羅氏和浩源核酸檢測系統的性能比較

盛 丹

南通市中心血站檢驗科，江蘇 南通 226014

我國常見的經血傳播病毒有人類免疫缺陷病毒（HIV）、乙型肝炎病毒（HBV）、丙型肝炎病毒（HCV）等，這些病毒不但嚴重危害感染者的生命安全、降低生活質量，還會在社會上引起恐慌和紊亂的情緒［1-3］。我國大多數采供血機構傳統的血液檢測策略都是采用兩種不同廠家的試劑進行酶聯免疫吸附試驗（ELISA），剔除人類免疫缺陷病毒抗原/抗體（HIV-Ag/Ab）、乙型肝炎病毒表面抗原（HBsAg）、丙型肝炎病毒抗體（HCV-Ab）、梅毒螺旋體抗體（TP-Ab）陽性的血液標本。但由于ELISA 存在病毒檢測“窗口期”長、免疫靜默感染及病毒株變異等問題，中華人民共和國國家衛生健康委員會在原有血液檢測策略的基礎上，增加了一遍病毒核酸檢測（NAT）。NAT直接對病原體核酸進行檢測，具體檢測項目為HBV-DNA、HCV-RNA、HIV-RNA，不受個體免疫反應差異的影響，并且由于其擴增放大技術，使得NAT 可以明顯縮短HBV、HCV、HIV 檢測的“窗口期”，具有高度的敏感性和特異性，進一步降低病毒經血傳播的風險，保障了血液及血液制品的安全［4-6］。南通市中心血站在2015年引入浩源多重核酸檢測系統，2017年又引入羅氏Cobas S201多重NAT系統。本研究通過收集兩套NAT系統的檢測數據，分析兩套系統的檢測性能差異及原因，現將結果報告如下。

1 資料與方法

1.1 一般資料

穿越系統中查詢匯總2020 年1—12 月南通市中心血站血液標本病毒NAT的結果。所有血液標本從采集到檢測報告最終發放全過程均符合我國《獻血者健康檢查要求》及《血站操作技術規程（2019 版）》中的相關規定，核酸標本管為含分離膠的EDTA-K2 抗凝真空采血管，所有檢測均在72 h內完成。

1.2 主要儀器與試劑

Hamilton Star 匯集設備（瑞士Hamilton）、Cobas Am?pliPrep 全自動核酸分離純化分析系統、Cobas TaqMan 全自動醫用PCR分析系統、浩源ChiTaS BSS1200匯集和核酸提取設備（上海浩源），ABI 7500 熒光PCR 儀（美國ABI），TECAN EVO 加樣器（法國Tecan），全自動酶標儀FAME24/20（法國Hamilton），全自動酶標儀BEP-Ⅲ（德國Siemens）。羅氏乙型肝炎病毒、丙型肝炎病毒、人類免疫缺陷病毒（1+2 型）核酸檢測試劑盒（PCR-熒光法）（Version 2）（批號：E31914、F07571、F19971、F31699），上海浩源科技有限公司乙型肝炎病毒、丙型肝炎病毒、人類免疫缺陷病毒（1 型）核酸檢測試劑盒（PCR- 熒 光 法）（批 號：MF20190505、MF20190606、MF20190607、BB20200402、BB20200603），HBsAg 診斷試劑盒（北京萬泰、廈門新創），HCV-Ab 診斷試劑盒（上海科華、廈門新創），HIV-Ab 診斷試劑盒（北京萬泰），HIV-Ag/Ab 診斷試劑盒（廈門新創），TP-Ab 診斷試劑盒（廈門新創，北京萬泰）。

