細菌芽孢的形成、萌發及控制手段研究進展

張東春，張雅娟，孫 穎，司海山，康亞朋，馬夢戈，王志新，寧亞維

（河北科技大學食品與生物學院，河北石家莊 050000）

細菌芽孢（Spore）是芽孢桿菌屬（Bacillus）和梭菌屬（Clostridium）等細菌營養體在環境脅迫（如低溫、干旱和營養缺乏等）條件下形成的一個圓形或橢圓形、壁厚、含水量低、抗逆性強的休眠體，對各種物理和化學殺菌處理有極強的抗性[1]。芽孢因抗逆性強難以在食品加工過程中被殺滅，因此食品加工后殘存的未滅活芽孢待外界環境適宜時可迅速萌發成為細菌營養體，致使食品腐敗、變質。如存在于乳品中的蠟樣芽孢桿菌的芽孢，若加工過程中未被滅活，在乳品儲藏期間會萌發為營養體，不僅導致巴氏殺菌乳的變質，造成經濟損失，還會產生腹瀉型與嘔吐型等毒素，引起食源性疾病的爆發[2]。因而細菌芽孢的滅活是食品殺菌和保藏所面臨的主要挑戰之一。本文綜述了芽孢的結構和形成過程及相關的分子機制、芽孢的萌發過程及芽孢對萌發信號的感應、目前使用的芽孢控制技術對芽孢的作用效果及其機理，以及這些芽孢控制技術單獨或與其他技術相結合對芽孢的作用，以期為細菌芽孢控制技術的研究提供參考。

1 細菌芽孢概述

1.1 芽孢的結構

芽孢具有同心殼層形式的多層結構，其多層次結構是芽孢抗逆性的基礎。芽孢的結構分別是：孢外壁、芽孢衣、外膜、皮層、芽孢核心。其中，孢外壁和芽孢衣構成芽孢抵御外界環境的第一道屏障。孢外壁主要含脂蛋白，通透性較差，只存在于某些種屬（如蠟樣芽孢桿菌、艱難梭菌等）的芽孢結構中[3]。芽孢衣是由多種蛋白質組成的多層結構，可保護芽孢免受酶和表面活性劑等物質的損傷。芽孢外膜是芽孢形成的必需結構，但其在芽孢萌發和抵御外界損傷過程中均不起作用。皮層由交聯度低的肽聚糖構成，形成了芽孢物理上的剛性結構，可有效保持芽孢的低水分含量。另外，芽孢衣和皮層中分別含有皮層水解酶CwIJ 和SleB，可在芽孢萌發時水解皮層，打破芽孢的休眠狀態。

芽孢核心包括芽孢壁、內膜層和核區。芽孢壁由肽聚糖組成，可發展為新細胞的壁。內膜層由磷脂雙分子層組成，其流動性小、透過性極低，可保護核區DNA 免受外來物質損傷。核區含有DNA、RNA 和大多數酶以及2,6-吡啶二羧酸（2,6-pyridinedicarboxylic acid，DPA）和一些α/β小分子酸溶蛋白（α/β-type small,acid-soluble proteins，SASPs）。DPA 可與Ca2+螯合形成Ca-DPA 并置換核區水分，導致芽孢核心脫水，增強芽孢抗濕熱性；SASPs 可與DNA 緊密結合改變DNA 結構和光化學性質，保護DNA 免受部分殺菌處理（如熱、輻射和化學物質等）導致的損傷。同時，SASPs 在芽孢萌發時可降解為氨基酸從而為新蛋白質合成提供原料[4]。

1.2 芽孢的形成

1.2.1 芽孢形成的形態學特征 細菌的芽孢形成過程從形態學上可分為以下五個階段（圖1）[5]：a.軸絲形成：DNA 濃縮，形成束狀染色質；b.極性隔膜形成：細胞膜內陷形成極性隔膜，該隔膜將菌體分離成遺傳物質相同但體積不同的前芽孢和母細胞兩部分；c.裹吞作用：母細胞細胞膜快速增長，裹吞前芽孢形成雙層膜結構；d.皮層、芽孢衣形成：前芽孢雙膜間開始合成肽聚糖等物質形成初生芽孢壁、皮層和芽孢衣，母細胞產生大量Ca-DPA 并將其泵入前芽孢中以置換前芽孢核區水分；e.芽孢成熟：母細胞裂解，釋放成熟芽孢。

圖1 芽孢桿菌屬芽孢形成過程圖[6]Fig.1 Bacillus sporulation process diagram[6]

此外，芽孢桿菌屬與梭菌屬芽孢在皮層、芽孢衣形成與DPA 轉運過程中稍有不同[6]：芽孢桿菌屬芽孢先形成皮層、芽孢衣，后母細胞將DPA 泵入前芽孢置換水分；而梭菌屬芽孢則在母細胞產生DPA 泵入前芽孢后形成皮層、芽孢衣等結構。

