牙鲆細胞因子M17蛋白原核表達及其多克隆抗體制備

蘇玉鳳　馬倩倩　孫敬鋒

摘??? 要：M17是魚類細胞因子IL-6亞族家族的成員之一，具有細胞因子樣功能，在魚體內發揮抗病毒和抗細菌的作用。為了制備牙鲆（Paralichthys olivaceus）M17蛋白的多克隆抗體，將M17基因插入pET-32a原核表達載體，構建M17基因原核表達質粒pET-32a-M17。將構建的質粒pET-32a-M17轉化感受態大腸桿菌BL21（DE3）細胞，通過IPTG誘導M17蛋白表達，利用Ni-NTA親和層析柱純化M17重組蛋白。利用純化的重組M17蛋白免疫小鼠獲得M17多克隆抗體（抗血清）。結果顯示，IPTG誘導后M17蛋白分子質量大小約為50.0 ku，M17重組蛋白主要以包涵體表達為主；Ni-NTA親和層析柱純化后透析復性后M17重組蛋白濃度為597 μg·mL-1；多克隆抗體經雙向瓊脂免疫擴散法檢測抗體效價為1∶16，經Western blotting分析可見單一目的條帶，說明制備的多克隆抗體具有較強的特異性。綜上可知，M17重組蛋白表達成功，且制備的抗M17多克隆抗體可用于M17蛋白的生物學功能研究。

關鍵詞：牙鲆；M17蛋白；原核表達；重組蛋白；多克隆抗體

中圖分類號：S96??? ?????文獻標識碼：A????????? DOI 編碼：10.3969/j.issn.1006－6500.2023.08.008

Prokaryotic Expression and Polyclonal Antibody Preparation of M17 Protein in Flounder （Paralichthys olivaceus）

SU Yufeng， MA Qianqian， SUN Jingfeng

（College of Fisheries， Tianjin Agricultural University/Tianjin Key Laboratory of Aquatic Ecology and Aquaculture， Tianjin 300384， China）

Abstract： M17， a member of cytokine IL-6 subfamily， has cytokine-like functions and exerts antiviral and antibacterial effects in fish. To prepare polyclonal antibody against the M17 protein of Paralichthys olivaceus， the M17 gene was inserted into the pET-32a vector to construct a prokaryotic expression plasmid pET-32a-M17. The constructed plasmid pET-32a-M17 was transformed into competent E. coli BL21（DE3） cells， and the expression of M17 protein was induced by IPTG. The recombinant protein was purified by Ni-NTA affinity chromatography. The polyclonal antibody （antiserum） was obtained by immunizing mice with purified recombinant M17 protein.The results showed that the molecular weight of M17 protein was 50.0 ku， and the recombinant M17 protein was mainly expressed in inclusion body. After purification by Ni-NTA affinity chromatography， the concentration of M17 recombinant protein was 597 μg·mL-1. The titer of the polyclonal antibody was 1∶16 by double immunodiffusion. A single target band was observed by western blotting analysis， indicating that the prepared polyclonal antibody had a strong specificity. These results indicates that the recombinant M17 protein is successfully expressed， and the prepared anti-M17 polyclonal antibody could be used to study the biological function of M17.

Key words： Paralichthys olivaceus; M17 protein; prokaryotic expression; recombinant protein; polyclonal antibody

哺乳動物白細胞介素（IL）-6細胞因子家族包括IL-6、抑癌素M（OSM）、IL-11、纖毛神經營養因子（CNTF）、心肌營養素樣細胞因子（CLC）、白血病抑制因子（LIF）、心肌營養素-1（CT-1）和IL-27[1-5]。IL-6細胞因子家族是造血、神經內分泌和免疫系統的主要參與者，既具有促進炎癥的功能，也可以抵抗炎癥發作[2，6-7]。一些研究已證實，在魚類中存在IL-6、IL-11、CNTF和M17等IL-6細胞因子家族，而M17被鑒定為可能是LIF和OSM的祖先分子的魚類特異性分子[7]。

