凝結魏茨曼氏菌BC66 的篩選、鑒定及特性研究

孔素芬，朱明明，朱建國，方曙光

（武漢微康益生菌研究院有限公司，湖北武漢 430000）

凝結魏茨曼氏菌（曾用名凝結芽孢桿菌）是一種既能產乳酸又能產芽孢的革蘭氏陽性細菌，最早于1915 年由Hammer[1]分離得到。凝結魏茨曼氏菌是美國食品和藥物管理局（FDA）和歐盟食品安全局（EFSA）共同認證的可以安全使用的益生菌。同時，凝結魏茨曼氏菌也列入了Generally Recognized As Safe（GRAS 普遍公認安全）和Qualified Presumption of Safety（QPS 合格安全推定）菌株名單。此外，美國食品藥品監督管理局（FDA）和美國飼料控制官員協會也將凝結魏茨曼氏菌列入到可用于飼料的安全微生物菌種名單[2?3]。

近年來，凝結魏茨曼氏菌作為新型微生態制劑，由于其益生作用和高抗逆特性，在畜牧[4]、水產養殖[5]、農業[6]和環境保護[7]等行業中被廣泛應用。劉彬等[8]發現凝結魏茨曼氏菌增加異育銀鯽幼魚血液中髓過氧化物酶和抗超氧陰離子自由基活性，有效緩解宿主重金屬中毒反應。苗華彪等[9]研究發現凝結魏茨曼氏菌在生豬養殖應用中具有改善生豬腸道健康、提高機體免疫力和抗病能力、調節腸道菌群平衡和提高動物生產性能等作用。可見凝結魏茨曼氏菌作為一種新的微生態制劑正在成為一種趨勢。但是由于菌株的挑選不規范，菌株配伍不科學，是否具有耐藥性等依然影響著微生態制劑的應用與發展。本研究對一株從仔豬糞便中分離獲得的凝結魏茨曼氏菌進行了形態特征的觀察，評價了該菌株的益生特性和安全性，同時，初步考察了與其他飼用益生菌的復配情況，證明其具備開發利用和研究價值，為凝結魏茨曼氏菌進一步的功能評價、應用擴展奠定基礎。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

病原菌：大腸桿菌ATCC25922、金黃色葡萄球菌ATCC25923、腸炎沙門氏菌ATCC14028、福氏志賀氏菌ATCC12022、化膿性鏈球菌ATCC19615

購于廣東微生物菌種保藏中心；干酪乳桿菌W189、乳酸片球菌W172、嗜酸乳桿菌W211、屎腸球菌W362、糞腸球菌W471 武漢微康益生菌研究院實驗室分離、編號、保藏；仔豬糞便 采集自湖北省種豬養殖場斷奶仔豬；小鼠 購自華中農業大學實驗動物中心，實驗動物使用許可證號為SYXK(鄂）2020-0084，小鼠實驗倫理審批編號為HZAUMO-2023-0140；蛋白胨、酵母粉 安琪酵母股份有限公司；葡萄糖、K2HPO4、MgSO4、MnSO4、NaCl、CaCO3、硫酸銨（均為分析純試劑）、豬膽鹽（膽酸含量≥60%）國藥集團化學試劑有限公司；胃蛋白酶（1:3000）上海麥克林生化科技有限公司；其他試劑為分析純試劑。

JY10002 型電子天平 上海衡平儀器儀表廠；SW-CJ-2FD 型雙人單面超凈工作臺 蘇州安泰空氣技術有限公司；SPX-250B-2 型恒溫培養箱 上海福瑪實驗設備有限公司；CX-23 顯微鏡 奧林巴斯公司；UV-1700 紫外分光光度計 上海美析儀器有限公司；pHS-3C 型pH 計 上海儀電科股份有限公司公司；D（24 L）型高壓蒸汽滅菌鍋 合肥華泰醫療設備有限公司；DK-8D 型水浴加熱鍋 常州國宇儀器制造有限公司；5415D 臺式冷凍離心機 德國Eppendorf 公司。