1.2.2 芽孢形成的信號分子調控機制 芽孢的形成受信號分子調控，該過程主要在主調節劑Spo0A 和特異性的σ 因子如前芽孢σ因子（σF、σG）、母細胞σ因子（σE、σK）等調控下完成。芽孢桿菌屬尤其是枯草芽孢桿菌芽孢的信號分子調控機制研究較為深入，枯草芽孢桿菌芽孢經信號感應后，自磷酸化組氨酸激酶（KinA～E 激酶）直接將磷酸轉移酶Spo0F 磷酸化，后依次將磷酸轉移到主調節劑Spo0A（細胞進入芽孢形成期的關鍵應答調節蛋白），使得主調節劑Spo0A 被激活[6]。當Spo0A 的含量和磷酸化水平達到一定閾值時，磷酸化的Spo0A 通過調控一系列芽孢形成相關基因（如spoIIA、spoIIE、spoIIG等）啟動產孢（圖2）。

圖2 芽孢桿菌屬芽孢形成相關分子機制Fig.2 Molecular mechanism related to spore formation of Bacillus

產孢過程中，轉錄調節因子Spo0A 和σ因子（是正確識別轉錄過程中啟動子的關鍵因子）在母細胞和前芽孢的不同階段相繼活化，其中特異性的σ因子σH和Spo0A 共同調控前芽孢的基因表達啟動菌體產孢[7]。極性隔膜形成前菌體依賴σH的活性產孢；極性分離后Spo0A 誘導前芽孢和母細胞中的σF和σE活化，σF和σE可促使母細胞裹吞前芽孢；裹吞完成后，σE和σF可調控σG和σK的活化，并在σG和σK作用下形成皮層、芽孢衣等結構，最終導致母細胞裂解，芽孢游離出來。

σ因子在芽孢形成的不同階段特定表達、發揮作用。極性分離后，前芽孢中σF立即被Spo0A 活化，σF主要控制基因在母細胞和前芽孢中的不對稱表達，并指導早期芽孢發育所需的基因以及編碼σG的sigG基因的轉錄[8]。在母細胞中，σE在σF作用下被活化，σE可阻止母細胞進行第二次不對稱分裂，促進母細胞對前芽孢的裹吞，并控制許多形態發生蛋白的表達（如調控芽孢衣的組裝）；此外，σE可調控母細胞產生大量膜蛋白（如與前芽孢DPA 積累有關的SpoVV 轉運蛋白）[8]。裹吞完成后，前芽孢中σG發揮活性取代σF，σG主要調控DNA 結合蛋白（該蛋白可調控DPA 積累、萌發受體蛋白合成等過程）的表達[9]。母細胞中σK取代σE，σK負責芽孢衣相關蛋白的合成，并可調控皮層形成相關酶的合成。另外，σK控制母細胞合成DPA 合酶SpoVFAB，該酶可將二羥基二吡啶甲酸轉化為DPA，并將高水平DPA泵入前芽孢，使得前芽孢DPA 積累[10]。此外，研究發現σA是枯草芽孢桿菌唯一必需的σ因子，σA降解會使芽孢萌發生長受阻[11]。

梭菌屬芽孢與芽孢桿菌屬芽孢具有不同的信號分子調控機制，如艱難梭菌芽孢在σH作用下磷酸化Spo0A，其后以類似于枯草芽孢桿菌芽孢的調控機制進行調控，即前芽孢中表達σF和σG，母細胞中表達σE和σK，但其σ 因子的激活過程基本相互獨立，并發現σG的表達可能由Spo0A 激活[12]。相對于枯草芽孢桿菌和艱難梭菌，產氣莢膜梭菌和肉毒梭菌芽孢在σK作用下激活Spo0A 轉錄，啟動芽孢的形成，產氣莢膜梭菌芽孢中σK可調控σF、σE活化并表達，肉毒梭菌芽孢中σK調控σF活化并表達。產氣莢膜梭菌和肉毒梭菌芽孢中σF和σK的產生具相互依賴性，且σK缺失將導致母細胞無法完成裹吞過程，而σE缺失會導致產孢階段停滯，無法形成芽孢[6]。

2 細菌芽孢的萌發

芽孢萌發是指在適宜條件下，芽孢經歷DPA 釋放、皮層水解等一系列連續的降解事件，使休眠的芽孢萌發成新的營養體的過程。芽孢一旦開始萌發，其會迅速喪失對多種芽孢控制技術的抵抗力，使得芽孢易于被殺滅。

