黑果腺肋花楸酵素自然發酵過程中主要成分與抗氧化活性變化

王思溥，朱 丹 ，牛廣財, ，寧志雪，朱立斌，魏文毅，徐瑞航

（1.黑龍江八一農墾大學食品學院，黑龍江大慶 163319；2.黑龍江省農產品加工工程技術研究中心，黑龍江大慶 163319；3.黑龍江八一農墾大學生命科學技術學院，黑龍江大慶 163319）

黑果腺肋花楸（Aronia melanocarpaElliott）為薔薇科腺肋花楸屬灌木漿果，富含多酚、黃酮、花青素和多種有機酸、氨基酸及維生素等主要營養成分，具有抗氧化、抗腫瘤、抗炎抑菌等生理活性功能[1?4]，同時，能夠提高人體免疫力，調節血糖血脂，改善肝功能以及防治心血管疾病[5?8]。作為含有豐富生物活性物質的漿果之一，黑果腺肋花楸以其非凡的抗氧化能力著名，其抗氧化指數（Oxygen radical absorbance capacity，ORAC）高達160.2 μmol TE/g，高于接骨木果、藍莓、黑加侖、越橘、草莓、蔓越莓、葡萄等多種富含多酚的漿果[9]。Kardum 等[10]研究發現，25 位健康女性連續3 個月每日3 次攝入100 mL 黑果腺肋花楸果汁，紅細胞中超氧化物歧化酶（Superoxide dismutase，SOD）和谷胱甘肽過氧化物酶（Glutathione peroxidase，GPx）兩種抗氧化酶活力均顯著增加（P<0.05），說明其在保護細胞氧化損傷方面具有一定作用，具有良好的抗氧化活性。國家衛健委于2018 年將黑果腺肋花楸果正式列為新食品原料，為其進行精深加工提供了基礎和保障。

酵素作為一種功能性發酵產品，含有多種酶、維生素、總多酚和花色苷等生物活性成分。食用酵素的發酵方式分為兩種：接菌發酵利用不同的微生物作為起始發酵劑，其發酵過程雖易于調控，但容易出現風味單一及同質化現象；自然發酵不添加任何特殊發酵劑，僅依靠原料中的優勢菌群發酵，微生物群落組成不斷變化，生成不同代謝產物，經自然發酵后的酵素具有良好的抗氧化性能[11]。自然發酵過程中，酵素中參與發酵的微生物會發生代謝轉化，使生化指標及抗氧化活性產生明顯變化，其抗氧化活性與營養物質組成及含量的變化密不可分，薛淑龍等[12]報道的竹葉酵素在自然發酵過程中總酚含量持續上升，與DPPH 自由基、ABTS+自由基清除率和還原力均呈極顯著正相關（P<0.01）。目前，關于黑果腺肋花楸自然發酵酵素及其在發酵過程中主要成分變化和抗氧化機制的研究鮮有報道，明確自然發酵中主要營養成分和抗氧化活性的動態變化有利于黑果腺肋花楸酵素發酵過程的調控。因此，本研究以黑果腺肋花楸作為原料，探究黑果腺肋花楸酵素在28 ℃條件下恒溫自然發酵90 d 過程中還原糖、可溶性固形物、酒精度、總酸、總多酚、總黃酮、花色苷和SOD 酶活力等主要成分與DPPH 自由基、ABTS+自由基和羥自由基清除能力等抗氧化活性的變化規律以及兩者之間的相關性，為黑果腺肋花楸酵素自然發酵工藝優化以及提高其產品品質提供理論依據。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

黑果腺肋花楸果（2021 年10 月5 日采收于吉林延邊朝鮮族自治州圖們市水南黑果農場，成熟度良好，可溶性固形物含量8%）延邊黑果科技發展有限公司；白砂糖 內蒙古荷豐農業股份有限公司；Pectinex XXL 果膠酶（酶活10000 U/mL）、Celluclast 1.5 L 纖維素酶（酶活10000 U/mL）諾維信生物技術有限公司；福林酚、DPPH、ABTS 上海麥克林生化科技有限公司；總抗氧化能力（O-TAC）試劑盒、SOD 試劑盒 南京建成生物工程研究所；蘆丁、沒食子酸、葡萄糖 標準品，上海純優生物科技有限公司；亞硝酸鈉、氯化鐵、無水碳酸鈉、氫氧化鈉、硫酸亞鐵、氯化鈉、冰乙酸、過氧化氫、水楊酸、硝酸鋁、磷酸、鐵氰化鉀、無水醋酸鈉、無水乙醇、高硫酸鉀、甲醛、鹽酸、無水甲醇、三氯乙酸等 分析純，遼寧泉瑞試劑有限公司。