1.2 實驗方法

1.2.1 培養基和溶液配制 MRS 培養基（g/L）：蛋白胨10 g，牛肉浸粉10 g，酵母粉5 g，葡萄糖20 g，KH2PO42 g，檸檬酸氫二銨2 g，無水乙酸鈉5 g，MgSO40.2 g，MnSO40.6 g，Tween 80 1 mL，蒸餾水1000 mL，pH6.0～6.2，115 ℃，30 min 滅菌。

平板篩選培養基參考辛國芹等[10]報道篩選培養基：MRS 培養基基礎上添加0.25% CaCO3和1.5%瓊脂粉。

發酵培養基：蛋白胨10 g，葡萄糖5 g，酵母粉5 g，無水乙酸鈉5 g，硫酸錳0.2 g，硫酸鎂0.2 g，磷酸氫二鉀4 g，水1000 mL，pH6.8～7.0，115 ℃滅菌 30 min。

PCA 培養基：葡萄糖1 g，胰蛋白胨5 g，酵母浸粉2.5 g，瓊脂粉1.8 g/L，水 1000 mL，pH7.0～7.2，121 ℃滅菌 20 min。

胃液配制[11]：NaCl 0.5%、胃蛋白酶 0.3%，用1 mol/L HCl 調節pH 至3.0，用0.22 μm 微孔濾膜過濾除菌后備用。

膽鹽培養基[12]：取一定量的豬膽鹽加入含0.2%（w/v）的巰基乙酸鈉的MRS 培養基中，使膽鹽終濃度（g/mL）分別為0%，0.1%，0.3%，0.5%，1.0%，用0.22 μm 微孔濾膜過濾除菌后備用。

1.2.2 菌株的篩選與鑒定

1.2.2.1 菌種初篩純化 采集健康仔豬糞便樣品10 份，各取樣品1 g 分別放入裝有 9 mL 無菌生理鹽水50 mL 離心管中，振蕩15 min，使之充分混勻，靜置20～30 s，每個樣品吸取2 mL 懸液置于80 ℃水浴處理10 min[13]，分別取1 mL 進行10 倍梯度稀釋，再選擇適宜梯度的懸液涂布于含0.25%碳酸鈣的MRS 瓊脂培養基上，置于37 ℃培養箱恒溫培養48～72 h。挑取初篩平板不同形態的單菌落在PCA培養基平板上反復劃線純化，單菌落形態穩定后，編號保存。

1.2.2.2 菌株形態學觀察 平板菌落觀察：觀察菌落形態、大小、顏色、凸起有無等；菌體形態觀察：觀察油鏡下菌體的形態、大小、排列等；掃描電鏡觀察：觀察掃描電鏡下放大20000 倍菌體的立體形態、芽孢著生特點等。

1.2.2.3 16S rDNA 序列分析及系統發育樹構建 使用通用引物27F：AGAGTTTGATCCTGGCTCAG 和1492R：GGTTACCTTGTTACGACTT 進行PCR 擴增。PCR 反應體系：2×Buffer MIX 25 μL，引物27F 和1492R 各2 μL，DNA 模板2 μL，ddH2O 補足至50 μL。PCR 反應條件：94 °C 3 min；94 °C 30 s，55 °C 30 s，72 °C 1.5 min，35 個循環；72 ℃ 10 min。將PCR 產物通過凝膠電泳檢測后，產物送往武漢金開瑞生物工程有限公司測序。將測得基因序列提交至NCBI 數據庫中進行BLAST 分析比對，以16S rDNA 序列同源性≥99%為鑒定標準。

1.2.3 生理生化實驗 參照《伯杰細菌鑒定手冊》和《常見細菌系統鑒定手冊》進行。

1.2.4 生長特性的初步探究 將凝結魏茨曼氏菌單菌落接種至MRS 液體培養基進行二級活化，按照5%接種量接入裝有30 mL 發酵培養基的250 mL三角瓶中，37 ℃，250 r/min，搖床培養，以pH、OD 值為指標，觀察菌株24 h 的生長特性。

1.2.5 抗逆性實驗

1.2.5.1 培養液制備 取BC66 甘油管接種至30 mL MRS 液體培養基中進行一級活化，37 ℃，250 r/min搖床培養12～15 h，取一級培養液按5%接種量接入裝有30 mL 發酵培養基的250 mL 三角瓶中，37 ℃，250 r/min，搖床培養18～24 h 得到所需培養液。

