小麥 G6PDH基因家族的鑒定與表達分析

車 卓,張沛沛,陳 濤,劉 媛,馬靖福,田 甜,王 鵬,楊德龍,

(1.甘肅農業大學生命科學技術學院,甘肅蘭州 730070; 2.甘肅省種子總站,甘肅蘭州 730070;3.干旱生境作物學國家重點實驗室,甘肅蘭州 730070)

葡萄糖-6-磷酸脫氫酶(glucose-6-phosphate dehydrogenase,G6PDH)是磷酸戊糖途徑的關鍵限速酶[1]。根據亞細胞定位,植物G6PDH可分為胞質型和質體型,均由細胞核基因編碼。其中,質體型又可劃分為P0、 P1和P2三種類型。P1和P2類型分別主要定位于葉綠體和質體中,P0是一類非功能性酶(AtG6PD4)[2]。植物G6PDH基因首先在馬鈴薯中被分離到,之后相繼在水稻[3]、擬南芥[4]、大麥[5]和大豆[6]中分別克隆到6、5、5和9個G6PDH基因家族成員,其中擬南芥AtG6PDH5、AtG6PDH6基因和大豆Gm G6PDH2、Gm G6PDH4、Gm G6PDH6基因屬于胞質型[4,6]。研究發現,大豆中胞質型Gm G6PDH基因主要在根和種子中高表達,而質體型基因大多在葉片中表達[6]。胞質型G6PDH的活性占整個細胞中G6PDH活性的80%～95%,顯著高于質體型G6PDH的活性[7]。

相關研究表明,G6PDH不僅參與植物生長發育[8],還參與非生物脅迫的應答反應[4,9]。過表達甜楊胞質型PsG6PDH基因可顯著提高轉基因煙草的耐旱性、抗病性和抗冷性[10];擬南芥AtG6PDH6與糖原合成激酶GSK-3互作,通過調節還原型谷胱甘肽(GSH)的水平,促進H2O2的積累,從而提高植株對鹽脅迫的抗性[11];過表達大豆GmG6PDH2基因可顯著提高轉基因大豆的耐鹽性;大麥幼苗葉片和根中HvG6PDH1～HvG6PDH4基因受干旱和鹽脅迫誘導表達,其中胞質型HvG6PDH2基因在氧化脅迫反應過程中起主導作用[5]。

目前G6PDH基因家族的研究主要集中在擬南芥、水稻、大豆等作物上,而在小麥中尚未見報道。因此,本研究擬利用生物信息學手段對小麥G6PDH基因家族成員的理化性質、系統發育、基因結構、染色體分布、蛋白質保守結構域進行探究,并分析小麥G6PDH基因家族成員的時空表達模式以及鹽脅迫和干旱脅迫下該基因家族成員的表達變化,以期為進一步探究小麥G6PDH基因調控小麥的抗逆性機制奠定基礎。

1 材料與方法

1.1 小麥 G6PDH基因家族成員的鑒定

從Ensembl Plants數據庫(http://plants. ensembl.org/info/data/ftp/index.html)下載小麥基因組、蛋白質、CDS以及注釋文件等信息。分別以已經報道的擬南芥和水稻G6PDH蛋白序列為參考,進行BLASTP比對(E-value<10-5),搜索小麥基因組中的G6PDH基因家族成員。同時從Pfam數據庫(http://pfam.xfam.org/)下載 G6PDH蛋白的C-terminal NADP-dependent G6PD domain(PF02781)和 N-terminal NADP+-binding domain(PF00479)保守結構域,作為模板序列,利用HMM隱馬爾科夫模型對小麥蛋白數據庫進行檢索比對,得到含有該保守結構域的蛋白序列。將上述兩種方法得到的蛋白序列去重后,進一步利用SMART(http://smart.embl-heidelberg.de/)和 Pfam數據庫驗證候選蛋白是否含有小麥G6PDH家族成員所特有保守結構域,去除不含完整保守結構域的蛋白序列,最終獲得小麥Ta G6PDH基因家族成員。