2.1 萌發過程

細菌芽孢雖處于休眠狀態但其仍可感知外界環境的變化，當外界營養適宜尤其是有萌發劑存在時芽孢便可迅速萌發。以芽孢桿菌屬芽孢為例，當萌發劑存在時，其芽孢衣外層GerP 蛋白結構發生可逆性變化，促使萌發劑滲入芽孢中，與芽孢內膜（IM）中的相應受體相互作用并誘導芽孢啟動萌發[1]。隨后萌發信號開始轉導，啟動萌發的第一階段，即H+、Na+等離子和Ca-DPA 釋放，芽孢折光性逐漸消失，芽孢核心部分水化。釋放的Ca-DPA 激活皮層水解酶啟動萌發的第二階段，即皮層開始水解，核心進一步水化、膨脹，核內新陳代謝相關的酶類活性恢復，芽孢完成萌發。之后芽孢開始后續代謝活動，轉到營養體的生長階段，此時芽孢中的多種蛋白質發生降解為新物質的合成提供原料[13]。

與芽孢桿菌屬芽孢萌發不同，梭菌屬芽孢如產氣莢膜梭菌、艱難梭菌芽孢感知萌發劑的誘導進行萌發后，先產生皮層水解酶（SleC）誘導皮層水解，后釋放Ca-DPA，致使核心水化、膨脹，內膜流動性增加，進而完成萌發[6]。

2.2 萌發劑

萌發劑是能與芽孢內物質結合后促使芽孢萌發的物質，包括營養性萌發劑（如一些特定的營養性物質）和非營養性萌發劑（如外源性Ca-DPA、十二烷基胺、肽聚糖）等。

2.2.1 營養性萌發劑 自然條件下，一些特定的營養性萌發劑（如特定的氨基酸類、嘌呤核苷類、糖類和特定的膽酸鹽等）可與芽孢內膜上萌發受體蛋白GRs（germinant receptors，GRs）結合，誘導芽孢進行生理性萌發。其中氨基酸類物質如L-丙氨酸、L-纈氨酸、亮氨酸和脯氨酸等可與不同芽孢的萌發受體蛋白結合，單獨觸發芽孢萌發，如L-丙氨酸可分別與枯草芽孢桿菌GerA 萌發受體蛋白復合物和蠟樣芽孢桿菌的GerL 或GerR 萌發受體蛋白結合，誘導芽孢萌發；L-纈氨酸可與枯草芽孢桿菌GerA 萌發受體蛋白復合物結合，誘導芽孢萌發[14]。亮氨酸和脯氨酸可分別與巨大芽孢桿菌GerU 萌發受體蛋白結合，誘導芽孢萌發。嘌呤核苷類物質如肌苷可與蠟樣芽孢桿菌的GerR、GerQ 或GerI 萌發受體蛋白結合，誘導芽孢萌發[15]。此外，一些氨基酸和糖類物質的混合物如L-天冬酰胺、D-葡萄糖、D-果糖和K+混合物（AGFK）可與枯草芽孢桿菌GerB 和GerK 萌發受體蛋白結合，誘導芽孢萌發；L-半胱氨酸、L-絲氨酸、L-蘇氨酸、L-天冬酰胺和KCl 的混合物可與產氣莢膜梭菌芽孢的脂蛋白GerKC 結合，誘導芽孢萌發。膽酸衍生物如牛磺膽酸鹽可被艱難梭菌芽孢中所含絲氨酸蛋白酶CspC 感應并在共激活劑（甘氨酸、鈣離子）作用下促使芽孢萌發，但鵝去氧膽酸對該過程具拮抗作用[16]。

2.2.2 非營養性萌發劑 芽孢還可被不依賴GRs 的非營養性萌發劑誘導萌發，如外源性Ca-DPA、十二烷基胺、肽聚糖等。其中外源性Ca-DPA 可激活芽孢皮層水解酶CwlJ，該酶可水解皮層肽聚糖，引起芽孢內源性Ca-DPA 釋放，釋放的內源性Ca-DPA 再次激活皮層水解；十二烷基胺激活SpoVA 蛋白通道釋放內源性Ca-DPA，然后內源性Ca-DPA 觸發皮層水解。即外源性Ca-DPA 和十二烷基胺皆可誘導芽孢內源性Ca-DPA 釋放、皮層水解完成萌發[17]。肽聚糖可與梭狀芽孢桿菌芽孢內膜上真核樣絲氨酸/蘇氨酸激酶PrkC 結合，誘導芽孢內源性Ca-DPA 釋放，進而誘導芽孢萌發。Liang 等[18]發現肽聚糖低至0.1 μg/mL 也具有誘導枯草芽孢桿菌和產孢梭菌芽孢萌發的作用。此外，肽聚糖來源不同，誘導芽孢萌發的情況也不同，如朱瑤迪等[19]發現僅產氣莢膜梭菌營養體所含肽聚糖可誘導產氣莢膜梭菌芽孢萌發，而芽孢皮層肽聚糖對誘導芽孢萌發基本無影響。

