自發性先天性白內障大鼠遺傳狀況分析*

尤金煒 梁 磊 張旭亮 吳正林 董 敏 田小蕓

(東部戰區總醫院醫療保障中心實驗動物室,南京 210002)

自發性先天性白內障(TSC)大鼠是東部戰區總醫院實驗動物室2007年在SD大鼠繁殖生產時發現的5只先天性白內障大鼠為基礎培育的近交系大鼠,經過10多年的連續近交繁殖,現已39代,暫定名為TSC大鼠,我們已經對TSC大鼠的生長繁殖性能、生理生化指標、晶狀體病理學等做了詳細的分析,且根據國家標準[1]對其進行了皮膚移植以及生化標記分析遺傳質量的研究[2],該大鼠符合近交系質量標準規定。

下頜骨形態具有高度的遺傳穩定性,它們的形態和出現的變異可以作為動物突變或變異的標志,被廣泛用于實驗動物生物學研究及品系間的鑒定[3]。

微衛星(microsatellite),又被稱作短串連重復(short tandem repeats, STRs)或簡單重復序列(simple sequence repeats, SSRs),每單元長度在1～6 bp,是均勻分布于真核生物基因組中的一類分子標記,在不同的近交系動物之間存在核心序列或重復次數變化[4],國內外研究均證明微衛星標記應用于實驗動物的遺傳質量檢測,具有可靠性[5-7]。

為了保證此品系大鼠的遺傳穩定性和可靠性,本研究同時應用下頜骨形態學分析和微衛星DNA分析方法對其遺傳質量進行進一步分析,并與常用近交系BN大鼠和F344大鼠進行比較,以積累TSC大鼠的遺傳學數據,為該品系的遺傳學標準建立積累數據。

1 材料和方法

1.1 材料

1.1.1實驗動物:TSC大鼠由本實驗室提供,生產許可證號【SCXK(軍)2017-0018】;BN大鼠、F344大鼠購自上海西普爾-必凱實驗動物有限公司,生產許可證號【SCXK(滬)2018-0006】,大鼠各30只,均為6～8周齡,體質量170～200 g,雌雄各半。所有動物均在SPF級設施飼養,使用許可證號【SYXK(軍)2017-0037】,并按使用的3 R原則給予人道的關懷。

1.1.2主要儀器與試劑:電泳儀(天能EPS-100),凝膠圖像處理系統(天能3500R),基因擴增儀(天隆-DTC)。DNA分子質量Marker(索萊寶),瓊脂糖(OXOID),Taq酶(諾唯贊),DNA提取試劑盒(天根),其他試劑為國產或進口分析純。

1.1.3引物選擇:根據文獻報道,選擇近交系大鼠常用的6個微衛星位點:D3Wox9、APOC3、D11Mgh3、D12Mit2、RATIL6G和PA2S。所有引物由南京金斯瑞生物科技有限公司合成。

1.2 方法

1.2.1下頜骨形態分析:參照文獻[8]建立的方法,利用11個變異函數,1～6 為高度測量點,7～11 為長度測量點,均為右側下頜骨。拍照后利用 PhotoshopCS5分析獲得數據。

1.2.2微衛星DNA檢測

1.2.2.1鼠尾DNA提取:滅菌剪刀剪取鼠尾約30 mg,剪碎處理為細胞懸液,根據試劑盒步驟提取DNA備用。

1.2.2.2PCR擴增:反應體系為25 μL,Mix 12.5 μL,上游引物和下游引物各1 μL,模板DNA 1 μL,用超純水補足 25 μL。擴增條件:94 ℃預變性3 min,94 ℃變性 15 s,55 ℃復性 15 s,72 ℃延伸 15 s,共循環35 次。

1.2.2.3擴增產物鑒定:2.5% 瓊脂糖凝膠電泳鑒定擴增產物,30 min。凝膠圖像處理系統成像后,根據是否有穩定的條帶以及在凝膠上的泳動距離判斷結果,如果泳動距離一致,則表現為單態性;若泳動距離有差異,則表現為多態性。

2 結果

2.1 下頜骨形態分析

經方差分析,TSC大鼠、BN大鼠、F344大鼠11項下頜骨變量測量結果見表1,TSC大鼠與BN大鼠相比較,下頜骨參數有9個差異有統計學意義(P<0.01);TSC大鼠與F344大鼠相比較,下頜骨參數有5個差異有統計學意義(P<0.01)。

2.2 微衛星位點的引物和泳動距離

所選6個微衛星位點,在2.5% 瓊脂糖凝膠上均有穩定的條帶,采用泳動距離為標準進行判讀,“a、b、c……”表示不同的距離,其中a表示距離最長,依次為a、b、c……。詳見表2。

