廣種植中遇到的實際問題。

因此,本研究以‘丹紅’楊(P.deltoides‘Danhong’)和‘通遼1號’楊(P.simonii‘Tongliao1’)為材料,在田間設置施氮肥和不施氮肥處理,比較分析了兩個樹種的生長表型、總碳、總氮和水解氨基酸含量之間的差異,同時利用高通量測序技術獲得了發育木質部的轉錄組數據,考察了它們的氮響應差異基因表達情況,為今后選育高氮利用效率的楊樹新品種提供科學依據。

1 材料和方法

1.1 試驗地點、材料和處理

試驗地設在北京市海淀區中國林業科學研究院玉泉山苗圃。試驗地土壤全氮含量1.275 g/kg,全磷含量0.797 g/kg,全鉀含量16.0 g/kg。以‘丹紅’楊(美洲黑楊)和‘通遼1號’楊(小葉楊)為材料,選擇健康一致的枝條剪成10 cm插穗。在2020年4月1日扦插于10 cm×10 cm營養缽中,基質配比為5∶1的泥炭和蛭石,并用多菌靈進行消毒處理。培養1個月后(5月16日)選擇生長一致的楊樹幼苗移栽入大田。每個樹種均設置施氮肥處理(高氮,HN)和不施氮肥處理(低氮,LN),每處理3 次生物學重復,每重復6株幼苗,株行距為 30 cm×50 cm。6月20日、7月10日、8月6日進行施氮肥處理,每株苗4 g尿素[CO(NH2)2,含氮量46.0%]。根據土壤干旱程度平均每個月澆水1次,并定期除草。

1.2 測定指標及方法

1.2.1 生長指標9月份,利用數字游標卡尺在地面以上5 cm處測量幼苗地徑,利用塔尺測量株高。樣品風干后,利用電子天平稱取根、莖、葉生物量和總生物量。每個樹種每個氮處理條件3個生物學重復,每重復6株幼苗。

1.2.2 總碳和總氮含量在幼苗離地面1 m處取樹皮和木質部樣品,并風干保存。每個樹種每個氮處理條件3個生物學重復。樣品(4～5 mg)在920 ℃下于填充有氧化銅的氧化管中氧化物燒。燃燒后形成的氣體在填有還原銅的管內還原為N2(650 ℃)。氣體通過氦載氣流經水阱(P2O5)。 N2、CO2經過吸附與解吸附柱分離,然后再進入同位素質譜儀(IRMS,德國)進行同位素分析[6]。

1.2.3 水解氨基酸含量在幼苗離地面1 m處取樹皮和木質部樣品,并風干保存。每個樹種每個氮處理條件3個生物學重復。稱取混合均勻的適量樣品,在水解管中加入10～15 mL 6 mol/L鹽酸溶液,將水解管放入冷凍劑中,冷凍3～5 min,充氮保護,擰緊瓶蓋,將水解管放在(110±1) ℃的電熱鼓風恒溫箱中水解22 h后,取出,冷卻至室溫。打開水解管,將水解液過濾至50 mL容量瓶中,用少量水多次沖洗水解管,水洗液移入同一50 mL容量瓶內,最后用水定容至刻度線,搖勻。準確吸取1.0 mL濾液移入至15 mL試管內,40 ℃減壓至干;用1.0 mL pH 2.2的檸檬酸鈉緩沖溶液附溶,振蕩混勻后過0.22 μm濾膜;利用氨基酸自動分析儀(LA8080,日立,日本)測定水解氨基酸含量[7]。

1.2.4 纖維素、半纖維素和木質素含量在幼苗離地面1 m處取木質部樣品,并風干保存。每個樹種每個氮處理條件3個生物學重復。水溶性和醇溶性物質的存在,嚴重影響木質纖維素類生物質原料化學成分測定的結果。以純水和乙醇對樣品進行重復性洗脫,去除樣品中包含的無機鹽、可溶性糖、含氮化合物、葉綠素、脂質和蠟質等。純化后的標準樣品經過兩步酸解,其中的纖維素、半纖維素和果膠等結構性多糖被水解為單糖的形式并溶解于水解液中。酸解后溶液在高效液相色譜儀(Agilent1260,安捷倫,美國)上獲得纖維二糖、葡萄糖、木糖、阿拉伯糖及半乳糖醛酸的濃度值,以計算纖維素、半纖維素和果膠含量(標準: NB/T 34057-2017)。在紫外分光光度計(TU-1901,北京)上320 nm處獲得吸光度值,并計算酸溶木質素含量,酸解后分離的固形物經馬弗爐灼燒,以前后差值得出酸不溶木質素含量。

