熱應激對ICR雌性小鼠血液生化指標的影響*

田永路 李夏瑩 韋玉生 李 娜 曹 棟 朱德生

(1.北京大學心理與認知科學學院,北京 100871)(2.北京大學IDG麥戈文腦科學研究所,北京 100871)(3.北京大學實驗動物中心,北京 100871)

當動物處于適宜溫度范圍以外的環境中時,會導致動物生產性能下降,死亡率升高,繁殖能力下降,從而造成巨大的經濟損失[1]。有相關資料報道,不采取任何防暑方法的情況下,畜牧業所遭受的經濟損失多達24 億美元[2-3]。而有效的防暑降溫措施可以挽回每年至少7億美元的經濟損失[2,4]。因此,熱應激對畜牧業的發展影響巨大。而在實驗動物方面,國家標準GB 14922—2001[5-6]中取消了普通級大、小鼠,要求所有的大、小鼠必須在清潔級以上條件下生產。最新修訂的GB 14922—2022[7]中取消了清潔級大、小鼠,目前大、小鼠只有無特定病原體級(SPF級)和無菌級。所有動物要求飼養在屏障和隔離環境內,在滿足動物最大生理需求的同時,保障了動物福利,更重要的是對于實驗結果的可靠性、準確性和重復性也提供了必要的條件支撐。當今世界相互合作已趨于常態化,在科學研究過程中,課題組之間動物的交換時有發生,這就涉及到動物運輸的問題,尤其是在一些遠距離的跨國和跨省的運輸情況下,即使我們使用標準的轉運籠具,但是動物也會經常受到高溫或低溫帶來的影響,尤其是夏季7、8月份動物的運輸,往往導致熱應激發生,甚至動物運輸過程中大量的死亡[8]。

熱應激是指處于高溫環境中的機體對于熱環境提出的任何要求所做的非特異性的生理反應的總和[9]。動物主要表現為喘氣,食欲下降,飲水增加,排汗、排尿增加,代謝旺盛,精神狂躁不安[8,10-11]。導致機體出現一系列神經和內分泌變化,影響體內物質代謝的改變,而神經體液調節和物質代謝都需要通過血液循環系統協同完成各種功能的調控,因此,血液生化指標變化在一定程度上反映熱應激時動物機體物質代謝水平和組織器官的機能狀態[8]。本實驗主要檢測了血清電解質Na+、K+和Cl-濃度,血清蛋白的含量以及血清酶的活性,來探討熱應激對于小鼠神經和心血管系統、物質代謝和機體受損程度的影響。

本實驗在模擬夏季持續高溫條件下,制備小鼠熱應激模型。來探索解決長期熱應激對動物影響的因素,為未來抗熱應激的研究提供實驗依據。

1 材料和方法

1.1 材料

1.1.1實驗動物:4周齡的SPF級ICR小鼠32只,雌性,由北京維通利華實驗動物技術有限公司提供【SCXK(京)2021-0006】。實驗經北京大學實驗動物福利倫理委員會批準,倫理審批號:LAC-ZhuDS-1。動物飼養于北京大學實驗動物中心屏障設施內,相對濕度控制在40%～70%,溫度控制在22～26 ℃,適應3 d后進行實驗。

1.1.2主要儀器及試劑:羅氏全自動生化分析儀及配套試劑(羅氏公司);移液槍【大龍興創實驗儀器(北京)有限公司】;離心機(艾本德股份公司)。

1.2 方法

實驗隨機分成兩組:對照組和熱應激組。對照組16只小鼠,放于SPF級飼養室內飼養,室內溫度25 ℃,濕度40%～70%;熱應激組16只小鼠。每天將熱應激組的小鼠全部放入42 ℃(實測溫度在41～43 ℃)的生化培養箱中熱應激3 h,熱應激期間小鼠自由采食和飲水,熱應激完成后將小鼠放回飼養室。如此重復4周,期間每周隨機取對照組和熱應激組小鼠,取樣情況見表1。

表1 實驗方案(n=4)

在熱應激結束后的第7、14、21、28 天收集血液,血液收集采用眼眶靜脈叢采血方法進行,置于1.5 mL的離心管中,靜置30 min后,4 500 r/min離心10 min。取上清黃色透明液于0.5 mL離心管內,每個時間點各選取4只小鼠進行血液生化指標的測定。血液理化指標包括小鼠血清Na+、K+、Cl-、血清總蛋白(TP)、血清白蛋白(ALB)、丙氨酸氨基轉移酶(ALT)、天冬氨酸氨基轉移酶(AST)、乳酸脫氫酶(LDH)、血清堿性磷酸酶(ALP),采用羅氏全自動生化分析儀進行測定。其中Na+、K+、Cl-采用離子選擇電極法;TP采用雙縮脲法;SA采用溴甲酚綠法;ALT、AST、LDH、ALP采用速率法。

