響應面優化博愛赤松茸多糖提取工藝及其抑菌和抗氧化活性研究

魏磊，王 偉，謝曉陽，周 雍，劉雨晴，馬艷妮，寧二娟，王 韜，李寧潔，景炳年

（河南省科學院，河南省納普生物技術有限公司，河南省植物天然產物開發工程技術研究中心，河南鄭州 450002）

赤松茸（Stropharia rugosoannulata）作為食用菌新秀[1]，因其食味清香，肉質滑嫩柄爽脆，且富含18 種氨基酸（包括8 種人體必需氨基酸）、多種礦物質與微量元素，以及多糖、甾醇、黃酮等生物活性成分[2?3]，而被冠之“素中之葷”的美稱[4]。現代藥理學研究顯示，赤松茸提取物，特別是赤松茸多糖具有抗氧化[5]、抑菌[6]、抑制腫瘤[7]、降血糖[8]及增強小鼠免疫力[9]等諸多藥理作用成為研究的熱點。目前對赤松茸多糖的研究主要集中在赤松茸胞外多糖的培養條件優化[10?11]、赤松茸多糖或發酵菌絲體多糖提取工藝優化[12?14]、赤松茸多糖（硒多糖）的分離純化、結構表征及生物活性評價等方面[15?17]。這些研究進一步表明赤松茸多糖具有極大研究價值和開發應用前景。

本研究室在前期研究中發現，博愛縣赤松茸因其特殊的竹下栽培模式和種植環境，導致博愛赤松茸在營養成分和生物活性物質含量方面與其它栽培模式下的赤松茸存在很大的差異[18]。博愛赤松茸多糖的含量為（13.18%±0.05%）[2]，要高于現有文獻報道的多糖含量（6.3%）[19]，且博愛赤松茸富含硒（2.57±0.47）mg/kg[2]。目前對赤松茸的富硒方式主要是通過液體發酵培養，但關于天然富硒赤松茸的研究較少。硒多糖是硒在食用菌中的主要賦存形式之一，兼具硒和多糖的雙重生物活性，具有比未富硒多糖更高的抗氧化、增強免疫，抗腫瘤等生物活性[20?21]。苗元振的研究也表明赤松茸硒多糖抗氧化能力更優于多糖[22]。博愛赤松茸中的硒是否以硒多糖的形式存在及生物活性是否增強也尚未可知。而研究上述問題的前提就是如何高效獲得博愛赤松茸多糖。

為此，本研究以獲得高效提取博愛赤松茸多糖工藝為目標，采用響應曲面方法（response surface methodoloy，RSM）進行提取工藝優化，并研究其抑菌和抗氧化活性，旨在為博愛天然富硒赤松茸和赤松茸多糖的高值化利用提供依據。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

赤松茸 購自博愛縣祥竹種植專業合作社赤松茸種植基地，采收于2021 年6 月；葡萄糖標準品（純度≥98%）天津市博迪化工有限公司；苯酚 天津市恒興化學試劑制造有限公司；大腸桿菌（Escherichia coli）、金黃色葡萄球菌（Staphylococcus aureus）、化膿性鏈球菌（Streptococcus pyogenes）、鼠傷寒沙門氏 菌（Salmonella typhimurium）、肺炎鏈球菌（Streptococcus pneumoniae）均由河南省科學院天然產物重點試驗室提供；Oxoid 胰蛋白胨 上海艾研生物科技有限公司；牛肉浸膏 廣東環凱微生物科技有限公司；微量MIC 測定板 美國Corning 公司；總抗氧化能力檢測試劑盒、ABTS 自由基清除能力檢測試劑盒 均購置索萊寶生化試劑盒事業部。