1.2.5.2 耐酸實驗 取1 mL 培養液10000 r/min 離心1 min 后去上清加入10 mL pH3.0 的模擬胃液，置于37 °C 培養箱恒溫孵育，分別于0、2、3、4 h 不同耐受時間取樣進行活菌計數。以0 h 測定值作為空白對照，計算菌株存活率。

其中，N1表示經過處理后菌株體系中的活菌數，CFU/mL；N0表示菌株體系中初始活菌數，即0 h測得的活菌數，CFU/mL。

1.2.5.3 耐膽鹽實驗 取1 mL 培養液10000 r/min離心1 min 后去上清分別加入不同膽鹽濃度0.1%、0.3%、0.5%、1.0%（w/v）的10 mL 膽鹽培養基，置于37 °C 恒溫培養，分別于0、2 h 取樣進行活菌計數。以0 h 測定值作為空白對照，計算菌株存活率。

其中，N1表示經過處理后菌株體系中的活菌數，CFU/mL；N0表示菌株體系中初始活菌數，即0 h測得的活菌數，CFU/mL。

1.2.5.4 耐高溫實驗 將凝結魏茨曼氏菌菌株接種至PCA 固體斜面培養基上，菌體培養至形成芽孢后，取菌苔制成懸液各2 mL，分別置于70、80、90、100 ℃水浴中處理10 min，處理完后立即冷卻，取0.1 mL 懸液進行梯度稀釋活菌計數，以未水浴菌液為對照，培養48 h 后計算存活率[14]。

其中，N1表示水浴中處理10 min 后的活菌數，CFU/mL；N0表示未水浴菌液的活菌數，CFU/mL。

1.2.6 體外抑菌實驗 采用瓊脂擴散法[15]，按1.2.5培養液制備方法進行二級活化，二級培養液37 ℃250 r/min 搖瓶培養10～15 h，離心收集上清液。指示菌采用LB 液體培養基進行培養，在 37 ℃、220 r/min條件下搖瓶培養 24 h，制成1×108CFU/mL 菌懸液。指示菌懸液按1:100 的比例加入LB 瓊脂培養基溶液中，充分混勻后傾注加到放置牛津杯的平板中，凝固后取出牛津杯。將200 μL 上清液加入到7 mm 的孔中，以空白LB 培養基為陰性對照，37 ℃培養適宜時間后，測量抑菌圈的大小，檢測加入培養上清液對指示菌的抑制作用。

1.2.7 凝結魏茨曼氏菌與不同菌株的拮抗關系 參考徐秀偉[16]采用的菌種劃線拮抗方法，分別將凝結魏茨曼氏菌、干酪乳桿菌、嗜酸乳桿菌、乳酸片球菌、屎腸球菌，糞腸球菌的甘油管菌種接種至MRS 液體培養基過夜培養，取不同菌株菌液離心，留菌體。將凝結魏茨曼氏菌分別和干酪乳桿菌、嗜酸乳桿菌、乳酸片球菌、屎腸球菌，糞腸球菌在平板上兩兩呈“井”字劃線，觀察交叉菌線生長狀況，是否出現透明圈，以此判斷兩個菌株間是否存在拮抗作用。

1.2.8 安全性評價

1.2.8.1 溶血性實驗 取1.2.5 離心后的凝結魏茨曼氏菌菌體以劃線的形式接種在含1.5%瓊脂和5%脫纖維羊血的血液瓊脂（BHI 培養基）中37 ℃培養48 h，觀察溶血情況。在菌落周圍產生綠色帶（α-溶血）或在血平板上不產生任何溶血（γ-溶血）的菌株被認為是非溶血的，菌落周圍出現溶血帶（透明色帶）的菌株被歸類為具有溶血（β-溶血）特性的微生物，出現透明β-溶血環為溶血表型陽性，使用化膿性鏈球菌作為陽性質控菌株[17]。