2.3 萌發相關的物理因素

物理因素如壓力、溫度、pH、水分活度（aw）等是影響芽孢萌發的另一主要因素。研究表明，150 MPa～600 MPa 的壓力處理可誘導芽孢萌發，但不同壓力誘導機制不同。100～200 MPa 壓力可通過激活GRs 誘導萌發；500～600 MPa 高壓可激活芽孢內膜中的SpoVA 蛋白通道，誘導Ca-DPA 釋放，進而誘導芽孢萌發[20]。此外，一些對芽孢萌發水平與芽孢培養條件之間關系的研究表明，溫度、pH、aw等過高或過低均會抑制芽孢的萌發。如枯草芽孢桿菌和蠟樣芽孢桿菌的芽孢在最適生長溫度37 ℃條件下培養，其萌發率高于30 ℃培養。Soni 等[21]發現pH 降低可抑制芽孢萌發，如pH 為4 可完全阻止蠟樣芽孢桿菌芽孢萌發；與之相似，徐茜茜[22]研究發現pH 降低可導致酸土脂環酸芽孢桿菌芽孢萌發過程延長甚至孢外壁損傷。Rao 等[17]發現aw值降至0.92 可抑制枯草芽孢桿菌和蠟樣芽孢桿菌芽孢的萌發。因此，低溫、低pH、低aw等條件均可抑制芽孢的萌發生長。

部分萌發影響因素與芽孢的相互作用如表1 所示。

表1 部分芽孢與萌發影響因素的相互作用Table 1 Interaction between some spores and influencing factors of germination

3 芽孢的控制技術及其應用

在極端環境中，芽孢休眠體可以存活數百年甚至幾百萬年[23]。若食品原料或加工過程中處理不當則很容易受其污染，導致食品腐敗、變質甚至引起食源性疾病，造成嚴重危害。因此，必須對芽孢進行嚴格控制以保障食品安全。芽孢的控制技術主要包括物理控制技術、化學控制技術和生物控制技術三類，表2 列舉了部分控制技術對芽孢的滅活效果及機制。

表2 部分控制技術對芽孢的作用效果及機制Table 2 The effect and mechanism of some control technologies on spores

3.1 物理控制技術及其應用

控制芽孢常用的物理手段包括熱處理和非熱處理（如超聲處理、高壓處理、輻照處理、等離子體處理等）等技術，這些技術可通過誘導芽孢萌發降低芽孢抗逆性后，配合后續處理滅活芽孢或直接破壞芽孢結構達到殺滅芽孢的目的。

3.1.1 熱處理技術及其應用 熱處理技術是一種常用的殺菌方法，其作用位點主要為皮層和內膜，高溫破壞芽孢皮層、損傷內膜完整性，導致孢內物質泄漏和熱抗性降低，進而殺滅芽孢[24]。與常規加熱不同，歐姆加熱處理則通過干擾芽孢核心成分加劇芽孢失活，但歐姆加熱處理與常規加熱處理產生不同的滅活機制的原因尚不清楚[25]。

熱處理對芽孢滅活的效果受熱處理溫度、菌株種類、加熱方式及誘導萌發處理等工藝的影響。Juneja 等[26]發現在相同時間（30 min）內熱處理對大米中蠟樣芽孢桿菌芽孢的失活效果隨處理溫度增加而增強：如溫度自90.5 ℃升高至99 ℃，可使失活芽孢數量增加2.53 logs；說明提高殺菌溫度可以顯著縮短處理時間。此外，不同菌株所產芽孢的熱抗性也不同：如韋氏芽孢桿菌芽孢的熱抗性強于蕈狀芽孢桿菌芽孢的熱抗性，其中韋氏芽孢桿菌芽孢經107 ℃處理1.4 min 使芽孢數量降低4 logs，蕈狀芽孢桿菌芽孢僅95 ℃處理1.6 min 芽孢數量可減少4 logs[27]。另外，加熱方式不同及誘導萌發處理等工藝也會影響熱處理對芽孢的滅活作用：Schottroff 等[25]發現歐姆加熱處理較常規加熱對枯草芽孢桿菌芽孢的滅活作用更強（121 ℃處理4.4 s 可使芽孢失活增加2.2 logs）。Ansari 等[28]研究發現水、全脂牛奶、米粥等介質中的枯草芽孢桿菌芽孢的耐熱性不同：水中芽孢的耐熱性最弱，米粥中芽孢的耐熱性最強，該現象可能與食物的粘稠度和脂肪等成分對微生物的保護作用有關。Buhr 等[29]研究發現炭疽芽孢桿菌芽孢經萌發劑處理后對熱處理的抗性大大降低：使用萌發劑處理30 min 后，經60 ℃熱處理1 h 可使芽孢數量減少>2 logs，若再次進行萌發誘導處理，則可使芽孢數量減少≥6 logs。李素等[30]發現中溫香腸中凝結芽孢桿菌芽孢經葡萄糖誘導萌發后，在后續灌制及殺菌過程中可被有效控制（芽孢生長量低于103CFU/g）。因而，增加熱處理溫度、改變食品基質如使用脂肪含量低、流動性強的食品基質或使用萌發劑進行誘導處理等可增強熱處理對食品中芽孢的滅活效果。