1.2 小麥 G6PDH基因家族成員的系統進化、基因結構及氨基酸序列分析

從擬南芥基因組數據庫(http://www.arabidopsis.org)和水稻基因組數據庫 (http://rice.plantbiology.msu.edu/)分別下載擬南芥和水稻的G6PDH 蛋白序列。用Clustal W2軟件對擬南芥、水稻和小麥的G6PDH蛋白序列進行多序列比對,用MEGA 6.0 軟件采用NJ(neighbor Joining)法和Possion模型構建系統進化樹,Bootstrap參數設置為1 000。從Ensembl Plants數據庫下載小麥和擬南芥G6PDH的基因組序列和CDS序列。用TBtools軟件獲取小麥和擬南芥G6PDH基因家族成員的DNA 序列和CDS 序列。用GSDS 2.0(http://gsds.cbi.pku.edu.cn/)對小麥和擬南芥G6PDH基因的結構進行可視化。

1.3 小麥G6PDH蛋白的理化性質和亞細胞定位分析

用ExPASy在線工具(https://web.expasy.org/compute_pi/)計算小麥G6PDH蛋白的等電點和分子量。用TargetP 2.0(http://www.cbs.dtu.dk/services/SignalP/)和 iPSORT(http://ipsort.hgc.jp)軟件預測分析小麥G6PDH蛋白信號肽的剪切位置。用ProtComp 9.0軟件(http://www.softberry.com/berry.phtml?topic=protcomppl&group=programs&subgroup=proloc)對小麥G6PDH蛋白進行亞細胞定位預測。

1.4 小麥 G6PDH基因的染色體定位及順式作用元件分析

從小麥族同源基因數據庫Triticeae-GeneTribe(http://wheat.cau.edu.cn/TGT/)獲取小麥G6PDH基因在染色體上的物理位置,用TBtools軟件[12](https://github.com/CJ-Chen/TBtools)進行可視化,并截取小麥G6PDH基因起始密碼子上游2.0 kb的DNA序列。用PlantCARE在線軟件(http://bioinformatics.psb.ugent.be/webtools/plantcare/html/)進行啟動子順式作用元件分析,用TBtools軟件進行可視化。

1.5 小麥 G6PDH基因家族成員重復事件分析

用MCScanX(https://gmplib.org/download/gmp/gmp-6.1.2.tar.bz2)鑒定小麥G6PDH基因是否發生片段復制事件[13]。片段復制事件滿足兩個條件:(1)兩條蛋白序列的相似性大于80%;(2)相同序列占比對序列的80%。用TBtools軟件的Circos功能包對鑒定到的串聯重復基因進行可視化。用KaKs_Calculator 2.0 軟件(https://sourceforge.net/projects/kakscalculator2/)計算片段復制基因的非同義替換率(Ka)和同義替換率(Ks),獲得基因的Ka/Ks比率,分析CDS區的適應性進化。

1.6 小麥 G6PDH基因的組織表達模式和逆境表達模式分析

從小麥WheatOmics 1.0數據庫[14](http://202.194.139.32/expression/index.html)下載小麥5個組織(根、莖、葉、穗和種子)以及干旱脅迫和熱脅迫下的轉錄組數據FPKM(fragments per kilobase of transcript per million fragments mapped),用TBtools軟件繪制表達熱圖。為進一步了解小麥在干旱和鹽脅迫處理下小麥G6PDH基因的表達模式,以供試小麥品種晉麥47為材料,將種子表面消毒后,培養兩周,然后使用含有 20% PEG-6000和200 mmol·L-1NaCl的營養液進行干旱脅迫和鹽脅迫處理,分別在脅迫處理0、3、6、12、24和48 h后取小麥的根組織樣品,在液氮中速凍后保存于-80 ℃冰箱。同時將未處理的幼苗經春化處理后轉移至溫室中,采集根、莖、葉、20～30 mm幼穗、40～50 mm幼穗以及花后10 d的種子,于-80 ℃保存。