1.2.8.2 抗生素敏感實驗 采用紙片擴散試驗法[18]。將200 μL 含108CFU/mL 的凝結魏茨曼氏菌發酵液均勻涂布于MRS 瓊脂平板上，待平板表面稍干后，放入常用抗生素藥敏紙片，貼在培養基表面中央，輕輕按壓紙片使其固定。在37 ℃培養24 h 后，測量抑制圈直徑大小。

1.2.8.3 急性毒性實驗 安全性評價采用急性毒性實驗，參照GB15193.9-2014 最大耐受劑量法進行。取體重18～22 g 的小鼠雌雄各15 只，觀察3 d 后，1 日內分2 次經口給予0.2 mL 注菌液（按小鼠體重20 g計算相當于每千克體重20 mL），連續灌胃14 d，觀察小鼠是否有中毒和死亡現象。注菌液使用0.85%生理鹽水制成含量為1×109CFU/mL 的凝結魏茨曼氏菌懸液[19]。

1.3 數據處理

所有檢測實驗均重復3 次，結果均以平均值±標準差表示。原始數據用Excel 2010 整理后采用統計學軟件SPSS statistics 21.0 進行差異顯著性分析，比較實驗中不同處理間差異。P<0.05 認為有統計學意義。

2 結果與分析

2.1 菌株篩選與鑒定

2.1.1 菌株的形態學特征及鑒定結果 對獲取的10 份仔豬糞便樣品進行熱處理，并利用菌株的耐高溫特性獲取芽孢桿菌4 株，經鑒定分別為凝結魏茨曼氏菌、枯草芽孢桿菌、地衣芽孢桿菌、解淀粉芽孢桿菌，具體結果見表1 和圖1。

圖1 不同芽孢桿菌的單菌落形態Fig.1 Single colony of different Bacillus

表1 不同芽孢桿菌菌落形態Table 1 Morphological characteristies of different Bacillus

2.1.2 形態特征觀察 將獲得的凝結魏茨曼氏菌在PCA 平板上進行稀釋涂布，得到純化后的菌株并編號為BC66，菌落形態如圖2 所示。對菌落進行革蘭氏染色在光學顯微鏡下觀察細胞形態特征，10×100光學顯微鏡觀察菌體形態呈桿狀，芽孢端生。20000 倍掃描電鏡狀態下觀察，芽孢一端膨大，呈鼓槌狀。菌株個體形態如圖3 所示。

圖2 菌落形態Fig.2 The morphology of the colony

圖3 BC66 細胞形態Fig.3 The cellular morphology of BC66

2.1.3 16S rDNA 序列分析及系統發育樹構建 使用通用引物對BC66 進行PCR 擴增，PCR 產物通過凝膠電泳檢測后，產物送往武漢金開瑞生物工程有限公司測序。將測得基因序列提交至NCBI 數據庫中進行BLAST 分析比對，通過比對確定菌株BC66 為凝結魏茨曼氏菌（Weizmannia coagulans），曾用名為凝結芽孢桿菌（Bacillus coagulans）。比較分析同源性較高的序列，構建出凝結魏茨曼氏菌的系統發育樹，見圖4。以Paenibacillus agarexedensDSM 1327（MT568608）為外枝構建的Neighbor-Joining 系統發育樹，BC66 與凝結魏茨曼氏菌標準菌株ATCC7050的16S rDNA 序列同源性99.68%，使用MEGA Ⅹ 對菌株與其他菌株進行16S rDNA 序列一起構建遺傳進化樹，可以看到BC66 與凝結魏茨曼氏菌標準菌株親緣關系較近，處于同一分支。

圖4 基因序列比對結果Fig.4 The results of gene sequence alignment

2.1.4 生理生化實驗 生理生化指標是進行細菌分類的重要依據，BC66 菌株主要依據《伯杰細菌鑒定手冊》[20]的分類原則進行，菌株的生理生化特征如表2 所示。