3.1.2 非熱殺菌處理技術及其應用

3.1.2.1 超聲處理技術 超聲作為一種非熱殺菌技術，其產生的剪切和空化效應可破壞芽孢衣的結構、改變芽孢內膜的通透性，導致水分子進入芽孢內部，降低芽孢的耐熱性[28]。Fan 等[31]發現超聲處理對降低芽孢數量無顯著影響，但超聲處理可降低芽孢對熱處理的抗性，使得超聲處理與后續熱處理產生協同作用。另外，超聲處理可使萌發芽孢失活，且該失活效果隨超聲處理溫度的增加而增加：如Fan 等[32]發現55 和63 ℃超聲處理30 min 可將枯草芽孢桿菌和蠟樣芽孢桿菌萌發芽孢數量分別減少2.06 和2.20 logs，說明超聲處理作用可能與芽孢萌發狀態有關，芽孢經誘導萌發后抗逆性降低，使用超聲處理時便可達到滅活效果。Ansari 等[28]將超聲處理應用于全脂牛奶中的枯草芽孢桿菌芽孢的控制，發現使用114 μm振幅（1.1 W/mL）超聲處理5 min 可顯著降低芽孢耐熱性（D100℃從4.51 min 降至2.94 min）。因而超聲技術多與其他殺菌處理如熱處理結合以增強其對芽孢的滅活效果。

3.1.2.2 高壓處理技術 高壓處理通過誘導芽孢萌發，進而破壞萌發芽孢結構顯著提高芽孢的熱敏感性。Wang 等[33]研究發現200 MPa 壓力處理20 min后結合500 MPa 壓力處理20 min 可破壞萌發芽孢的ATP 的合成過程。但壓力單獨處理對芽孢的滅活作用較弱導致其應用于芽孢的控制效果受限，如550 MPa 壓力處理25 min 僅對枯草芽孢桿菌芽孢造成亞致死性損傷[34]。因此，改進高壓處理工藝或以高壓為主的復合殺菌技術可能在芽孢的控制領域具有較好的應用潛力。

3.1.2.3 等離子體處理 等離子體是氣體在受到外界高能量作用時電離產生的一種物態。利用低溫等離子體技術處理水或氣體后所得的低溫等離子體活性水（plasma activated water，PAW）、大氣壓冷等離子體等可產生豐富的活性物質，具有滅菌效果好、品質破壞小、無毒副作用等優點，在食品工業中具有廣闊應用前景。低溫等離子體技術對芽孢作用靶位主要分為芽孢的外部結構及內部成分兩種：對于芽孢外部結構，低溫等離子體技術可導致芽孢形態改變，其產生的活性氧（ROS）、活性氮（RNS）等物質對芽孢外部結構產生刻蝕作用及改變膜組成成分并破壞GRs 蛋白；對于芽孢內部成分，低溫等離子體技術可導致孢內DPA 釋放、酶活性降低，損傷DNA[35]。此外，PAW 對芽孢的滅活作用隨處理溫度的升高而加劇，且牛血清白蛋白等有機物會為芽孢提供屏障以抵抗PAW 處理；初始芽孢濃度越低，PAW 滅活作用越強，這可能是外層芽孢會為內部芽孢提供物理屏障導致[36]。即較高溫度（55 ℃）、低牛血清白蛋白濃度、低芽孢濃度、低PAW 活化量（50 mL）可增強PAW對芽孢的滅活作用。因而PAW 對芽孢的滅活作用與工藝參數、芽孢所處環境因素等密切相關，導致其應用于芽孢的控制領域的難度增加。

3.1.2.4 輻照處理 輻照處理如UV-C，400 nm 藍光輻射及γ輻射等對芽孢具較好的殺滅作用。輻照處理對芽孢的主要作用位點是DNA，UV 輻射導致DNA 鏈斷裂產生特定的光產物（嘧啶二聚體如CPD 和6-4PP 及芽孢特異性光產物等）殺滅休眠芽孢，并可引起高水平的芽孢形成突變[37]。KrCl 激發光還可破壞DNA 完整性并導致內膜脂質過氧化，引起芽孢內膜損傷[38]。Taylor 等[39]發現222 nm 輻射（140 μW/cm2）處理可有效殺滅約106logs 的枯草芽孢桿菌、蠟樣芽孢桿菌和艱難梭菌芽孢，并發現輻照處理對芽孢的殺滅效果基本不受芽孢濃度的影響。Tremarin 等[40]以污染酸土脂環酸芽孢桿菌芽孢的蘋果汁為研究對象，發現使用UV-C 處理8 min 可將蘋果汁中的芽孢數量減少5 logs。因此，輻照處理在食品（尤其是液體食品）中的芽孢控制方面有著重要應用，但也需要注意輻照處理產生的自由基可能會對食品的營養成分和感官品質等產生不良影響。