參考RNAprep Pure Plant Kit(DP432)試劑盒(天根,北京)說明書提取小麥不同組織以及干旱脅迫和熱脅迫處理下植物的總RNA,使用ReverTra AceTMqPCR RT Master Mix with gDNA Remover (TOYOBO,日本) 進行cDNA第一條鏈的合成。用Primer Premier 5.0軟件設計特異性引物(表1),參照KOD SYBR○RqPCR Mix (TOYOBO,日本)的PCR反應體系,在QuanStudioTM5實時熒光定量PCR儀(Thermo Fisher,美國)上進行qRT-PCR。PCR反應程序:98 ℃ 2 min;98 ℃ 10 s,60 ℃ 15 s,68 ℃ 20 s,共40個循環。以TaActin為內參基因,采用2-ΔΔCT法計算基因的相對表達量。

表1 qRT-PCR分析所用到的引物

2 結果與分析

2.1 小麥 G6PDH基因家族成員的鑒定及染色體定位結果

根據6個擬南芥G6PDH基因和5個水稻G6PDH基因編碼的蛋白序列,利用同源搜索和HMM比對搜索,在小麥數據庫中初步鑒定得到14個G6PDH候選基因。進一步使用Pfam和SMART數據庫進行驗證,發現這些候選蛋白均包含N端NADP結合結構域和C端NADP依賴的G6PD結合區保守功能域,說明鑒定得到的14個G6PDH基因家族成員結構域完整。染色體定位結果表明,這14個基因家族成員分布在2A、2B、2D、4A、4B、4D、6A、6B和6D染色體上,平均每條染色體含有1～2個G6PDH基因(圖1)。

圖1 小麥 G6PDH基因家族成員的染色體定位

2.2 小麥 G6PDH基因家族的系統進化分析

用MEGA 6.0 軟件構建14個小麥G6PDH基因與6個擬南芥G6PDH基因、5個水稻G6PDH基因的進化樹,結果(圖2)表明,3個物種的G6PDH基因分為2個類型,即胞質型和質體型,其中質體型G6PDH基因又可分為P0、P1和P2三個亞類。小麥G6PDH基因家族成員與水稻G6PDH基因親緣關系較近。

圖2 小麥、擬南芥和水稻 G6PDH基因的系統進化樹

2.3 小麥G6PDH蛋白的理化性質和亞細胞 定位

14個小麥G6PDH蛋白的氨基酸序列長度為470～632 aa,分子量為52 841.87 ～71 603.68 kD,等電點(pI)為5.53～8.71,其中6個蛋白為堿性蛋白,其余均為酸性蛋白(表2)。利用TargetP 2.0和 iPSORT對小麥G6PDH蛋白的轉運肽進行預測,9個G6PDH蛋白含有信號肽。利用ProtComp 9.0對小麥G6PDH蛋白進行亞細胞定位預測,9個G6PDH蛋白定位于葉綠體中,5個G6PDH蛋白定位于細胞質中。

表2 小麥 G6PDH基因家族成員信息及其編碼蛋白的特征

2.4 小麥和擬南芥 G6PDH基因結構及G6PDH蛋白保守結構域分析

構建14個小麥G6PDH基因與6個擬南芥G6PDH基因的系統進化樹(圖3A),發現這些基因可分為Cy、P0、P1和P2四個亞組。其中,Cy亞組包含5個小麥G6PDH基因和2個擬南芥G6PDH基因,P0和P1兩個亞組均包含3個小麥G6PDH基因和1個擬南芥G6PDH基因,P2亞組包含3個小麥G6PDH基因和2個擬南芥G6PDH基因。利用Pfma數據庫對G6PDH蛋白進行結構域預測,發現小麥和擬南芥G6PDH蛋白均含有NADP結合結構域和NADP依賴的G6PD結合區保守功能域(圖3B)。基因結構分析顯示,相同亞組內同一分支的小麥和擬南芥G6PDH基因具有相似的外顯子-內含子組成模式,不同分支的外顯子-內含子組成模式有所差異;Cy亞組除TaG6PDH5-6B基因含有14個外顯子外,其他基因均含有15個外顯子;P0亞組除TaG6PDH3-4D基因含有10個外顯子外,其他基因均含有12個外顯子,P1亞組基因均含有8個外顯子,P2亞組基因均含有10個外顯子(圖3C)。對小麥G6PDH蛋白的氨基酸序列進行比對,結果(圖4)顯示,所有小麥G6PDH蛋白的氨基酸序列都含有高度保守的底物結合位點(RIDHYLG)、NADP+-結合位點(NEFVIRLQP)和Rossman fold(GASGDLAKKK)結構域。但TaG6PDH3-4A/4B/4D蛋白中這三個保守結構域的個別氨基酸發生了變化,暗示它們的功能可能不同于其他家族成員。