L530R 離心機 湖南湘儀實驗室儀器開發有限公司；JA2003 電子分析天平 南北科儀（北京）科技有限公司；SP909S 打漿機 浙江紹興蘇泊爾家居用品有限公司；LB90A 手持糖度計 廣州銘睿電子科技有限公司；LRH-70F 恒溫培養箱 青島明博環保科技有限公司；HH-6 恒溫水浴鍋 常州榮華儀器制造有限公司；UV765PC 紫外分光光度計 渡揚精密儀器（上海）有限公司；pHS-3E 型pH 計 上海習仁科學儀器有限公司。

1.2 實驗方法

1.2.1 黑果腺肋花楸自然發酵酵素的制備

1.2.1.1 工藝流程 黑果果實→挑選→破碎→酶解→調整糖度→自然發酵→恒溫培養→黑果酵素

操作要點：

a.破碎：按照黑果腺肋花楸果與水1:1 的比例（m:V）添加純凈水，用打漿機打碎并測定其可溶性固形物含量。

b.酶解：纖維素酶與果膠酶的比例為1:2[13]，添加量為纖維素酶3.2 mL/kg，果膠酶6.4 mL/kg；45 ℃恒溫水浴酶解3.5 h，酶解后pH 為3.57±0.02。

c.調整糖度：按照黑果腺肋花楸果與白砂糖4:1（m:m）左右的比例添加白砂糖，調整糖度至190 g/L。

d.自然發酵：調整糖度后的黑果腺肋花楸果漿分裝于已滅菌的錐形瓶中，瓶口使用帶有發酵栓的膠塞密封，置于28 ℃條件下恒溫自然發酵90 d[14]。

e.分析測定：每隔10 d 取樣一次，將黑果腺肋花楸發酵液混合均勻，常溫下4000 r/min 離心15 min后，對上清液進行主要成分與抗氧化活性檢測，重復3 次。

1.2.2 黑果腺肋花楸酵素自然發酵過程中主要成分的測定

1.2.2.1 還原糖含量測定 采用3,5-二硝基水楊酸比色法（DNS 顯色法）[15]，葡萄糖標準曲線方程為：y=0.6577x?0.0145，R2=0.9975。

1.2.2.2 可溶性固形物（TSS）含量的測定 采用手持糖度計法。

1.2.2.3 酒精度測定 參考GB 5009.225-2016 食品安全國家標準 酒中乙醇濃度的測定的方法，采用密度瓶法測定并計算發酵液酒精度。

1.2.2.4 總酸含量測定 參考GB 12456-2021 食品安全國家標準 食品中總酸的測定的方法，結果以蘋果酸計。

1.2.2.5 總多酚含量測定 采用福林酚法進行測定[16]，沒食子酸標準曲線方程為：y=0.0237x?0.0068，R2=0.9999。

1.2.2.6 總黃酮含量測定 采用亞硝酸鈉-硝酸鋁-氫氧化鈉比色法進行測定[17]，蘆丁標準曲線方程為：y=10.427x+0.0186，R2=0.9978。

1.2.2.7 花色苷含量測定 參考張榮菲等[18]的方法，采用pH 示差法測定花色苷含量。

1.2.2.8 SOD 酶活力測定 參考樊秋元等[19]的試劑盒方法進行測定。

1.2.3 黑果腺肋花楸酵素自然發酵過程中抗氧化活性的測定

1.2.3.1 DPPH 自由基清除能力的測定 參考張琪等[20]的方法配制濃度為0.5 mmol/mL 的DPPH 溶液，將0.5 mL DPPH 溶液與2 mL 稀釋后的發酵液混合均勻，37 ℃避光放置20 min，用無水甲醇作空白，在517 nm 測定吸光度A1。將2 mL 無水甲醇與0.5 mL DPPH 溶液混合均勻后，于37 ℃避光放置20 min，測定其吸光度A0。將0.5 mL 無水甲醇與2 mL 稀釋后的發酵液混合均勻后，于37 ℃避光放置20 min，測定其吸光度A2，按公式（1）計算。

式中：A1為加發酵液后DPPH 溶液的吸光度；A2為加發酵液，不加DPPH 溶液的吸光度；A0為加無水甲醇后DPPH 溶液的吸光度。

1.2.3.2 ABTS+自由基清除能力的測定 參照宋藝君等[21]的方法配制ABTS 溶液，取20 μL 發酵液，加入2 mL ABTS 反應液，混勻靜置10 min，測定其在734 nm 處的吸光度，以不加入樣品的ABTS 反應液為空白對照，按公式（2）計算。