1.3 統計學分析

2 結果

2.1 熱應激對雌性小鼠血清電解質的影響

熱應激3 h/d,在第7、14、21 和28天時,動物由于長時間的熱應激,對于熱應激形成了耐受。導致的排汗、排尿和代謝都受到抑制,使得體液離子濃度變化不明顯。由表2可知,長期熱應激狀態下,小鼠血清中的Na+濃度較對照組偏高,而K+濃度均較對照組偏低,并且各組之間不存在統計學差異。C1-濃度較對照組在第28 天時顯著增高(P<0.05)。

表2 血清電解質變化結果

2.2 熱應激對雌性小鼠血清蛋白質含量的影響

從表3可以看出,熱應激3 h/d,在第7、14、21 和28 天時,應激導致的細胞損傷和代謝異常致使血漿蛋白濃度變化,血清總蛋白含量在各個時期不存在顯著差異(P>0.05),而白蛋白的含量在第28 天顯著高于對照組(P<0.01)。

表3 血清蛋白質變化結果

2.3 熱應激對雌性小鼠血清酶活性的影響

熱應激3 h/d,在第7、14、21 和28 天時,熱應激組ALT濃度均高于對照組,但是各組之間不存在顯著差異(P>0.05)。熱應激組AST濃度均高于對照組,在第21天時,熱應激組極顯著高于對照組(P<0.01);在第28 天時,熱應激組顯著高于對照組(P<0.05)。熱應激組LDH濃度在第7、21、28 天時高于對照組,并且第21天時,顯著高于對照組(P<0.05)。在第14 天時,LDH濃度低于對照組。熱應激組ALP濃度變化規律與LDH相同(表4)。

表4 血清部分酶活性變化結果

3 討論

熱應激導致機體出現神經調節和內分泌調節的變化,并引發細胞新陳代謝的改變,進一步對血液指標產生重要影響,因此,熱應激時動物血液生化指標變化在一定程度上反映了機體物質代謝水平和組織器官的機能狀態[8]。K+、Na+和C1-的濃度對于神經和心血管系統的興奮性有決定性影響[8],從實驗結果來看,熱應激7、14、21 和28 d,小鼠血清中的Na+濃度較對照組偏高,并且各組之間不存在顯著差異。而K+濃度均較對照組偏低。這可能是造成小鼠的精神狀態萎靡以及周身組織器官血流異常的原因。

熱應激組AST、LDH、ALP濃度在第21 天時顯著高于對照組。而熱應激組ALT濃度均高于對照組,但是各組之間不存在顯著差異。糖代謝中,LDH 是丙酮酸產生乳酸酵解反應的酶,而在糖酵解過程中也是關鍵酶之一。血清中,伴隨無氧酵解的加強,該酶的活性會有一定程度的升高,LDH的升高說明無氧酵解在熱應激過程中會有加強[4]。該研究發現,熱應激組LDH的活性從第14天開始逐漸升高,并在第21天出現顯著差異。然而,ALP的活性與成骨細胞的活性正相關,正常情況下與骨膠原蛋白的形成、骨鹽沉積及動物生長發育有關[4,12]。有研究[13]發現肉雞的生長速度與ALP活性呈負相關,這是高溫導致肉雞生產性能下降的重要因素。課題組的前期研究[14]也發現熱應激組小鼠的體質量與對照組相比明顯下降,隨著熱應激時間的增加,小鼠ALP 的活性逐漸下降,與文獻報道一致。

本實驗過程對于血液的收集采用的是眼眶靜脈叢采血的方法,此方法是否對小鼠血液生化指標產生影響。主要取決于操作人員的操作手法和熟練程度。而眼眶靜脈叢采血避免了與口腔分泌物的混雜,確保了血樣不被污染。從而減少了對血液生化指標的影響。有研究[15]曾報道,拔眼球采血法和舌下靜脈采血法對大鼠血液生化指標的影響中顯示,兩種方法對血液生化和血相指標無明顯影響,不存在差異。而眼眶靜脈叢采血避免了拔眼球采血所帶來的血液樣本污染的情況。因此,在采血過程中,抓取雖然也是個應激過程,但是只要熟練的保定小鼠,就不會對血液生化指標產生影響。

本研究以小鼠為模型,研究了長期熱應激對于血液生化指標的影響,發現了高溫是造成動物生產性能下降和死亡的原因,為未來抗熱應激機制以及藥物研究提供了有利的動物模型和實驗范式。