1.3 檢測方法

無償獻血志愿者捐獻的血液標本，首先采用兩種不同廠家酶免診斷試劑盒進行HIV-Ag/Ab、HBsAg、HCV-Ab、TP-Ab 的檢測，以及谷丙轉氨酶（ALT）的檢測，然后將酶免雙陽性和ALT 陽性的標本剔除，最后余下的標本進行多重核酸混樣檢測。羅氏檢測系統每批試驗都有試劑盒自帶的陰性對照1個pool，陽性對照3個pool和康徹思坦外部陽性質控1 個pool，每6 份標本混樣成1 個pool 進行檢測。浩源檢測系統每批試驗都有試劑盒自帶的陰性對照1 個pool，陽性對照1 個pool 和康徹思坦外部陽性質控1 個pool，每8份標本混樣成1個pool進行檢測。混檢無反應性的標本直接判定為陰性；混檢有反應性標本需繼續采用原混樣檢測系統進行下一步的拆分單項檢測，若拆分單項檢測無反應性則標本判定為陰性，若拆分單項檢測有反應性則標本判定為陽性。所有ELISA 檢測和NAT 檢測均嚴格按照試劑和儀器使用說明書進行操作和結果判定。

1.4 統計學方法

采用SPSS 24.0 軟件進行統計分析。計量資料以均數±標準差（±s）表示，組間比較采用t檢驗。計數資料用例數和百分比（%）表示，組間比較采用χ2檢驗。以P＜0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2020 年1—12 月南通市中心血站共有無償獻血志愿者血液標本97 628例，剔除酶聯免疫吸附試驗雙試劑陽性和轉氨酶不合格標本638 例，余下96 990 例標本進行核酸檢測，混檢反應性pool 數為136 例，拆分單檢陽性標本數為78 例，總的拆分陽性率為57.35%，總的陽性檢出率為0.80‰。羅氏和浩源核酸檢測系統分別檢測標本84 798 例和11 512 例標本，兩套核酸檢測系統拆分陽性率的比較，差異無統計學意義（χ2＝0.801，P＞0.05），陽性檢出率的比較，差異無統計學意義（χ2＝0.167，P＞0.05）。

3 討論

輸血是臨床工作中挽救患者生命和治療疾病的一種常用有效手段，臨床所用血液全部來自于無償獻血志愿者的捐獻，血液是一種不可以制造，也不能用其他制品替代的寶貴資源。但血液中也會存在多種病毒，在我國最常見的主要有HIV、HBV 和HCV 等，可通過輸血造成病毒的感染［7-9］。采供血機構傳統的血液檢測策略是采用兩遍不同廠 家 的ELISA 試 劑 對HIV-Ag/Ab、HBsAg、HCV-Ab 和TP-Ab 進行檢測，但ELISA 法檢測病毒的“窗口期”較長，且易受病毒隱匿性感染、病毒變異株等因素干擾而造成漏檢，使臨床用血存在安全隱患。為了進一步提高我國臨床用血和血液制品的安全性，降低經血傳播疾病風險，中華人民共和國國家衛生健康委員會要求全國采供血機構在原有的血液檢測策略基礎上增加一遍病毒NAT。NAT 可以將HBV、HCV 和HIV 感染檢測的“窗口期”由原來的56 d、70 d、22 d分別縮短至33 d、12 d、11 d；還可以減少病毒株變異、急性感染恢復期及慢性隱匿性感染等原因造成的漏檢［10］。