圖4 小麥G6PDH蛋白的氨基酸序列比對及保守結構域分析

2.5 小麥 G6PDH基因片段復制分析結果

對小麥G6PDH家族基因進行共線性分析,結果共鑒定出17對片段重復基因,其中2A和2B染色體上的重復基因最多,均具有6個片段復制基因。胞質型亞組成員均存在1個片段復制事件,包含10個片段重復基因,其中2A、2B、6A、6B和6D染色體均具有4個片段重復基因(圖5和表3)。質體型亞組成員存在3個片段重復事件,每一對片段重復基因均屬于同一亞組。本研究結果表明,小麥G6PDH基因家族的擴展起源于片段復制。非同義替換率(Ka)和同義替換率(Ks)的比例是評價基因自然選擇壓力的基礎。Ka/Ks=1,表示中性選擇;Ka/Ks<1,表示存在純化選擇,即負選擇效應;Ka/Ks>1,表示存在正選擇效應。本研究中片段復制基因的Ka/Ks在 0.062 584～ 0.513 445之間(表3),說明這些基因在負選擇作用下進化。

不同顏色表示小麥G6PDH 基因的片段重復基因對。

表3 小麥 G6PDH基因家族成員的片段重復分析

2.6 小麥 G6PDH基因的順式作用元件分析

利用PlantCARE在線軟件對小麥G6PDH基因啟動子區域的順式作用元件進行分析,結果共鑒定到8個激素響應元件和13個非生物脅迫響應元件。激素響應相關元件主要包括脫落酸響應元件(ABRE)、生長素響應元件(AuxRR-core和TGA-element)、茉莉酸甲酯相關元件(TGACG-motif和CGTCA-motif)以及水楊酸相關元件(TCA-element)。非生物脅迫響應元件主要包括干旱脅迫響應元件(DRE core、MBS、MYC和W box)、低溫脅迫響應相關的調控元件等(圖6)。其中,脫落酸響應元件(ABRE)、茉莉酸甲酯相關元件(TGACG-motif)和干旱脅迫響應元件(MYC)廣泛存在于11個小麥G6PDH基因的啟動子區域。TaG6PDH5-6A/6B/6D基因主要包含非生物脅迫響應元件W box、DRE core和MYC,而含有的激素響應相關元件較少。另外,TaG6PDH2-2A和TaG6PDH2-2B基因啟動子區含有較多的低溫響應元件,暗示它們在低溫脅迫響應過程中發揮重要作用。

圖6 小麥 G6PDH基因家族成員啟動子的順式作用元件分布

2.7 小麥 G6PDH基因在不同組織和非生物脅迫下的表達分析

從多組學數據庫WheatOmics中下載小麥不同組織G6PDH基因的RNA-seq數據,發現小麥G6PDH基因在不同組織中的表達模式不同。從圖7A可知,TaG6PDH4-6A/6B/6D和TaG6PDH3-4A/4B/4D基因在莖、穗及發育早期的籽粒中表達量較高,在其他組織中表達量較低;TaG6PDH1-2A/2B/2D在不同發育時期的根中表達量均高于其他組織;TaG6PDH2-2A/2B基因在根、發育中期的幼穗以及花后2 d的籽粒中表達量較高;TaG6PDH5-6A/6B/6D基因除了在花后10 d的籽粒中表達量較低外,在其他組織中的表達量均相對較高。