式中：A1為發酵液的吸光度，A0為空白對照的吸光度。

1.2.3.3 羥自由基清除能力的測定 參考李昱鼎[22]的方法稍有改動。在2 mL 稀釋后的發酵液中分別加入6 mmol/L FeSO4溶液和6 mmol/L H2O2溶液各2 mL，搖勻后靜置10 min，再加入2 mL 6 mmol/L水楊酸溶液，搖勻后37 ℃保溫1 h，于510 nm 處測定吸光值 A1。以蒸餾水代替發酵液，測定吸光值A0。以蒸餾水代替水楊酸溶液，測定吸光值A2，按公式（3）計算。

式中：A0為空白的吸光度，A1為發酵液的吸光度，A2為發酵液在體系中的吸光度。

1.2.3.4 總還原力的測定 參照姚沛琳等[23]的方法稍有改動。在1 mL 發酵液中分別加入0.2 moL/L pH6.6 磷酸鹽緩沖液和1%鐵氰化鉀溶液各2.5 mL，50 ℃水浴20 min，加入2.5 mL 10%三氯乙酸溶液，于4000 r/min 離心10 min，取2.5 mL 上清液，加入2.5 mL 蒸餾水和0.2 mL 0.1%的三氯化鐵溶液，靜置10 min，在700 nm 處測定吸光度。

1.2.3.5 總抗氧化能力的測定 參考樊秋元等[19]的試劑盒方法進行測定。

1.3 數據處理

2 結果與分析

2.1 黑果腺肋花楸酵素自然發酵過程中主要成分的變化

2.1.1 還原糖含量、TSS 和酒精度的變化 圖1 為黑果腺肋花楸自然發酵過程中還原糖含量、TSS 和酒精度的變化。發酵液中的可溶性固形物主要是糖類物質，糖類是微生物利用最廣泛的碳源和能源物質，在發酵中被酵母等微生物消耗分解產生酒精和二氧化碳等物質。因此，發酵過程中還原糖和TSS 的變化規律基本一致，兩個指標隨著發酵的進行總體呈下降趨勢，尤其在前20 d 下降非常明顯，20 d 后趨于平穩，發酵90 d 時還原糖和TSS 從初始的186.59 g/L和19.0%分別降至4.18 g/L 和7.5%，而酒精度的變化規律正好與前兩者相反。酒精度在前20 d 上升較快，在發酵30 d 時酒精度已經達到最高值10.1%vol，之后緩慢下降逐漸趨于穩定，這可能是由于發酵前期酵母菌等產酒精微生物的菌數較高，消耗還原糖速度較快并產生大量酒精，隨著發酵的進行，還原糖含量的大幅度減少，中后期可利用的能源物質較少，使酒精度維持穩定，也可能由于產生的乙醇濃度較高，抑制了酵母等微生物的活動[24]，后期酒精度略有下降可能與酒精和發酵液中的酸類物質作用產生酯類物質有關[25]。

圖1 黑果腺肋花楸自然發酵過程中還原糖含量、TSS 和酒精度變化Fig.1 Changes of reducing sugar content,TSS and alcohol content during natural fermentation of black chokeberry

2.1.2 總酸含量的變化 圖2 為黑果腺肋花楸自然發酵過程中總酸含量的變化規律。總酸含量總體呈波動下降的趨勢，從初始的5.87 g/L 降低至3.94 g/L，可能是由于發酵液中的有機酸被氧化分解形成脂類，被微生物作為碳源消耗，導致其含量下降，但總酸含量在發酵第30 d 和第70 d 時略有上升，出現波動的原因可能是由于有機酸的種類和含量在發酵不同階段發生了變化，也可能是微生物的生長代謝產生了大量的二氧化碳，由于二氧化碳氣泡在發酵瓶內不穩定，使得發酵后期酵素液的總酸含量產生輕微上下浮動[26]。

圖2 黑果腺肋花楸自然發酵過程中總酸含量變化Fig.2 Changes of total acid content during natural fermentation of black chokeberry