3.1.2.5 脈沖電場處理 脈沖電場處理可利用高壓脈沖電源產生的電脈沖作用殺滅芽孢。脈沖光對芽孢的作用位點為芽孢衣，脈沖光處理可通過切割氨基酸鍵對芽孢衣所含部分蛋白進行降解或分離達到殺滅芽孢的目的。Clair 等[41]使用脈沖光處理細菌芽孢，發現10.8 J/cm2脈沖光處理可使枯草芽孢桿菌芽孢數量減少>6 logs。Soni 等[42]發現高壓脈沖電場在低電場強度（9.4 kV/cm）和中溫（80 ℃）條件下可將蠟樣芽孢桿菌芽孢數量減少3.1 logs。并揭示該處理可使涉及肽聚糖降解的寡糖脫乙酰酶的基因（BC1768）上調，芽孢形成時分離所需的青霉素結合蛋白的基因（BC2729）下調。

3.1.3 熱處理與非熱物理殺菌技術聯合應用 非熱物理殺菌技術（如高壓、超聲等）與熱處理結合不僅具協同殺滅芽孢的作用，而且可降低熱處理導致的食品營養物質損失[40]。其中，高壓聯合熱處理（high pressure and thermal processing，HPTP）可引起芽孢形態改變，導致部分芽孢膜、芽孢衣受損、核心中空變扁甚至導致芽孢裂解。HPTP 對芽孢的殺滅時間隨處理溫度的增高而縮短（如600 MPa 時，80 ℃處理5 min 或90 ℃處理1 min 均可滅活酸土脂環酸芽孢桿菌芽孢）[43]。董鵬[44]使用350 MPa 結合150 ℃處理0.24 s，可將牛奶中解淀粉芽孢桿菌芽孢數量降低3.5 logs。劉月[45]研究發現HPTP（600 MPa，75 ℃處理20 min）結合溶菌酶處理（0.05%）可有效滅活番茄汁中的枯草芽孢桿菌芽孢，且該處理不會明顯影響番茄汁的營養和感官品質。但HPTP 處理芽孢時存在短時處理滅活芽孢效果較差或高強度處理影響食品品質的問題，而HPTP 處理與其他技術聯用雖可降低HPTP 對食品品質的不利影響，但HPTP 處理與其他技術結合應用也導致操作步驟和成本的增加。此外，高壓與其他處理技術聯合如高壓二氧化碳處理（high pressure carbon dioxide，HPCD）被應用于芽孢的控制領域，HPCD 處理可增加內膜通透性、破壞芽孢衣結構及芽孢核心成分，從而導致芽孢失活[46]。但目前HPCD 對芽孢滅活的數學模型還需進一步研究以確定其應用于芽孢滅活最佳工藝條件。

此外，熱輔助超聲波處理（thermosonication，TS）可損傷皮層和內膜，致使芽孢皮層部分酶（如皮層轉移酶）失活，致使內膜GRs 被破壞，部分蛋白泄漏，從而導致芽孢失活[31]。TS 對芽孢的滅活效果隨超聲密度增加而增加：Fan 等[31]研究發現超聲波與80 ℃熱處理聯合使用40 min，超聲波由6.67 W/mL 增加至20 W/mL 會使枯草芽孢桿菌芽孢數量額外減少約0.45 logs。且TS 處理對嗜冷蠟樣芽孢桿菌芽孢的殺滅效果優于HPTP 處理[47]。另外，超聲預處理可降低熱處理55%的熱能需求，起到一定的節能作用[28]。

3.2 化學控制技術及其應用

控制芽孢常用的化學技術主要是通過添加一些化學類抑菌物質（如表面活性劑、化學防腐劑、商業消毒劑等）達到抑制或殺滅芽孢的作用。

3.2.1 表面活性劑 一些表面活性劑對芽孢具一定的殺滅作用，如陽離子表面活性劑十二烷基胺和十六烷基三甲基溴化銨（CTAB）不僅可誘導芽孢萌發，還能整合到萌發的芽孢內膜中破壞內膜滲透性對萌發芽孢起到殺滅作用。Mokashi 等[48]使用1 mol/L 十二烷基胺于45 ℃處理枯草芽孢桿菌、艱難梭菌芽孢（約108CFU/mL）4 h 發現芽孢滅活率高達99%。并發現十二烷基胺會消散萌發芽孢新陳代謝產生質子動力。Dong 等[49]使用CTAB 及其類似物（TAB、DTAB 等）處理蠟樣芽孢桿菌和巨大芽孢桿菌的芽孢，發現CTAB 可誘導蠟樣芽孢桿菌和巨大芽孢桿菌芽孢萌發，進而殺滅萌發芽孢，而TAB（C-14）和DTAB（C-12）誘導芽孢釋放CaDPA 的效果較差，這可能與烷基鏈長度有關。Hirokado 等[50]發現一些非離子型表面活性劑如甘油脂肪酸酯處理對枯草芽孢桿菌芽孢也具有滅活作用，且甘油脂肪酸酯對芽孢的滅活效果隨碳鏈延長而降低，其中2 mmol 單辛酸甘油酯（MC10）對芽孢滅活作用最強。