ME-204 型電子天平 美國Mettler 公司；KQ-500E 型超聲波清洗儀（功率500 W，頻率40 kHz）昆山市超聲儀器有限公司；RE100-S-數顯旋轉蒸發儀 大龍興創實驗儀器（北京）股份公司；TU-1810 型紫外分光光度計 北京普析通用儀器有限責任公司；YJ-VS-2 型超凈工作臺 無錫一凈凈化設備有限公司；LDZF-75L-II 立式高壓蒸汽滅菌器 上海申安醫療器械廠。

1.2 實驗方法

1.2.1 博愛赤松茸多糖提取工藝 采用超聲輔助法提取博愛赤松茸多糖，具體工藝如下：將干燥至恒重的博愛赤松茸粉碎過40 目篩，精密稱取博愛赤松茸粉末1 g 置于100 mL 錐形瓶中，按不同液料比加入蒸餾水浸泡12 h，在不同溫度和不同時間下超聲提取3 次，濾液合并后濃縮，定容至50 mL，搖勻備用。

1.2.2 單因素實驗 按照1.2.1 中的方法，在料液比1:25（g/mL）、超聲時間60 min 的條件下，考察20、30、40、50、60、70 ℃超聲溫度對博愛赤松茸多糖得率的影響；在最佳超聲溫度、超聲60 min 條件下，考察1:10、1:15、1:20、1:25、1:30、1:35（g/mL）料液比對博愛赤松茸多糖得率的影響；在最佳提取料液比、最佳提取超聲溫度的條件下，分別考察20、30、40、50、60、70 min 超聲時間對博愛赤松茸多糖得率的影響。

1.2.3 響應面試驗 以多糖得率作為響應值，根據單因素實驗結果，設計3 因素3 水平的Box-Behnken的中心組合試驗，對博愛赤松茸多糖提取工藝進行優化，響應面因素水平設計見表1。

表1 響應曲面試驗因素水平表Table 1 Response surface test factor level table

1.2.4 博愛赤松茸多糖含量及得率的測定 參考NY/T 1676-2008 的方法進行[23]。以葡萄糖（0.1 g/mL）作為標準品，以葡萄糖濃度為橫坐標，吸光度為縱坐標，求得葡萄糖標準曲線的回歸線方程為：A=0.01027C+0.25195，R2=0.9981。精密吸取1.2.1 中的待測多糖提取液0.2 mL 于20 mL 具塞試管中，同法操作進行測定，根據標準曲線計算出被測液中多糖質量濃度，并按下式計算各處理的多糖得率：

式中：c 為根據標準曲線求得的樣品質量濃度，mg/mL；v 為提取液體積，mL；n 為稀釋倍數；m 為原料重量，g。

1.2.5 博愛赤松茸多糖提取物抑菌活性測定 參照文獻[24]的方法測定博愛赤松茸多糖提取物的MIC和MBC。利用二倍稀釋法將博愛赤松茸多糖稀釋成質量濃度分別為400、200、100、50、25、12.5、6.25和3.125 mg/mL，在96 孔細胞培養板中加入0.1 mL 稀釋好的博愛赤松茸多糖和0.1 mL 濃度為 1×106～1×108CFU/mL 的菌懸液，37 ℃恒溫箱中培養24 h 觀察結果，完全沒有細菌生長時即為 MIC。在MIC 實驗基礎上，采用平板涂布法測定MBC。

1.2.6 博愛赤松茸多糖提取物的抗氧化活性測定參照ABTS 試劑盒說明書中的方法測定博愛赤松茸多糖提取物對自由基的清除效果，反應體系中博愛赤松茸多糖的質量濃度分別為 0.3125、0.625、1.25、2.5、5.0 mg/mL，以VC作為對照組；參照T-OAC 試劑盒說明書中的方法測定博愛赤松茸多糖提取物總抗氧化能力，反應體系中博愛赤松茸多糖的質量濃度分別為0.008、0.04、0.2、1、5 mg/mL，以VC作為對照組。