2.1.3 總多酚、總黃酮和花色苷含量的變化 黑果腺肋花楸自然發酵過程中總多酚、總黃酮及花色苷含量變化如圖3 所示。總多酚和總黃酮含量均呈先升高后降低趨勢，在發酵10 d 時總多酚含量達到最高值4.99 mg/mL，20 d 時總黃酮含量達到最高值269.68 mg/L，相對于未發酵前分別提高了26.01%和27.12%，可能由于發酵前期在高滲透壓的環境使多酚和黃酮類物質逐步被溶解釋放至發酵液中，同時大分子酚類物質被微生物利用生成小分子酚類物質，使體系的總酚和黃酮含量呈上升趨勢。發酵20 d 后總多酚和總黃酮含量持續降低，到90 d 時分別降低至2.84 mg/mL 和166.43 mg/L，可能是由于酚類化合物與有機酸發生反應而生成酚酸類化合物；總黃酮含量的降低可能是由于酵母產生的次級代謝產物如丙酮酸、乙醛等與黃酮類物質反應，生成一些大分子衍生物；也可能是微生物產生的一些酶使其發生降解，導致其水溶性降低，從而使發酵液中總黃酮含量下降[27]。

圖3 黑果腺肋花楸自然發酵過程中總多酚、總黃酮及花色苷含量變化Fig.3 Changes of total polyphenols,total flavonoids and anthocyanins during natural fermentation of black chokeberry

花色苷的變化趨勢與總多酚和總黃酮變化不同，隨著發酵的進行，花色苷含量不斷下降，由初始的668.49 mg/L 降至90 d 時最低值17.26 mg/L，僅為初始值的2.58%，特別是發酵的前20 d 下降尤為明顯，此后下降相對緩慢。這與韋仕靜[28]報道的桑葚酵素發酵的變化一致，即桑葚酵素發酵過程中花青素持續下降，可能與植物乳桿菌等微生物作用發生生物轉化有關。

2.1.4 SOD 酶活力變化 SOD 酶具有清除自由基和過氧化氫等能力，是細胞防御系統中的主要抗氧化酶，圖4 為黑果腺肋花楸自然發酵過程中SOD 酶活力變化。SOD 酶活力總體呈先升高后降低趨勢，但在整個發酵過程中SOD 酶活力較發酵前均有顯著提高（P<0.05），說明發酵體系中具有能夠產生SOD酶的微生物，與宋愛偉等[29]的研究中乳酸菌和酵母菌兩種菌類都可以使酵素SOD 酶提高的結果一致。因此，發酵過程中SOD 酶活力的升高可能與微生物的增長有關。本實驗中前10 d 時SOD 酶活力急劇升高，達到最高值5151.80 U/mL，其活力值為發酵前的3.22 倍，發酵10 d 后開始緩慢降低。賈麗麗等[30]研究發現，SOD 酶活力與生物量變化之間呈現顯著正相關（P<0.05）。由此可知，隨著發酵體系中微生物的增加，有利于SOD 酶的產生，但是在發酵中后期，不同微生物之間存在競爭或者拮抗關系，抑制了SOD 酶的積累[31]。黑果腺肋花楸酵素自然發酵結束后，SOD 酶活力為2215.54 U/mL，雖然遠低于發酵10 d 的結果，但要高于核桃青皮果蔬酵素（1980.25 U/mL）、黑果枸杞酵素（644.45 U/mL）和諾麗酵素（376.426 U/mL）等其他酵素中的SOD 酶活力[32?34]。

圖4 黑果腺肋花楸自然發酵過程中SOD 酶活力變化Fig.4 Changes of SOD enzyme activity during natural fermentation of black chokeberry

2.2 黑果腺肋花楸自然發酵過程中抗氧化活性變化

2.2.1 DPPH、ABTS+、羥自由基清除能力變化 圖5～圖7 分別為黑果腺肋花楸自然發酵過程中DPPH、ABTS+及羥自由基清除能力變化。黑果腺肋花楸發酵液在整個發酵過程中的DPPH 自由基、ABTS+自由基及羥自由基的清除能力均高于初始樣品的清除能力（P<0.05），說明采用適度發酵的方法能夠有效提高其對自由基的清除能力。

圖5 黑果腺肋花楸自然發酵過程中DPPH自由基清除能力變化Fig.5 Changes of DPPH radical scavenging capacity during natural fermentation of black chokeberry

圖6 黑果腺肋花楸自然發酵過程中ABTS+自由基清除能力變化Fig.6 Changes of ABTS+ radical scavenging capacity during natural fermentation of black chokeberry

圖7 黑果腺肋花楸自然發酵過程中羥自由基清除能力變化Fig.7 Changes of hydroxyl radical scavenging capacity during natural fermentation of black chokeberry