3.2.2 化學防腐劑 化學防腐劑如硝酸鹽、亞硝酸鹽、檸檬酸鹽等對芽孢的生長具抑制作用。Velugoti等[51]發現檸檬酸鈣（Ca-Cit）、檸檬酸鉀（K-Cit）和檸檬酸鈉（Na-Cit）能抑制腌制火腿和未腌制火腿中的產氣莢膜梭菌芽孢的萌發和生長，經0.5% Ca-Cit 處理6.5 h 后兩種火腿中芽孢僅生長約0.5 logs，并發現其抑制作用與肉制品冷卻時間無關；但對于KCit 或Na-Cit 處理，當肉制品冷卻時間延長至12 h以上時，則需1.0%及以上濃度方對芽孢的萌發和生長具抑制作用。Cayemitte 等[52]通過添加乳酸鈣、抗壞血酸鈣實現了鮭魚中蠟樣芽孢桿菌芽孢的高效滅活，使得芽孢數量減少7 logs。

3.2.3 商業消毒劑 一些商業消毒劑如次氯酸鈉、過氧乙酸等處理可降低芽孢的存活能力。Ghosh 等[53]發現芽孢對次氯酸鹽和濕熱的抵抗力與培養介質有關，于2×SG 產孢平板制備的芽孢次氯酸鹽抗性和耐濕熱能力明顯優于LB 平板制備的芽孢。Sudhaus等[54]發現過氧乙酸對蠟樣芽孢桿菌芽孢的滅活效果受溫度和菌株的影響，如低溫會降低過氧乙酸對芽孢的滅活效果；對于不耐受過氧乙酸的蠟樣芽孢桿菌DSM 4384 芽孢，經2.0%過氧乙酸處理30 min 可使芽孢數量減少>6 logs，而耐受過氧乙酸的蠟樣芽孢桿菌DSM 4313，需使用3.0%過氧乙酸處理60 min方可達到所需的滅活效果。

3.2.4 其他處理 抗生素、溶菌酶和金屬離子等處理也會增強芽孢的敏感性。抗生素如尼生素可對萌發芽孢或去除芽孢衣芽孢發揮抑制作用，其主要在芽孢萌發后期作用于芽孢的內膜導致芽孢死亡[55]。溶菌酶可通過誘導去除芽孢衣芽孢的萌發達到降低芽孢抗逆性的目的[56]。金屬離子如Tb3+、Dy3+等會擾亂芽孢內膜中Ca-DPA 釋放通道降低芽孢的萌發速度而對芽孢發揮抑制作用[57]。此外，F?積累會導致枯草芽孢桿菌芽孢耐濕熱性顯著降低，且F?（10～40 mmol/L）可在pH 為5.5 時顯著抑制芽孢萌發，而芽孢衣及外膜可在一定程度上阻擋芽孢對水、F?等吸收[58]。

3.2.5 化學控制技術與其他技術聯合應用 化學抑菌物質與其他技術聯用，如過氧乙酸聯合超臨界二氧化碳技術、微酸性電解水聯合超聲技術、亞硝酸鹽聯合γ輻射等技術可協同滅活芽孢。其中，過氧乙酸聯合超臨界二氧化碳技術對芽孢的作用位點是芽孢膜，其可損害芽孢內膜、破壞膜電位，抑制芽孢萌發時的氧化代謝以滅活芽孢[56]。Setlow 等[56]使用7 ppm過氧乙酸與超臨界二氧化碳聯合處理可在25 min 內將枯草芽孢桿菌芽孢數量減少6 logs。微酸性電解水與超聲技術聯合處理可先通過超聲處理破壞芽孢皮層，進而使得酸性電解水破壞內膜完整性，達到協同滅活芽孢的作用[59]。此外，為降低化學防腐劑如亞硝酸鹽在食品中的添加量，Silva 等[37]以含有較低亞硝酸鹽含量（<100 mg/kg）的肉制品為樣品，發現肉制品中亞硝酸鹽添加量為50 mg/kg 時，聯合使用γ輻射（>3 kGy）可使肉制品中產孢梭菌芽孢數量減少2 logs 及以上，且亞硝酸鹽含量和輻射劑量越高對芽孢的殺滅作用越強。化學技術雖然在芽孢控制領域表現出較好的抑制效果，但在使用時應結合實際加工環境考慮其使用劑量及對食品安全性的影響。