1.3 轉錄組數據測定和分析

在9月份,于幼苗離地面1 m處,剝開樹皮刮取發育木質部鮮樣品,液氮保存并測定轉錄組。每個樹種每個氮處理條件3個生物學重復。使用RNA試劑盒(Qiagen, Germany)提取總RNA。在Illumina Novaseq平臺上對文庫準備進行了測序,并生成了150 bp的雙端讀段。原始數據經過過濾后,使用TopHat比對到毛果楊參考基因組上v3.1[8-10],然后計算所有基因的FPKM值[9-10], 通過DESeq2 R包進行高氮和低氮條件下的差異表達分析。基于FPKM值的Baggerly檢驗確定不同分組配對比較的差異表達基因,判定標準為|log2FC| >0和矯正的P< 0.05。通過R包clusterprofile對候選基因和差異表達基因進行KEGG富集分析[11]。

1.4 數據處理

利用Excel和R(version 4.0.3)軟件對原始數據進行統計分析、方差分析和作圖。

2 結果與分析

2.1 施氮對2種楊樹幼苗生長表型的影響

圖1顯示,在高氮條件下(HN),‘丹紅’楊和‘通遼1號’幼苗的地徑、株高、葉生物量、莖生物量、根生物量及總生物量均不同程度地高于低氮處理(LN),‘丹紅’楊各指標的增幅均達到顯著水平(P<0.05),而‘通遼1號’楊僅株高和葉生物量增幅顯著;‘丹紅’楊和‘通遼1號’楊的總生物量在高氮處理下分別比低氮處理提高了1.69倍和1.10倍。同時,在相同氮肥處理(高氮或者低氮)條件下,‘丹紅’楊的地徑、株高、根生物量、葉生物量、莖生物量、總生物量都顯著高于相應的‘通遼1號’楊(P<0.05);如‘丹紅’楊的總生物量在施氮條件下是‘通遼1號’楊的13倍,在不施氮條件下是‘通遼1號’楊的10倍?？梢?增施氮肥處理促進了‘丹紅’楊和‘通遼1號’楊的生長,且對‘丹紅’楊的促進效果更明顯;‘丹紅’楊的在不同氮素環境下的木材產量都顯著高于‘通遼1號’楊。

2.2 施氮對2種楊樹幼苗碳、氮代謝的影響

在高氮條件下,‘丹紅’楊和‘通遼1號’楊樹皮和木質部的總氮含量均比低氮處理明顯下降,且大多達到顯著水平,同時2種楊樹樹皮和木質部的總碳含量與低氮處理相比大多沒有顯著變化。說明施氮處理能明顯促進楊樹樹皮和木質部總氮含量,而對其總碳含量沒有明顯影響(圖2)。另外,從圖3可知,‘丹紅’楊和‘通遼1號’楊樹皮和木質部的纖維素、半纖維素和木質素含量在高氮和低氮肥處理間均沒有顯著差異;在相同氮肥處理條件下,‘丹紅’楊與‘通遼1號’楊之間樹皮和木質部的纖維素、半纖維素和木質素含量也沒有顯著差異。以上結果說明增施氮肥處理對楊樹樹皮和木質部的總氮含量有顯著的抑制作用,對其總碳、纖維素、半纖維素和木質素含量均沒有顯著影響。

圖2 ‘丹紅’楊和‘通遼1號’楊在施氮肥和不施氮肥條件下木質部和樹皮中總碳和總氮含量的差異Fig.2 Difference analysis of total carbon and total nitrogen in xylem and bark of ‘Danhong’ poplar and ‘Tongliao 1’ poplar under fertilization and no fertilization conditions

圖3 ‘丹紅’楊和‘通遼1號’楊在施氮肥和不施氮肥條件下木質部纖維素、半纖維素、木質素含量的差異Fig.3 Difference analysis of cellulose, hemicellulose, and lignin contents of ‘Danhong’ and ‘Tongliao 1’ under fertilization and no fertilization conditions