1.3 數據處理

所有實驗均重復3 次，數據結果用均值±標準差表示。使用Origin 7.5 軟件繪制趨勢曲線圖；使用SPSS 22.0 軟件進行方差分析及顯著性檢驗；Design-Expert 8.0.6 對響應面試驗結果進行分析。

2 結果與分析

2.1 單因素實驗

2.1.1 超聲溫度對博愛赤松茸多糖得率的影響 由圖1 可知，在料液比1:25（g/mL）、超聲時間60 min固定條件下，博愛赤松茸多糖得率隨超聲溫度的升高呈先升后降趨勢，在60 ℃時，多糖得率達到最高，為11.94%，說明在60 ℃時，赤松茸多糖的溶出效果最佳，溫度再升高時，伴著超聲波的空化作用，可能引起多糖的裂解，導致多糖得率下降[25]。因此，超聲溫度選60 ℃為宜。

圖1 超聲溫度對多糖得率的影響Fig.1 Effect of ultrasonic temperature on polysaccharide yield

2.1.2 料液比對博愛赤松茸多糖得率的影響 由圖2可知，在設定的料液比水平范圍內，博愛赤松茸多糖得率隨料液比增加呈先升后降趨勢，在料液比1:10～1:25 g/mL 時，多糖得率增幅比較大；在1:25～1:30 g/mL 區間時，多糖得率趨于平穩，表明液料比在此區間時，絕大部分多糖已溶出并達到了平衡，溶劑的增多對多糖溶出度的影響較小，但再繼續增加料液比，多糖得率呈明顯下降趨勢，這可能是由于溶劑用量增大，導致超聲波對赤松茸粗粉作用力減弱。因此，料液比以1:30 g/mL 為宜。

圖2 料液比對多糖得率的影響Fig.2 Effect of ratio of solid to liquid on polysaccharide yield

2.1.3 超聲時間對博愛赤松茸多糖得率的影響 從圖3 中可以看出，在20～50 min 這一區間內，超聲時間的增加顯著提高了赤松茸多糖的溶出效果（P<0.05）；在50～60 min 這一區間內，赤松茸多糖溶出效率趨于平緩，在超聲時間60 min，赤松茸多糖已基本溶出，得率最大值為13.55%；之后再增加超聲時間，多糖得率下降較為顯著（P<0.05），可能是因長時間超聲使赤松茸中部分多糖類化合物發生降解[26?27]，同時雜質溶出也會增加，導致赤松茸多糖得率不升反降，所以超聲時間以60 min 為宜。

圖3 超聲時間對多糖得率的影響Fig.3 Effect of ultrasonication time on polysaccharide yield

2.2 響應曲面法優化博愛赤松茸多糖得率的提取工藝

2.2.1 響應面試驗設計與結果 根據單因素實驗結果，采用三因素三水平響應面試驗對博愛赤松茸多糖提取工藝進行優化，試驗設計和結果見表2。

表2 響應面試驗設計方案和試驗結果Table 2 Design and experiments results of response surface methodology

2.2.2 模型的建立及顯著性檢驗 采用Design-Expert 12.0 軟件進行回歸擬合，得到二次多項回歸方程為：Y=13.25+0.6475A+0.19135B+0.1862C?0.1800AB+0.0550AC?0.0375BC?1.38A2?1.30B2?0.5687C2

由表3 可知，該模型P<0.0001，表明該模型高度顯著，實驗設計合理可信；失擬項P=0.0546，不顯著，表明其它未知因素對本實驗結果影響較小；模型的決定系數R2=0.9939，校正決定系數RAdj2=0.9861，兩者較為接近，表明該模型擬合性良好，可用于分析和預測博愛赤松茸多糖提取工藝；變異系數 CV 為1.19%，遠小于10%，說明本實驗準確度和可信度較高，模型擬合度好，模型具有統計學意義，可以用來優化博愛赤松茸多糖超聲提取工藝；該模型的信噪比為34.6104，大于4，表明該模型具有良好的分辨能力，可以用來預測。另外，從F值可以看出，本實驗中3 個因素對赤松茸多糖得率的影響程度次序為：A（超聲溫度）>B（料液比）>C（超聲時間）。