隨著發酵的進行，DPPH 自由基清除能力和ABTS+自由基清除能力總體上均呈先上升后下降的趨勢，DPPH 自由基清除率于40 d 達到最大值65.78%，ABTS+自由基清除率于50 d 達到最高值85.06%，兩種自由基清除能力變化規律大致相同，這可能與發酵前期發酵液中較高的多酚、黃酮等抗氧化活成分和SOD 酶活性有關，后期DPPH 自由基清除能力逐漸減弱很可能與發酵液中微生物代謝過程中分解或消耗具有清除能力的物質有關[35]。與前兩種自由基清除能力變化有所不同，隨著發酵的進行，羥基自由基清除能力均持續升高，于70 d 達到最高值94.22%，可能是由于微生物代謝的結果；70 d 后基本穩定，該結果與蘇龍等[36]的研究結果一致。黑果腺肋花楸自然發酵過程中，DPPH 自由基清除率、ABTS+自由基清除率和羥自由基清除率的變化趨勢不一致，這與唐敏等[37]對桑葚酵素的研究結果一致，可能由于發酵過程中的微生物利用的原料成分和代謝產物不同。

2.2.2 總抗氧化能力和總還原力的變化 黑果腺肋花楸自然發酵過程中總抗氧化能力和總還原力的變化如圖8 所示。在整個發酵過程中，總抗氧化能力和總還原力均顯著高于初始樣品（P<0.05）。總抗氧化能力隨著發酵的進行，呈現先升高后降低趨勢，發酵前初始樣品的總抗氧化能力為540.82 U/mL，發酵前30 d 持續上升達到最高值750.48 U/mL，之后隨著發酵的進行而持續下降，于90 d 時降至561.17 U/mL，這與樊秋元等[19]研究中黑加侖酵素的總抗氧化能力在發酵96 h 時達到最大值844.83 U/mL 之后下降的結果一致；說明黑果腺肋花楸酵素在適度的發酵時間內有利于總抗氧化能力的增長，發酵時間的過度延長會導致總抗氧化能力逐漸降低。總還原力在發酵第10 d 時達到最高值1.014，從第10 d 開始持續波動下降，其變化與總多酚和總黃酮含量變化趨勢相似，可以初步判斷發酵液總還原力的變化與總多酚和總黃酮的變化有關。

圖8 黑果腺肋花楸自然發酵過程中總抗氧化能力和總還原力的變化Fig.8 Changes of total antioxidant capacity and total reducing power during natural fermentation of black chokeberry

2.3 黑果腺肋花楸自然發酵過程中主要成分與抗氧化相關性分析

黑果腺肋花楸自然發酵過程中主要成分與抗氧化活性相關性分析結果如表1 所示。還原糖和TSS與DPPH 自由基、ABTS+自由基和羥自由基清除能力呈顯著的負相關（P<0.05）。酒精度與DPPH 自由基、ABTS+自由基、羥自由基清除能力3 種自由基清除能力呈顯著正相關（P<0.05），相關系數為0.656～0.849。總酸和花色苷與羥自由基清除能力呈極顯著負相關（P<0.01），相關系數分別為?0.919 和?0.969。總多酚和總黃酮與總抗氧化能力和總還原力呈顯著正相關（P<0.05），這與魏雪琴等[38]研究的紅棗酵素總抗氧化能力與總黃酮和總多酚含量呈顯著正相關的結果相一致。SOD 與DPPH 自由基和ABTS+自由基清除能力呈顯著正相關（P<0.05），并與總還原力和總抗氧化能力呈極顯著正相關（P<0.01），表明SOD對黑果腺肋花楸酵素的抗氧化活性影響很大，這與張海燕等[39]的研究結果一致。

表1 黑果腺肋花楸自然發酵過程中主要成分與抗氧化活性相關性分析Table 1 Correlation analysis of main components and antioxidant activity during natural fermentation of black chokeberry

3 結論

黑果腺肋花楸自然發酵過程中，其還原糖、TSS、總酸、花色苷含量總體呈下降趨勢，酒精度持續上升后逐漸趨于穩定，總多酚、總黃酮和SOD 酶活力均呈先升高后降低的趨勢。與初始樣品相比，發酵液的抗氧化能力均顯著升高（P<0.05）。相關性分析表明，酒精度、總多酚、總黃酮、SOD 與其抗氧化活性總體呈顯著正相關（P<0.05），還原糖、TSS 和總酸與抗氧化活性總體呈顯著負相關（P<0.05）。黑果腺肋花楸自然發酵過程中代謝產物含量的變化規律，可以在一定程度上反映其發酵液中主要成分和生物活性物質的積累情況。后續將在此基礎上，深入研究黑果腺肋花楸自然發酵中微生物菌群與上述代謝產物的關系，為進一步了解黑果腺肋花楸酵素抗氧化機制以及發酵過程的調控提供更多指導和參考。