2.3 施氮對2種楊樹木質部和樹皮中水解氨基酸含量的影響

因為施氮處理對2種楊樹木質部和樹皮中總氮含量有顯著的影響,所以進一步測定了木質部和樹皮中的水解氨基酸含量。

結果(圖4)顯示,‘丹紅’楊幼苗木質部中的天冬氨酸(Asp)、蘇氨酸(Thr)、絲氨酸(Ser)、谷氨酸(Glu)、甘氨酸(Gly)、丙氨酸(Ala)、纈氨酸(Val)、異亮氨酸(Ile)、亮氨酸(Leu)、苯丙氨酸(Phe)、賴氨酸(Lys)、組氨酸(his)和精氨酸(Arg)含量在高氮和低氮的條件下都顯著低于相應‘通遼1號’楊(圖4,A),而‘丹紅’楊幼苗樹皮中的天冬氨酸(Asp)、蘇氨酸(Thr)、絲氨酸(Ser)、谷氨酸(Glu)、甘氨酸(Gly)、丙氨酸(Ala)和纈氨酸(Val)、異亮氨酸(Ile)、亮氨酸(Leu)、酪氨酸(Tyr)、苯丙氨酸(Phe)、賴氨酸(Lys)、精氨酸(Arg)、脯氨酸(pro)含量在高氮和低氮肥條件下都顯著低于相應的‘通遼1號’楊(圖4,B)。

同時,‘丹紅’楊和‘通遼1號’楊樹皮和木質部中的水解氨基酸含量在施氮肥后都有比不施肥處理顯著降低的趨勢。

2.4 施氮條件下2種楊樹木質部氮響應差異表達基因分析

為了了解2個樹種氮響應的差異表達基因,首先測定了‘丹紅’楊和‘通遼1號’楊在高氮和低氮肥條件下發育木質部的轉錄組。統計(表1)結果顯示,總共產生了5.4億個高質量的測序片段, 總計產生81.7 Gb原始數據;以毛果楊參考基因組進行了比對,比對率80%以上;GC含量分布范圍為43.14%～44.3%。進一步對測序數據進行了質控,Q20大于98%以上,Q30大于94%以上,說明測序數據質量合格。

表1 測序數據統計分析Table 1 Statistical analysis of sequencing data

其次,通過基因的差異表達分析發現(圖5),‘丹紅’楊在施氮處理后上調的基因有2 912個,下調的基因有3 491個,沒有明顯變化的基因有26 115個;‘通遼1號’楊在施氮肥處理后上調的基因有3 294個,下調的基因有2 947個,沒有顯著變化的基因有27 275個。

圖5 ‘丹紅’楊(A)和‘通遼1號’楊(B)在施氮肥和不施氮肥條件下的差異表達基因分析Fig.5 Differentially expressed gene analysis of ‘Danhong’ poplar (A) and ‘Tongliao 1’ poplar (B) under fertilization and no fertilization conditions

另外,利用KEGG數據庫對‘丹紅’楊和‘通遼1號’楊在施氮處理后上調和下調的差異表達基因進行了功能富集分析。結果(圖6)顯示,‘丹紅’楊施氮后上調的差異表達基因顯著富集到核糖體、氧化磷酸化、蛋白酶體、吞噬體、碳代謝、檸檬酸循環(TCA循環)、糖酵解/糖異生、光合生物中的碳固定、果糖和甘露糖代謝、氨基酸的生物合成、氨基糖和核苷酸糖代謝、囊泡運輸中的SNARE相互作用、半胱氨酸和甲硫氨酸代謝、磷酸戊糖等代謝途徑途徑;‘丹紅’楊施氮后下調的差異表達基因主要富集到類黃酮生物合成、內質網中的蛋白質加工、苯丙素生物合成、植物-病原菌互作、植物激素信號轉導、MAPK信號通路、氮代謝、玉米素生物合成等代謝途徑。

padj表示校正后的P值;Down表示施氮處理后下調的基因,Up表示施氮處理后上調的基因。圖6 施氮處理后2種楊樹上調和下調差異表達基因的KEGG分析padj represents the corrected P value. Down represents the down-regulated gene after fertilization treatment, and Up represents the up-regulated gene after nitrogen fertilizer treatment.Fig.6 KEGG analysis of up-regulated and down-regulated genes of two poplar varieties after nitrogen fertilizer treatment