表2 6個微衛星引物序列及泳動距離(n=2)

結果顯示,同一品系不同個體之間在同一位點擴增產物的條帶完全相同,表現為單態性,泳動距離一致,詳見圖1,2;在不同品系之間表現為多態性,詳見圖3,4。其中位點PA2S、RATIL6G、D11Mgh3、APOC3可以將TSC與BN大鼠區別;位點D3Wox9、D12Mit2、PA2S、D11Mgh3可以將TSC與F344大鼠區別;D11Mgh3一個位點就可以將3種大鼠完全區別。

注:M:DNA marker;1～8.TSC大鼠

注:M:DNA marker;1～8.TSC大鼠

注:M.DNA marker;1～6.PA2S位點,7～12.RATIL6G位點;1、2、7、8.TSC,3、4、9、10.BN,5、6、11、12.F344

注:M.DNA marker;1～6.D12Mit2位點,7～12.D3Wox9位點,13～18.APOC3位點;1、2、7、8、13、14.TSC,3、4、9、10、15、16.BN,5、6、11、12、17、18.F344

3 討論

實驗動物在生命科學研究中被公認是不可缺少的“活的精密儀器”,而實驗動物的遺傳狀況對動物實驗的結果有著非常大的影響。但是實驗動物在生產、繁殖、應用過程中,常會造成實驗動物遺傳物質的改變,進而影響實驗數據的準確性。所以實驗動物遺傳質量監測是實驗動物標準化管理一個極其重要的內容,是確保實驗動物品系純度和同一性的重要手段。

下頜骨形態是遺傳力很高的性狀,由某些多態性位點決定,具有品系特征,一般環境因素對下頜骨形態幾乎沒有影響,是一種很好的定量分析技術,下頜骨分析屬于表型檢測,也是國標中近交系動物遺傳檢測方法之一。

微衛星 DNA有著基因位點多、多態性高、擴增片段短的特點,同樣在近交系動物中微衛星的長度一般不會變化,可以作為某一品系的恒定參數,不同品系則可能存在差異,因此微衛星DNA的檢測在實驗動物遺傳檢測和品系鑒定中具有非常重要的價值。

近年來,利用微衛星進行遺傳檢測的報道很多,有研究[9]分析了國內6個品系、8個近交系大鼠群體;有研究[10]選取了87個微衛星標記,對 6 種近交系大鼠進行遺傳檢測;還有研究[11]建立了大鼠 24 個微衛星位點庫,優選出 6 個微衛星位點,可用于3 種常用近交系大鼠的監測;同時也有研究[6]就實驗小鼠、大鼠微衛星DNA檢測法標準的編制進行了詳細的闡述。

本研究結合下頜骨測量和微衛星檢測,對TSC大鼠進行遺傳分析。結果表明,TSC大鼠、BN大鼠、F344大鼠11項下頜骨變量測量結果與TSC大鼠和BN大鼠相比較,X1-X7、X10-X11差異極顯著(P<0.01);TSC大鼠與F344大鼠相比較,X1、X3-X5、X7差異極顯著(P<0.01)。采用的6個微衛星位點,結果顯示同一品系不同個體之間在同一位點擴增產物的條帶完全相同,表現為單態性,微衛星位點均為純合,符合近交系動物的遺傳質量標準。在不同品系之間表現為多態性,6個微衛星位點的組合可用于TSC大鼠與常用近交系大鼠品系BN和F344的遺傳背景監測,4個位點可以將TSC大鼠與BN大鼠區別,4個位點可以將TSC大鼠與F344大鼠區別,組合后均可區分3種大鼠,其中D11mgh3一個位點就可以將3個品系大鼠完全區別。

生物醫學的發展離不開實驗動物,實驗動物發展的基礎是遺傳質量控制,隨著現代生物技術高速發展,檢測手段和檢測儀器在不斷的進步,分子生物學技術被廣泛的運用到檢測中。微衛星作為第二代遺傳檢測技術,其優點是操作簡便,重復性好,無需安樂死實驗動物,只需剪小段尾巴提取 DNA 進行檢測,符合動物福利和3R原則,主要應用于近交系動物的遺傳分析,但尚未形成國家標準,本研究測定的TSC大鼠和常用近交系大鼠品系BN、F344的6個微衛星位點,為大鼠遺傳監測工作提供了有益的參考,也積累了TSC大鼠的遺傳學數據和監測方法,為該品系大鼠的深入研究及應用推廣建立了較為系統的原始資料。