3.3 生物控制技術及其應用

3.3.1 生物抑菌劑應用 生物抑菌物質因具有安全性高、對食品感官品質影響小等優點，被應用于芽孢的控制領域。已有研究表明nisin 可破壞萌發芽孢膜完整性、抑制膜電位和氧化代謝，從而抑制萌發芽孢的生長，但其對休眠芽孢無抑制作用。Fan 等[32]發現枯草芽孢桿菌和蠟樣芽孢桿菌芽孢被誘導萌發后對nisin、百里香精油的敏感性增強：nisin（57 μg/mL）可將枯草芽孢桿菌和蠟樣芽孢桿菌萌發芽孢數量分別降低1.29～1.64、1.14～1.36 logs。除nisin 外，一些微生物源抑菌物質（如一些酶類、脂肽類物質等）和部分天然植物源化合物也可對芽孢起到一定的抑制作用。研究發現，酶類物質中噬菌體vB_BpuM_BpSp裂解酶Ply67 可破壞芽孢皮層，導致芽孢結構變形，進而破壞內膜完整性，致使芽孢無法萌發、內部物質溶出從而導致芽孢死亡[60]。Zhao等[61]發現細菌素JLA-9（32 μg/mL）對蠟樣芽孢桿菌芽孢具抑制作用，該細菌素可抑制萌發芽孢的代謝活性、破壞芽孢膜完整性從而有效抑制萌發芽孢的生長。Ghosh 等[53]研究發現，高濃度抗菌肽ceragenin-13（300 μg/mL）在高溫（70 ℃）條件下可激活枯草芽孢桿菌芽孢CaDPA 通道誘導孢內CaDPA 釋放，誘導芽孢萌發增強其敏感性進而滅活芽孢。Cetin-Karaca 等[62]發現天然植物源化合物反式肉桂醛（125 mg/L）在23 ℃時可完全抑制嬰幼兒米粉中污染的蠟樣芽孢桿菌及其芽孢的生長。

3.3.2 生物抑菌劑與其他技術聯合應用 目前研究較多的生物抑菌劑聯用組合為nisin 與高壓技術結合使用。Modugno 等[63]發現nisin（50 IU/mL）和高壓（500 MPa）聯用對芽孢桿菌屬芽孢具高度協同抑制作用（芽孢數量減少>4 logs），該聯合處理通過高壓破壞芽孢結構，增強nisin 對芽孢的抑制效果，從而發揮協同作用。Fan 等[32]發現55 ℃、超聲頻率為20 kHz 的TS 處理可增強萌發芽孢對nisin 的敏感性（可將枯草芽孢桿菌和蠟樣芽孢桿菌萌發芽孢數量分別降低2.38～2.39、1.38～1.50 logs）。Rao 等[64]將HPCD 處理（20 MPa、84～86 ℃）和nisin（200 IU/mL）聯合使用，發現該聯合處理對枯草芽孢桿菌芽孢具有協同滅活效果，其通過HPCD 處理依次破壞芽孢衣及皮層、增強內膜通透性，使得nisin 進入芽孢，進一步破壞內膜，從而發揮協同作用。除nisin 外，Cho 等[65]使用濃度為1%（w/v）的肉豆蔻、香菜及藏茴香粗提物分別處理枯草芽孢桿菌芽孢，發現三種提取物均可將芽孢數量減少90%以上。后使用提取物與乳酸聯合處理，發現提取物濃度0.1%～2.5%（w/v）、pH 為4～5 時對芽孢滅活作用優于單獨處理，可將芽孢數量額外降低1～3 logs。

4 結語

本文主要從細菌芽孢的形成和萌發過程入手，綜述了芽孢形成和萌發的相關機制，并對芽孢的控制手段進行了介紹，發現對芽孢的控制仍以物理和化學技術為主，這些技術雖對芽孢具較好的控制作用，但物理處理如熱處理會破壞食品品質、影響營養價值，非熱殺菌雖對芽孢具有較好的殺滅效果，但該技術成本較高，對芽孢的殺滅效果易受食品狀態、處理工藝參數的影響，且部分非熱殺菌技術在分子水平層面對芽孢的滅活機理未完全闡明，在食品中的應用研究較少，導致其在食品工業中的應用受阻；化學控制技術中多數處理僅可用于食品表面設備上芽孢的控制，無法直接應用于食品加工，化學防腐劑如亞硝酸鹽雖可直接應用于食品行業，但其仍存在安全性不高等問題。生物抑菌劑因抑菌性能優良、成本低、安全性高等優點，被應用于食品的抗菌保鮮等領域，但該技術在芽孢控制方面的應用較少，且對芽孢的抑制機制還未能完全清楚，仍需對對生物抑菌技術的應用及相關機制進行進一步研究，進而推動生物抑菌技術對食品加工過程中芽孢的應用。因此，未來芽孢的控制技術需要尋找新型綠色、安全、高效的技術，實現高效控制芽孢，保證食品的安全與食用品質。