同時,‘通遼1號’楊施氮后上調的差異表達基因主要富集到植物激素信號轉導、戊糖和葡萄糖醛酸的相互轉化、淀粉和蔗糖代謝等代謝途徑,其下調的差異表達基因主要富集到核糖體、內質網中的蛋白質加工、檸檬酸循環(TCA循環)、光合作用、光合作用-天線蛋白、RNA轉運等代謝途徑。以上結果說明‘丹紅’楊和‘通遼1號’楊的氮響應基因在碳代謝(如碳的固定和糖酵解/糖異生)和氮代謝(如氨基酸的合成)相關的富集通路有較大的差異。

3 討 論

楊樹具有速生、易繁殖、適應性強和生產力高等特性,在木材加工、碳匯造林、制漿造紙和生物燃料等方面發揮著重要作用[12-14]。世界上大部分楊樹林生長在氮素貧瘠的地區[15],易導致楊樹林生產力低下。因此本研究利用‘丹紅’楊和‘通遼1號’楊兩個材料進行了田間施氮試驗,結果表明‘丹紅’楊和‘通遼1號’楊的總生物量在氮肥處理后分別比不施氮處理提高了1.69倍和1.10倍,證明施加氮肥可以提高楊樹的生物量,因此在大面積種植的人工林中可以適當施加氮肥從而提高木材的產量。同時,‘丹紅’楊的總生物量在施氮條件下是‘通遼1號’楊的13倍,在不施氮肥條件下是‘通遼1號’楊的10倍。試驗結果說明在不同的氮素環境下,‘丹紅’楊的木材產量都遠遠高于‘通遼1號’楊,‘丹紅’楊更加適合人工林的大面積推廣和種植。‘丹紅’楊的優異表現也為進一步選育優良楊樹品種提供了堅實的種質基礎。目前楊樹氮素高效種質資源的收集、篩選和鑒定的遺傳改良工作做得相對較少,因此本研究從可持續利用的角度出發,挖掘楊樹氮素高效利用的種質資源具有重要經濟價值。

基因差異表達最終需要代謝物含量變化來體現,因此本研究中測定了林木總碳、總氮、纖維素、半纖維素和木質素以及15種水解氨基酸的含量。木本植物為生物燃料和生物制品提供了大量的木質纖維素資源?？偺?、纖維素、半纖維素和木質素是細胞壁的重要組成成分,也是木材的主要組成成分[22]。本研究中‘丹紅’楊和‘通遼1號’楊之間的總碳、木質素、纖維素和半纖維素含量沒有顯著的差異,說明2個樹種的木材材性沒有差異,木材的用途也是一致的。施氮肥對2個楊樹品種莖的總碳、木質素、纖維素和半纖維素含量沒有顯著的影響,說明氮肥的添加沒有影響木材的材性。因此在楊樹人工林種植中可以適量施加氮肥,不會影響木材的材性。氨基酸是植物體內氮素的主要存在方式之一。‘丹紅’楊和‘通遼1號’楊兩者之間的木質部和樹皮中15種水解氨基酸含量差異顯著,說明了2個樹種之間的氨基酸代謝有較大的差異。施用氮肥處理后‘丹紅’楊和‘通遼1號’楊的木質部和樹皮中的多種水解氨基酸含量顯著降低,說明了氮肥添加顯著影響了氨基酸的積累量。雖然氨基酸含量僅占楊樹總干重的小部分,卻在楊樹生長和生理過程中發揮著重要的作用。植物的生長和氮代謝都受氮素供應水平的調節,許多代謝途徑受到氨基酸濃度的調節[23],這與本研究中氨基酸在氮代謝中發揮重要作用的結果一致。

4 結 論

本研究選用‘丹紅’楊和‘通遼1號’楊幼苗在田間進行了施氮肥試驗。研究發現,在不同的氮素環境下,‘丹紅’楊的木材產量都遠遠高于‘通遼1號’楊,因此‘丹紅’楊更加適合人工林的大面積的推廣和種植。增施氮肥處理顯著提高了‘丹紅’楊木材的產量,在其人工林種植時可以適當施加氮肥。氮肥處理顯著影響了楊樹發育木質部碳固定、糖代謝、氨基酸合成等碳氮代謝相關途徑的基因高表達,促進了楊樹生物量的積累。氮肥的處理也影響了楊樹莖的總氮和多種水解氨基酸的含量,但是沒有影響其總碳、纖維素、半纖維素和木質素含量。試驗結果為楊樹氮利用效率的遺傳育種研究工作提供了借鑒。