表2 BC66 的生理生化特征Table 2 Physiological and biochemical characteristics of BC66

從表2 可以看出菌株BC66 能利用葡萄糖產酸，尿酶反應陰性，不產H2S，吲哚實驗陰性。

2.2 生長特性初步探究

將篩選到的BC66 菌株進行初步的生長特性研究，分別在0、3、9、15、18 及24 h 取樣測定OD 值和pH，觀察菌株培養24 h 的生長特性。

微生物的生長繁殖分為4 個時期，分別為停滯期、對數期、穩定期、衰亡期[21]，從圖5 可以看出，活化后的菌株轉入到新鮮培養基后停滯期較短，18 h達到對數生長末期，之后進入穩定期。從pH 變化曲線來看，菌株BC66 的發酵液pH 在15 h 達到最低點4.61，辛國芹等[10]研究發現，凝結魏茨曼氏菌在代謝中產生有機酸，主要為乳酸和乙酸。乳酸和乙酸對于提高飼料消化率，降低胃部及后腸道pH，抑制有害菌及腐敗菌的生長繁殖，維持腸道有益微生物的生長，同時抑制腸道致病菌，改善腸道環境具有重要作用[22]。

圖5 BC66 生長趨勢圖Fig.5 The growth trend of BC66

2.3 抗逆性研究

2.3.1 耐酸特性 菌株的耐酸特征決定其通過胃液在腸道中的存活能力。正常情況下，胃酸 pH2.0～3.0，食物通過胃排空時間一般在2～4 h[23]。實驗研究了菌株在pH3.0 酸性條件下的存活情況。圖6 顯示了不同耐受時間凝結魏茨曼氏菌BC66 菌株生長情況。結果表明，該菌株在pH3.0 的模擬胃液中處理2 h時，菌株存活率可達98%；處理4 h 時，菌株存活率還保持在60%以上。說明菌株BC66 具有較強的耐酸能力，在通過胃液時，能有足夠數量的活菌在胃腸道中發揮益生作用。

圖6 BC66 在pH3.0 酸性條件下的耐受情況Fig.6 Tolerance of BC66 in pH3.0 acidic condition

2.3.2 耐膽鹽特性 膽鹽是腸道中參與機體營養消化和吸收的主要成分。益生菌在腸道中存活和定殖，必須能對小腸中的膽汁有抗性。腸道中的膽鹽濃度不是固定不變的，膽鹽濃度主要在0.03%～0.3%范圍內波動[24]。若菌株在該條件下能存活才有可能正常生長代謝[25]，菌株耐膽鹽的特性決定了其在腸道中的存活能力。實驗研究了菌株對不同濃度膽鹽的耐受能力，實驗結果如圖7 所示，在0.3%膽鹽濃度下，菌株存活率為79%，在0.5%膽鹽濃度下其存活率保持在63%。說明菌株BC66 具有較好的膽鹽耐受性，能在腸道中生長，并發揮益生作用。

圖7 BC66 在不同膽鹽濃度中存活情況Fig.7 Survival of BC66 in different bile salt concentrations

2.3.3 耐高溫實驗 高溫在實際生產中會影響產品的活性，同時也是影響產品穩定性的重要因素，凝結魏茨曼氏菌由于其芽孢具有良好的抗逆性，能耐受工業生產中的高溫高壓等不利環境[26]，本研究對BC66的耐高溫特性進行考查，將芽孢菌懸液分別置于不同溫度水浴中處理10 min 后，進行梯度稀釋活菌計數，結果見圖8，水浴溫度90 ℃處理10 min 菌體存活率達到92%，水浴溫度為100 ℃時，菌體存活率還保持約50%，金迅等[27]研究顯示凝結魏茨曼氏菌13002 在80 ℃條件下存活率可達到72%，遠低于本研究中的80 ℃高溫處理后的存活率96%，表明凝結魏茨曼氏菌BC66 具有較強的耐高溫特性，在益生菌產品加工應用領域具有更大的多樣性[28]。