本研究經ELISA 和ALT 檢測剔除陽性標本后，采用羅氏和浩源兩套NAT 系統進行病毒NAT 標本的結果進行統計分析，得知本實驗室總的NAT 陽性檢出率為0.80‰，這一結果低于鹽城的1.56‰［11］、徐州的1.04‰［12］，高于上海的0.63‰［13］、鄭州的0.66‰［14］、濟南的0.37‰［15］。羅氏和浩源兩套NAT 系統均可從ELISA 陰性的標本中檢測出HBV-DNA 陽性標本，分別為66例和11例，羅氏核酸檢測系統還檢出HCV-RNA 陽性標本1 例，這些數據表明增加NAT可明顯降低肝炎病毒經血傳播的風險。兩套NAT系統雖然所檢測的標本并不盡相同，標本數量也存在明顯差異，導致統計分析所收集的數據可能會有一定偏差。但是，它們所檢測的標本均采集于同一地區、同一時間段的無償獻血志愿者，從血液的采集到檢驗均嚴格按照血站操作技術規程執行，因此降低了其影響，具有一定的參考意義和價值。羅氏和浩源兩套NAT 系統拆分陽性率分別為57.26%、57.89%，表明兩套系統檢測的重復性接近。兩套系統標本陽性檢出率分別為0.79‰、0.90‰，符合同一地區、同一時間段人群感染概率應接近。兩系統與其他研究者統計的羅氏陽性檢出率0.60‰［16］、0.64‰［17］，浩源陽性檢出率0.90‰［16］、0.74‰［18］相比，結果也均相近。兩套系統可以互為備用設備，滿足應急要求，同時可用于日常無償獻血志愿者的血液篩查工作。

羅氏和浩源均為多重NAT系統，即同一反應管中同時進行HBV-DNA、HCV-RNA、HIV-RNA 多個核酸靶標擴增與檢測的技術，并能根據熒光標記區分具體的檢測項目。實驗過程具有簡便、快速、高通量的優勢，能滿足采供血機構大規模血液篩查的需求。兩套系統相比較，羅氏NAT 系統全自動化程度更高，提取與擴增體系的全封閉性也更好，同時實驗結果的判定有計算機系統的二次判讀，人為影響因素更少，結果更穩定。浩源NAT系統部分試劑需檢驗人員進行配置，標本提取完畢后需人工轉運擴增條至擴增區，最終檢測結果的判定也需檢驗人員根據檢驗規則進行判讀，人工參與度相對較高。在核酸檢測靶標方面，羅氏系統除檢測HIV-RNA1 型還進行HIV-RNA2 型的檢測，對HIV 病毒的檢測比浩源系統更加全面。在成本上，浩源系統低于羅氏系統。浩源系統檢測通量也略大于羅氏系統，更適合大規模血液標本的篩查。本實驗室為兩套NAT系統交替使用，間隔期間備用實驗室仍應加強定期的清潔消毒及室內污染監測；儀器需定期開機運行、維護及校準；試劑需存放在合適溫度的醫用冰箱內；工作人員需定期巡視查看實驗室及冰箱溫度、濕度，并做好相應記錄。工作人員還需每月對各套NAT系統的性能指標進行統計分析，既可以進行同一系統內的同期比較，也可以進行不同系統間的平行比較，對檢測系統中可能出現的誤差及早發現，并組織工作人員進行檢測技術和知識的培訓學習、經驗交流，對工作中出現的不規范操作及時進行糾正，確保檢測結果準確、穩定。

病毒酶聯免疫吸附試驗檢測的是病毒的抗原、抗體，病毒從進入人體到產生一定濃度的抗體需要一段時間，所以會有檢測的“窗口期”。而病毒核酸檢測的是病毒的DNA或RNA，并且有擴增放大效應，即使微量的病毒核酸也能被檢測到，可以縮短病毒檢測的“窗口期”；靜默感染會造成酶聯免疫吸附試驗的漏檢，但對病毒核酸的檢測沒有影響；酶聯免疫吸附試驗也有優勢，就是抗原、抗體存在時間長，而病毒核酸的存在有間歇現象，所以酶聯免疫吸附試驗可檢測的時效性更長。病毒酶聯免疫吸附試驗和NAT 法是無法相互替代的，而兩者聯合應用相互補充，對病毒的漏檢率有明顯的降低作用[19-20]。

本實驗室在日常血液篩查工作中注重檢測儀器與試劑的不斷升級更新，工作人員也定期進行最新專業技術與知識的培訓、工作經驗的交流分享，保證實驗結果的準確性。