對干旱和熱脅迫下小麥G6PDH基因家族成員的表達模式進行分析,結果(圖7B)顯示,干旱脅迫下,TaG6PDH2-2A和TaG6PDH2-2B基因在干旱脅迫1 h后上調表達,大部分成員在干旱脅迫6 h后下調表達。熱脅迫下,TaG6PDH2-2A和TaG6PDH2-2B基因在熱脅迫6 h后上調表達,TaG6PDH1-2A/2B/2D、TaG6PDH3-4A和TaG6PDH5-6A/6B/6D基因在熱脅迫6 h后下調表達。除TaG6PDH4-6A/6B/6D基因外,其他成員在旱熱共脅迫條件下均下調表達。

隨機挑選6個小麥G6PDH基因,用qRT-PCR技術檢測其在不同組織中的表達模式,結果(表4)表明,TaG6PDH1-2A、TaG6PDH1-2D和TaG6PDH2-2B基因在根中的表達量均最高;TaG6PDH3-4A基因在花后10 d的籽粒中表達量最高;TaG6PDH4-6A基因在葉片中的表達量最高;TaG6PDH5-6B基因在根中的表達量最高,但與葉片中的表達量無顯著差異。qRT-PCR驗證結果與RNA-seq分析結果基本一致。

表4 G6PDH基因在小麥不同組織中的相對表達量

為進一步揭示小麥G6PDH基因家族成員在不同脅迫下的表達模式,用qRT-qPCR技術分析小麥根中 6 個G6PDH基因在干旱和鹽脅迫下的表達水平。干旱脅迫后的結果(表5)表明,與對照(干旱脅迫0 h)相比,TaG6PDH1-2A和TaG6PDH1-2D基因在干旱脅迫6 h和12 h時顯著上調表達,均在脅迫6 h時達到峰值;TaG6PDH3-4A基因在干旱脅迫24 h和48 h時顯著上調表達,在脅迫48 h時達到峰值;TaG6PDH4-6A基因在干旱脅迫3 h和6 h時顯著上調表達,在脅迫3 h時達到峰值;TaG6PDH5-6B基因在干旱脅迫各時間點均顯著上調表達,在脅迫3 h時達到峰值;而TaG6PDH2-2B基因的表達量在干旱脅迫各時間點與對照處理間均無顯著差異。

表5 qRT-PCR分析小麥 G6PDH基因在干旱和鹽脅迫下的表達模式

鹽脅迫后的結果(表5)表明,與對照(鹽脅迫0 h)相比,TaG6PDH1-2A基因在鹽脅迫12 h和24 h時均顯著上調表達,在脅迫12 h時達到峰值;TaG6PDH1-2D基因在鹽脅迫6、12和24 h均顯著上調表達,在脅迫12 h時達到峰值;TaG6PDH2-2B基因在鹽脅迫各時間點均顯著上調表達,在脅迫6 h時達到峰值;TaG6PDH3-4A基因在鹽脅迫6、12和48 h時均顯著上調表達,在脅迫12 h時達到峰值;TaG6PDH4-6A基因在鹽脅迫3、24和48 h時均顯著上調表達,在脅迫48 h時達到峰值;而TaG6PDH5-6B基因在除鹽脅迫24 h的其他各時間點均顯著下調表達。這些結果表明,大部分小麥G6PDH基因可能同時參與了小麥對干旱和鹽脅迫的響應。

3 討 論

本研究在小麥中共鑒定出14個G6PDH基因,多于擬南芥(6)[3]、水稻(5)[4]和大麥(5)[8]中的G6PDH基因家族成員數目。原因可能是小麥包含A、B和D三個亞基因組,大部分G6PDH基因在小麥染色體上存在三個部分同源基因。不過,TaG6PDH2基因只在A和B基因組中存在單個位點,推測在小麥進化過程中部分同源基因發生了丟失現象[15]。