牙鲆（Paralichthys olivaceus）屬鰈形目（Pleurone-ctiformes），鲆科（Bothidae），牙鲆屬（Paralichthys），是我國名貴的海產魚類，但在養殖過程中會面臨如殺魚愛德華氏菌或鰻弧菌等各種病害威脅[8]。M17是魚類細胞因子IL-6亞族家族的成員之一，M17具有細胞因子樣功能，在魚體內發揮抗病毒和抗細菌的作用[9]。此外，Hanington等[7]研究發現，M17可誘導金魚巨噬細胞分化和一氧化氮的產生。M17在巨噬細胞亞群中的表達量比在單核細胞和祖細胞中高，而且在激活的巨噬細胞內表達被上調，用重組的M17處理單核細胞亞群會加速單核細胞向巨噬細胞分化，說明它在髓細胞生成中發揮重要作用。Wang等[10]研究發現，抑制M17在神經系統中會延遲恢復視神經損傷。目前，有關M17的分子生物學特征以及免疫生物學活性，特別是對魚類機體非特異性免疫和特異性免疫調節作用的研究尚未見報道。為此，本研究構建M17的原核表達載體pET-32a-M17，利用原核表達M17制備M17多克隆抗體，為研究牙鲆M17的功能打下基礎。

1 材料與方法

1.1 基因、載體及試劑

牙鲆M17基因M17的全長cDNA由天津市水產生態及養殖重點實驗室克隆于pMD18-T載體上。原核表達載體pET-32a、大腸桿菌DH5α、大腸桿菌Rosetta（DE3）由天津市水產生態及養殖重點實驗室保存。限制性內切酶BamH Ⅰ、Hind Ⅲ ，寶生物工程（大連）有限公司；異丙基-β-D-硫代吡喃半乳糖苷（IPTG），北京索萊寶科技有限公司；Ni-NTA親和層析柱、蛋白Marker，Merck公司；羊抗鼠IgG-HRP、Anti-His Antibody、Western-blotting硝酸纖維素膜，北京天根生化科技有限公司；健康BALB/c小鼠10只，雌性，4～5周齡，購自中國人民解放軍軍事醫學科學院實驗動物中心。

1.2 M17原核表達載體構建

PCR擴增M17的ORF區的引物采用生物軟件BioEdit設計，由華大基因合成，預期擴增片段為600 bp。上游引物M17-F：5'-CGCGGATCCAATGGTTATG

TAAAGAGAATGA-3'，并引入一個上游BamH I限制性位點（下劃線）；下游引物M17-R：5'-CCCAAGCTTGTATCCCCCTGCAGACTTTG-3'，引入一個Hind III限制性位點（下劃線）。以pMD18-T-M17為模板，M17-F和M17-R為引物進行PCR擴增。95 ℃預變性12 min；94 ℃變性30 s，56.3 ℃退火30 s，72 ℃ 延伸90 s，連續30個循環；72 ℃延伸10 min。PCR擴增產物經BamH I和Hind III雙酶切、凝膠純化后連接到同酶雙酶切的pET-32a表達載體上。將連接產物轉化到大腸桿菌DH5α中。陽性克隆經菌落PCR和DNA測序證實。理論上，得到的重組質粒pET-32a-M17可以表達C端帶有額外6-His標簽的M17融合蛋白，這有利于通過Ni2+螯合親和純化融合蛋白。

1.3 M17重組蛋白表達與可溶性檢測

陽性克隆菌株經測序鑒定正確后，將表達菌株pET-32a-M17置于LB/Amp液體培養基中振蕩培養過夜。次日，按照體積比1∶100加入到200 mL同樣的培養液中，37 ℃振蕩培養。當菌液OD600 nm達到0.5～0.6時，分別加入IPTG至終濃度為1 mmol·L-1，37℃誘導4 h，取出50 mL菌液12 000 r·min-1離心10 min收集菌體沉淀。將菌體重懸于15 mL的PBS緩沖液中，超聲破碎菌體（超聲程序為：300 W，工作5 s，間歇10 s，共8 min），12 000 r·min-1離心10 min分別收集上清液和沉淀，并以未用IPTG誘導，未超生破碎菌液和pET-32a空載體轉化大腸桿菌Rosetta（DE3）做對照，進行12% SDS-PAGE聚丙烯酰胺凝膠電泳檢測分析。