圖8 BC66 耐高溫存活率情況Fig.8 High temperature survival rate of BC66

2.4 體外抑菌實驗

有動物飼養試驗顯示，飼料中添加凝結魏茨曼氏菌能抑制大腸桿菌、沙門氏菌等腸道主要有害菌，顯著改善畜禽生長性能[29?31]，本研究對凝結魏茨曼氏菌進行常見病原菌體外抑菌實驗，結果見表3，菌株BC66 對大腸桿菌，金黃色葡萄球菌，腸炎沙門氏菌，福氏志賀氏菌均表現出不同程度的抑菌能力，與陳宇等[32]報道一致，凝結魏茨曼氏菌可分泌多種凝固素、雙乙酰、L-乳酸等抑菌物質，能抑制腸道內大腸桿菌、沙門氏菌、志賀氏菌、變形桿菌等有害菌。

表3 BC66 抑制病原菌作用Table 3 Antigonistic acticity of BC66

2.5 BC66 與其他乳酸菌的拮抗關系

凝結魏茨曼氏菌對腸道有害菌及飼料源有害菌[33]抑制作用的研究較多，對多種商業飼用益生菌的研究報道較少，考慮到商業復合飼用益生菌在凝結魏茨曼氏菌與其他飼用益生菌菌株之間可能的拮抗效應[34]，本研究初步考查了BC66 和干酪乳桿菌W189、嗜酸乳桿菌W211、乳酸片球菌W172、屎腸球菌W362、糞腸球菌W471 的拮抗作用，結果如圖9所示，橫向劃線的菌株為BC66，縱向劃線的菌株為不同的益生菌，從圖中可以看出BC66 與干酪乳桿菌W189、嗜酸乳桿菌W211、乳酸片球菌W172 不存在拮抗關系，和糞腸球菌W471、屎腸球菌W362 存在較弱拮抗作用。

圖9 BC66 與幾株常規益生菌之間的拮抗作用Fig.9 The results of antagonism between BC66 and several strains of probiotics

2.6 安全性評價

2.6.1 溶血性實驗 如圖10 所示，BC66 周圍未出現透明溶血圈，而作為陽性質控菌株的化膿性鏈球菌在血瓊脂平板上出現了透明的溶血圈，表明凝結魏茨曼氏菌BC66 沒有溶血活性。

圖10 溶血性實驗結果Fig.10 The results of the hemolytic test

2.6.2 抗生素敏感性評價 抗生素敏感性實驗是考察益生菌安全性的重要檢查指標，如果菌體對抗生素敏感，說明細菌細胞中不存在抵抗這種抗生素的基因。參照美國臨床和實驗室標準協會（Clinical and Laboratory Standards Institute，CLSI）抗微生物藥物敏感實驗執行標準[35]，對15 種抗生素進行了耐抗生素的敏感性實驗研究，由表4 可知，凝結魏茨曼氏菌BC66 對15 種抗生素均處于敏感狀態，此菌株不具有耐藥性，可認為是安全菌株。

表4 BC66 對常用抗生素的敏感程度Table 4 The antibiotic susceptibility of BC66

2.6.3 急性毒性實驗 觀察飼喂后的小鼠活力情況，所有小鼠生命體征活躍，未見不良反應，均未出現中毒和死亡現象，說明菌株BC66 在GB15193.9-2014推薦劑量下進行急性毒性實驗無顯性致死作用。此外，毒理學實驗和大量臨床觀察表明凝結魏茨曼氏菌是安全菌種，沒有致突變性、致畸性和遺傳毒性[36]。

3 結論

本研究從健康仔豬糞便中分離篩選到一株耐高溫，產乳酸的凝結魏茨曼氏菌BC66，并對其作為益生菌的潛力和安全性進行了初步研究和評價。結果表明該菌株在胃腸道苛刻條件（pH3.0；膽鹽 0.3%）下具有較強的生存能力，表現出良好的抗病原菌活性和抗生素敏感性，且沒有溶血活性。此外，該菌株產生抗逆性很強的芽孢，在90 ℃下處理10 min 還能保持較高的活性，能夠抵御高溫食品和飼料生產的工業化過程，可作為潛在的益生菌產品應用于食品、飼料等領域。綜上所述，本研究從自然界分離到的新菌株凝結魏茨曼氏菌BC66 具有在飼料工業中應用的明顯優勢和潛力。然而，進一步的體內實驗和相關基因功能分析仍然需要開展，以期對該菌株的優良性狀進行全面評價，為芽孢益生菌的開發應用奠定理論基礎。