小麥多倍體形成過程中,基因復制事件和轉座事件是基因家族擴張或重排的重要驅動力[15],串聯重復事件和片段復制事件是植物基因家族擴張的主要方式,在植物適應性進化過程中發揮著重要作用[16]。本研究共鑒定出17對片段重復基因對,大多數片段復制基因屬于胞質型,而在小麥G6PDH基因家族成員中未發現串聯復制基因,表明片段復制可能是小麥G6PDH基因家族擴張的主要原因。

前人對大豆和大麥G6PDH蛋白的研究結果發現,大部分G6PDH蛋白底物結合區的核心基序為(RIDHYLG),NADP+結合區基序為(NEFVIRLQP)[5-6]。本研究中TaG6PDH3-4A/4B/4D蛋白不含典型的基序(RIDHYLG),同時TaG6PDH3-4D蛋白也不含NADP+結合區基序。本研究對擬南芥、水稻和小麥G6PDH基因進行了聚類分析,發現小麥TaG6PDH3-4A/4B/4D基因與擬南芥AtG6PDH4基因聚在同一亞組,屬于P0類型。Wakao等[2]發現,P0亞組成員AtG6PDH4不具有酶催化活性。因此,推測小麥TaG6PDH3-4A/4B/4D不同于其他亞組成員,可能編碼一種非功能性蛋白。

Schaewen等[17]研究發現,質體型G6PDH蛋白比胞質型G6PDH在N端多含有一段轉運肽序列。本研究進化分析表明,胞質型TaG6PDH2-2A/2B和TaG6PDH5-6A/6B/6D蛋白與已鑒定的擬南芥和水稻胞質型 G6PDH蛋白序列同源性較高,且均不含轉運肽序列;質體型G6PDH蛋白又可分為P0、P1和P2亞組。前人也鑒定到不具有催化活性的P0亞組G6PDH蛋白,其主要功能是促進P1亞組G6PDH蛋白進入溶酶體[2,18]。內含子和外顯子結構分析表明,聚在一類的亞組成員具有相似的內含子和外顯子結構,表明同一亞組成員可能具有相似的功能。

CARDI等[19]研究表明,植物P1亞組G6PDH基因主要在葉片等光合作用組織中高表達,而P2亞組G6PDH基因在根、莖及大部分組織中均具有有較高的表達量。本研究通過RNA-seq分析小麥G6PDH基因在不同組織中的表達模式,發現P2亞組成員TaG6PDH1-2A/2B/2D基因主要在根中高表達;利用qRT-PCR也發現了TaG6PDH1-2A/2B基因在根中的表達顯著高于其他組織,暗示這三個部分同源基因在小麥根的發育過程中發揮著關鍵作用。P1亞組成員TaG6PDH4-6A/6B/6D基因主要在葉片等光合作用組織中高表達,這與前人在擬南芥[2]中報道的P1亞組同源基因的表達模式類似。Wakao等[2]研究表明,擬南芥胞質型G6PDH基因可調控種子發育過程中的脂肪酸合成,該基因突變影響種子的含油量。本研究中胞質型基因TaG6PDH5-6A/6B/6D在種子發育后期表達量也較高,說明TaG6PDH5-6A/6B/6D也可能參與小麥種子的發育過程。

本研究采用Liu等[20]報道的干旱和熱脅迫下小麥幼苗葉片的轉錄組數據,進一步分析了G6PDH基因家族在非生物脅迫下的表達模式,結果發現,TaG6PDH2-2A和TaG6PDH2-2B基因在干旱脅迫1 h時以及熱脅迫6 h時均上調表達;進一步利用qRT-PCR檢測6個小麥G6PDH基因在干旱和鹽脅迫下的表達模式,發現分別有5個小麥G6PDH基因在小麥根中均上調表達。綜上所述,小麥G6PDH基因家族成員在抵御非生物脅迫過程中發揮著重要作用。本研究為后續分析G6PDH基因在調控小麥生長發育和響應逆境脅迫的分子機制方面提供參考信息。