表3 二次回歸模型的方差分析結果Table 3 Analysis of variance of quadratic regression model

2.2.3 響應面交互作用分析 圖4 為各兩因素交互作用對赤松茸多糖得率影響的響應面與等值線圖，從圖可以看出，3D 響應面圖均為開口朝下的凸形曲面，表明在實驗范圍內存在最高點；等高線為橢圓形，表明在實驗范圍內存在中心點，綜合響應面和等高線圖，可知在本實驗所設計的因素水平范圍之內可以獲得赤松茸多糖超聲提取最優工藝。實驗因素對響應值的影響力大小可以從響應曲面的陡峭程度來推斷，曲面越陡，影響力越大，反之則越小，因此，本實驗中3 個實驗因素對博愛赤松茸多糖得率的影響依次為，超聲溫度>料液比>超聲時間，這與方差分析結果相一致。總的來看，3 個實驗因素對多糖得率響應值的影響均不是簡單的線性關系，交互項對響應值也有很大的影響，其中超聲溫度和料液比交互項對多糖得率的影響達到了顯著水平（P<0.05）。

圖4 各兩因素交互作用對博愛赤松茸多糖得率影響的響應面與等值線圖Fig.4 Response surface and contour plot of the interaction of each two factors on the yield of polysaccharides from Stropharia rugosoannulata in Bo'ai County

通過分析軟件，求得博愛赤松茸多糖最優提取工藝參數為超聲溫度62.34 ℃、料液比1:30.275（g/mL）、超聲時間61.73 min，在此條件下赤松茸多糖的理論預測含量為13.35%。

結合實際操作，將博愛赤松茸多糖最優提取工藝參數修正為：超聲溫度62 ℃、料液比1:30（g/mL）、超聲時間62 min，在此條件下重復實驗 3 次，測得博愛赤松茸多糖的平均得率為13.25%，與理論預測值相對誤差為0.75%，表明由該理論模型得到博愛赤松茸多糖最優提取工藝是可行的，具有一定的實際應用價值。

2.3 抑菌實驗結果

表4 為博愛赤松茸多糖提取物對5 種供試菌的抑制活性結果，由表可知博愛赤松茸多糖提取物僅對鼠傷寒沙門氏菌有較強的抑制作用，其MIC 和MBC分別為6.25 mg/mL 和12.5 mg/mL；對金黃色葡萄球菌和肺炎鏈球菌具有一定的抑制作用，其MIC 和MBC 均在25 mg/mL 以上；對大腸桿菌和化膿性鏈球菌在供試濃度范圍無明顯抑制作用。

表4 博愛赤松茸多糖對5 種常見致病菌的抑菌實驗結果Table 4 Results of antimicrobial tests for the effects of polysaccharides from Stropharia rugosoannulata in Bo'ai County on 5 kinds of common pathogens

2.4 抗氧化實驗結果

由圖5 可知，博愛赤松茸多糖提取物對ABTS+自由基清除效果隨濃度升高而增加，呈明顯量效關系，在5 mg/mL 時，對ABTS+自由基的清除率達90.60%，但在檢測范圍內，博愛赤松茸多糖對ABTS+自由基清除能力整體低于VC。采用 SPSS22.0 軟件進行回歸擬合，計算得博愛赤松茸多糖提取物對ABTS+自由基清除率的IC50為0.54 mg/mL，遠小于10 mg/mL，一般認為，某物質的 IC50在10 mg/mL 以下時，表明其具有較好的抗氧化活性[28]，因此博愛赤松茸多糖提取物的抗氧化性有潛在的研究價值。

圖5 博愛赤松茸多糖清除ABTS+自由基能力測定Fig.5 ABTS+ radical scavenging capacity of polysaccharides from Stropharia rugosoannulata in Bo'ai County