1.4 M17重組蛋白純化

按照Merck公司Ni-NTA親和層析柱說明書純化表達蛋白。步驟如下，對單克隆陽性菌進行擴大培養，誘導重組蛋白表達，參照1.3離心收集100 mL菌液的菌體并加入4 mL預冷的1×結合緩沖液，重懸菌體，超聲波破碎，4 ℃下12 000 r·min-1離心10 min，收集沉淀。加入與5 mL預冷含6 mol·L-1鹽酸胍的1×結合緩沖液，重懸沉淀，冰浴1 h，4 ℃下12 000 r·min-1離心30 min，去除不溶成分。用0.45 μm濾膜過濾，取上清液。將上清加到1 mL50% Ni-NTA His·Bind樹脂懸浮液中，4 ℃輕柔混勻（300 r·min-1），室溫結合60 min。加樣至空色譜柱中，除去柱下端封閉蓋子，以4 mL Bufffer B漂洗雜蛋白2次，以0.5 mL Bufffer C洗脫目的蛋白4次。對純化的蛋白進行透析和濃縮，采用考馬斯亮藍法測定樣品中蛋白的濃度并通過SDS-PAGE電泳和Western blotting進行驗證，-80 ℃保存備用。

1.5 多克隆抗體制備及檢測

將純化復性M17蛋白用于免疫10只小鼠制備抗體。免疫前，每只小鼠尾靜脈取血1 mL，血液在37 ℃放置1 h后，置于4 ℃過夜，然后在4 ℃下以5 000 r·min-1離心20 min。收集血清作為陰性對照。具體免疫方案如表1所示。首次免疫將M17蛋白與等體積弗氏完全佐劑混合乳化后，背部和腹腔多點皮下注射免疫小鼠。2周后，使用弗氏不完全佐劑乳化重組蛋白，采用腹腔皮下注射，加強免疫2次，每次間隔7 d。之后采用腹腔皮下注射M17蛋白4次，每次間隔7 d。第7次免疫5 d后，通過眼球采小鼠血，根據上述方法收集抗血清并隨后在-80 ℃保存直至進一步使用。采用雙向瓊脂凝膠免疫擴散法檢測抗體效價，并采用Western blotting檢測抗血清特異性。

1.6 雙向瓊脂擴散實驗測定抗血清效價

采用雙向瓊脂凝膠免疫擴散法檢測抗體效價，具體步驟參照張淑莉等[11]方法。將培養皿洗凈烘干高壓滅菌備用，配制1%生理鹽水瓊脂，倒平板，厚約2～3 mm，待瓊脂凝固后，用打孔器打孔（孔徑3 mm，孔間距5 mm），呈梅花形，挑去孔內瓊脂。用移液器加樣，中心孔加抗原原液約20 μL，周圍各孔按順序依次加入20 μL倍比稀釋抗血清，抗體分別是1∶2、1∶4、1∶8、1∶16、1∶32、1∶64，注意加樣時以注滿為度，不要有氣泡。加完樣后將培養皿置于濕盒內，放入恒溫箱37℃擴散24 h，觀察有無沉淀線產生，以出現明顯沉淀線的最高稀釋度作為檢測血清效價。

1.7 Western blotting檢測分析

用12%的SDS-PAGE將蛋白質分離后，將凝膠浸泡在轉膜緩沖液中，在300 mA下，使用濕轉法將蛋白轉移到膜上60 min。在室溫下，將膜在5%脫脂奶粉中孵育1 h，然后用PBST洗滌3次（每次10 min）。將膜與Anti-His Antibody（1∶300）或制備的抗M17多克隆抗體（1∶300）在4 ℃孵育過夜。洗滌3次后，將膜與二抗（HRP標記羊抗鼠IgG，稀釋度為1∶500）在37 ℃孵育1 h。然后用PBST洗滌3次，用PBS洗滌1次。使用DAB顯色液避光顯色，觀察拍照。

2 結果與分析

2.1 pET-32a-M17重組質粒的構建與鑒定結果

采用PCR方法從pET-32a模板中擴增出編碼M17蛋白的開放讀碼框。在引物中設計BamH I和Hind III位點，便于克隆到pET-32a載體中。將600 bp的PCR產物克隆到pET-32a載體中，轉化感受態大腸桿菌DH5α。通過PCR和酶切篩選克隆（圖1），菌落PCR鑒定結果顯示，在600 bp處附近出現單一、明亮的目的條帶，而陰性對照則無目的條帶（圖1-A）。雙酶切驗證結果可見在600 bp和6 300 bp處有電泳條帶（圖1-B）。

2.2 重組蛋白誘導表達及可溶性檢測結果

pET-32a-M17重組質粒轉化BL21（DE3）感受態細胞，經1 mmol·L-1的IPTG誘導后取樣，SDS-PAGE結果顯示約50 ku左右出現表達條帶，其大小與M17預測分子量一致。此外，誘導組的上清液中沒有明顯的條帶出現（圖2樣品g），而沉淀中出現明顯條帶（圖2樣品h）。這說明目的蛋白主要在包涵體中表達。而陰性對照組pET-32a空載體轉化大腸桿菌Rosetta（DE3）經IPTG誘導和不誘導，以及pET-32a-M17重組載體轉化大腸桿菌Rosetta（DE3）不誘導均未見目的條帶（圖2樣品a、b、c、d、e），與預期結果一致。

2.3 重組蛋白純化及Western blotting檢測結果

利用Ni-NTA親和層析柱對M17重組蛋白的富集作用，通過洗脫液洗脫后進行SDS-PAGE電泳檢測可看見在50 ku左右有目的蛋白條帶，條帶單一清晰（圖3-A），純化透析得到的M17重組蛋白濃度為579 μg·mL-1（表2），其Western blotting顯示Anti-His Antibody能特異性識別大小約為50 ku的條帶，其大小與SDS-PAGE結果一致，表明Anti-His Antibody所識別蛋白即為目的蛋白，且具有良好的生物活性（圖3-B）。

2.4 免疫效價及特異性檢測結果

純化復性后的M17重組蛋白免疫小鼠制備M17多克隆抗體，采用瓊脂糖雙向擴散法檢測其抗體效價結果表明該多克隆抗體的抗體效價達1∶16（圖4-A），可進行抗原特異性識別。進一步采用Western blotting檢測多克隆抗體的特異性，結果顯示，各孔上等量的純化的M17蛋白進行SDS-PAGE，利用不同稀釋倍數的血清作為一抗在相同的孵育時間進行Western blotting，均在50 ku處可見單一條帶，且1∶400倍稀釋血清的條帶最深，為最佳稀釋濃度（圖4-B）。

3 討論與結論

免疫系統主要功能是防御和維護機體自身穩定，細胞因子是魚類免疫系統的重要組成部分。細胞因子M17是神經系統和免疫系統的參與者，在魚體內可發揮抗病毒和抗細菌的作用[9]。在國外研究中，M17已在鯉魚、金魚、斑馬魚、綠斑點河豚和虎河豚中被報道[7，9-10]。然而，M17的研究目前僅涉及克隆基因以及分析細菌、脂多糖和肽聚糖對M17在魚體內表達的影響。有關M17的分子生物學特征以及免疫生物學活性的研究尚未見報道。為此，本研究利用原核表達M17制備M17多克隆抗體，為研究牙鲆M17的功能打下基礎。

基因重組技術在分子生物學實驗室是一項非常重要的技術，可使目的DNA在外源宿主細胞中繁殖并表達以產生重組蛋白[12]。根據表達宿主的不同，蛋白質表達系統可分為原核和真核表達系統。其中，真核表達系統具有翻譯后加工修飾的功能，但成本高。原核表達系統是研究最多、掌握最成熟的表達系統，不僅成本低，表達效率還高，適用于制備多克隆抗體[13-14]。pET系列載體具有構建效率高、蛋白表達量高、標簽小、易分離純化等優勢[15]。pET-32a表達載體在N-端和C-端均有His-Tag標簽，后續可采用Ni-NTA親和層析柱對蛋白進行純化。因此，本研究采用pET-32a表達載體構建pET-32a-M17重組質粒，并轉化BL21（DE3）感受態細胞，在IPTG誘導下M17重組蛋白主要在包涵體中得到高效的表達。而包涵體形成的主要原因是原核表達系統缺乏翻譯后修飾過程和輔助蛋白折疊的機制，使得外源基因沒有辦法達到自發折疊和卷曲，從而不能形成具有一定結構和功能的蛋白質，只能以不溶性沉淀物的形式表達[16]。包涵體的聚集不會使酶或蛋白失活[17]。因此，本研究采用包涵體的純化方法直接純化M17重組蛋白用于制備M17的多克隆抗體，發現抗體能與純化的M17蛋白發生特異反應，為今后開展 M17蛋白的表達定位、Western blotting、免疫沉淀等試驗奠定基礎。本研究成功誘導表達M17蛋白并制備了M17多克隆抗體，為進一步開展M17蛋白功能與作用機制的研究提供了重要保障。

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收稿日期：2023-04-18

基金項目：天津市海水養殖產業技術體系創新團隊（ITTMRS2021007）

作者簡介：蘇玉鳳（1996―），女，廣東高州人，在讀碩士生，主要從事魚類疾病與免疫學研究。

通訊作者簡介：孫敬鋒（1976—），男，山東泰安人，教授，博士，主要從事水產動物疾病與免疫防控研究。