在593 nm 下，以FeSO4為標準物質繪制標準曲線，求得回歸方程為：Y=19.569X?0.0344，相關系數R2=0.9911。由圖6 可知，在0.008～5 mg/mL 供試濃度范圍內，博愛赤松茸多糖提取物對Fe3+的還原能力隨濃度的升高而增加，但在相同供試濃度下，博愛赤松茸多糖的總抗氧化能力要弱于VC。

圖6 博愛赤松茸多糖的總抗氧化能力Fig.6 The total antioxidant capacity of polysaccharides from Stropharia rugosoannulata in Bo'ai County

3 討論與結論

多糖是赤松茸的主要活性成分，具有廣泛的應用價值和前景，因而對其活性成分的提取分離就顯得尤為重要。杜敏華等[12]采用正交試驗也得到了赤松茸多糖的最優提取工藝，提取溫度65 ℃、提取時間1.0 h、超聲波功率600 W、料液比1:35（g/mL），此條件多糖得率為8.16%。該正交試驗所得赤松茸多糖最優提取工藝條件和本研究所得最優提取工藝條件除超聲波功率外，其它條件較為接近，但多糖得率比本研究低38.42%，導致二者多糖得率差異較大的主要原因可能是實驗所用赤松茸樣品不同。此外，赤松茸采摘時間、超聲功率及工藝優化所采用的方法等也會對赤松茸多糖得率造成一定的影響。

本研究抑菌實驗表明，博愛赤松茸多糖提取物的殺菌譜比較窄，其僅對鼠傷寒沙門氏菌具有較強的抑制作用，對金黃色葡萄球菌和肺炎鏈球菌具有一定的抑制活性，但對大腸桿菌和化膿性鏈球菌在供試濃度范圍無明顯抑制作用，這與翁敏劼[29]的抑菌實驗結果較為一致，但與王瑞瑞[30]的結果差異較大。王瑞瑞[30]的研究表明，25 mg/mL 的赤松茸胞外多糖對大腸桿菌、枯草桿菌和金黃色葡萄球菌的抑菌率均在90%以上，導致本研究與王瑞瑞赤松茸多糖抑菌效果差異較大的原因可能是因赤松茸子實體多糖和菌絲體胞外多糖在結構方面存在較大差異。

本研究結果表明，博愛赤松茸多糖具有很強的體外抗氧化活性，且其含量與ABTS+自由基清除率、Fe3+還原能力呈正相關性。赤松茸多糖的抗氧化活性及免疫活性是其最主要的活性，也是目前多糖研究領域的熱點。目前的研究顯示，赤松茸多糖具有比香菇、姬松茸等食用菌多糖更強的清除·OH 和·O2?的能力[31]，且能通過對自由基的清除、血液和組織抗氧化酶和非酶體系的抗氧化能力的提升，顯著改善對D-半乳糖致衰小鼠氧化損傷作用[32]。赤松茸多糖還具有預防急性肝損傷小鼠肝臟和主要臟器的氧化損傷作用、增強小鼠免疫力、恢復運動疲勞等活性[17,33]。因此，赤松茸多糖具有很大的開發潛力。

綜上可知，博愛赤松茸多糖超聲最優提取工藝條件為：超聲溫度62 ℃、料液比1:30（g/mL）、超聲時間62 min，此條件下，多糖的平均得率為13.25%。且博愛赤松茸多糖提取物具有較強的清除ABTS+自由基能力、還原 Fe3+的能力和抑菌活性，但其抑菌作用具有選擇性。本研究也僅局限于確定了博愛赤松茸多糖超聲最優提取工藝和初步評價了博愛赤松茸多糖的抑菌、抗氧化活性，但對博愛赤松茸中硒是否強化多糖的生物活性及是否以硒多糖形式存在尚未研究，這將是本研究室下一步重點研究內容。