黔麥1175莖稈抗倒伏機制的轉錄組測序分析

王艷麗,隋建樞,陳天青,王 偉 ,何慶才

(1.貴州省農業職業學院,貴州清鎮 551400; 2.貴州省旱糧研究所,貴州貴陽 550006; 3.貴州省農業科學院,貴州貴陽 550006)

倒伏是限制小麥高產、穩產、優質的主要因素之一,灌漿期倒伏可使小麥減產10.00%～37.29%[1]。因此在全球主要小麥種植區,抗倒伏皆是最重要的育種目標之一[2]。小麥抗倒伏能力與株高、基部第1～2節間長度和充實度、莖壁厚度、髓腔大小等性狀密切相關,這些性狀均為多基因控制的數量遺傳性狀[3-4]。

纖維素和木質素是構成小麥次生細胞壁重要高分子物質[5-6],二者含量增加,次生細胞壁增厚,莖稈的拉伸強度及抗倒伏能力也顯著增強[7-8]。木質素的生物合成與苯丙氨酸裂解酶(PAL)、4-香豆酸輔酶A連接酶(4CL)、肉桂酰輔酶A還原酶(CCR)、肉桂醇脫氫酶(CAD)、羥基肉桂酰CoA轉移酶(HCT)等關鍵酶基因有關[9-10]。與小麥纖維素合成相關基因的研究報道較少,Ceaser等[11]研究表明,纖維素的生物合成與一些轉錄因子和纖維素合成酶有關。

本研究為分析抗倒伏小麥品種與易倒伏小麥品種間抗倒伏能力的差異機制,以抗倒伏品種黔麥1175和易倒伏品種黔麥18為材料,在田間觀察了兩個品種的抗倒伏情況,統計比較了株高、木質素和纖維素含量等性狀指標,并通過轉錄組測序分析莖稈形成不同階段和品種間的差異表達基因,以期明確抗倒伏能力與木質素和纖維素含量的關聯性,發掘抗倒伏小麥莖稈形態建成的基因,為抗倒伏小麥育種提供參考依據。

1 材料與方法

1.1 供試材料

本研究所用抗倒伏小麥材料黔麥1175是貴州省農業科學院旱糧研究所在引進鐵桿小麥中洛鐵桿麥1號的基礎上,與小麥品種黔9903進行雜交,經過多年選育而成的新型鐵桿小麥新品系,對條銹病、白粉病均表現為高抗;所用對照材料黔麥18是本課題組育成的豐產性好、品質優良的新品種。兩品種都是在生產上有大面積推廣的雜交小麥新品種,其中黔麥1175的抗倒伏能力優于黔麥18。兩品種于2020年種植于貴州省農業科學院小麥試驗地,行長4 m,行距20 cm,株距10 cm,試驗地肥力均一,隨機區組設計,常規田間管理。

1.2 試驗方法

1.2.1 生長及莖稈特性的測定

于揚花期和成熟期,每個小區取代表性植株30株,調查莖稈重心高度(莖稈基部至平衡支點的距離)、穗長、穗重、莖稈長度和干重、基部第1～2節間長度和干重,并于揚花期調查株高和莖稈抗折力(N)。莖稈抗折力的調查方法:取基部第2節間,除去葉鞘,兩端置于高50 cm、間隔5 cm的支撐木架凹槽內,在其中部掛彈簧秤,向下緩慢用力拉,使莖稈折斷所用的力加上彈簧自身的重量即為該莖稈的抗折力。

1.2.2 木質素和纖維素含量的測定

于花后30 d左右,小麥拔節完成,進入乳熟期,將小麥基部第2節間除去葉鞘,75 ℃條件下干燥24 h至恒重,將樣品研磨至勻漿,稱取0.3 g樣品,轉移至100 mL小燒杯中。采用硫酸蒽酮比色法測定纖維素含量[12],采用濃硫酸法測定木質素含量[13]。

1.2.3 RNA的提取

2021年3月至4月,于小麥基部莖節開始伸長早期(第2節間形成7～10 d)和中晚期(第2節間形成10～20 d),取莖基部第1～2節間材料,每個品種取50株。用Trizol法提取總RNA,3次生物學重復,用1%的瓊脂糖凝膠電泳檢測RNA的完整性,用Oligo(dT)磁珠富集mRNA。加入fragmentation buffer將mRNA打斷成短片段,反轉錄合成雙鏈cDNA。加入End Repair Mix(生工,上海)將cDNA補成平末端,隨后在3’末端加上一個A堿基,用于連接Y字形的接頭,隨后在Illumina平臺上進行測序。

1.2.4 RNA-Seq測序及原始數據的組裝

原始測序數據(raw data)中會出現測序接頭序列、低質量讀段、含N率較高序列及長度過短序列,為保證后續分析的準確性,首先對原始測序數據進行過濾,得到高質量的有效數據(clean data),然后將質控后的數據與中國春參考基因組進行比對。

1.2.5 差異基因的篩選與功能注釋

用DEGseq 2軟件進行組間差異表達分析,根據|log2fold change|>2且FDR<0.01篩選差異表達基因,以FPKM(fragments per kilobase of transcript per millionmapped reads)衡量基因表達水平的指標。其中,差異倍數(fold change)指兩樣品組間表達量的比值,錯誤發現率(false discovery rate,FDR)是通過Benjamini-Hochberg校正方法對原有假設檢驗得到的顯著性P值進行校正得到。利用GO和KEGG數據庫對差異表達基因進行GO功能分類和KEGG代謝通路富集分析,找出共同的的代謝通路,在此基礎上,篩選出與抗倒伏相關的差異表達基因。

1.2.6 qRT-PCR驗證差異表達基因

以莖稈伸長中晚期的黔麥1175和黔麥18為材料,選取木質素合成相關基因(PAL、4CL、CCR、CAD、HCT)和纖維素合成相關基因(纖維素合成酶基因和NAC轉錄因子基因),根據其全長cDNA序列,用Primer Premier 5.0設計引物(表1),以小麥Tubulin基因為內參。將提取的RNA用DNaseI處理后,用Superscript III逆轉錄酶和oligo(dT)18引物進行cDNA第一鏈的合成。參照SYBR○RPremix Ex TaqTMII 試劑盒(Takara,北京)說明書的反應體系和反應程序,使用Rotor-Gene 3000 Real-Time PCR System(Corbett Life Science,美國)進行qRT-PCR分析,按照2-ΔΔCT法計算基因的相對表達量,3個生物學重復。

2 結果與分析

2.1 黔麥1175和黔麥18的生長及莖稈特性

對兩個品種比較,黔麥1175株型緊湊,莖稈彈性好,田間每公頃有效分蘗達750多萬時不倒伏,而黔麥18田間每公頃有效分蘗達600多萬時易倒伏,說明黔麥1175的抗倒伏能力優于黔麥18。黔麥1175揚花期的株高、莖稈重心高度和穗長以及成熟期的莖稈重心高度、莖稈鮮重和穗長均顯著低于黔麥18,而揚花期和成熟期兩個品種的穗重均無顯著差異(表2)。

表2 黔麥1175和黔麥18的生長特性

進一步對兩個品種的莖稈特性進行比較,發現揚花期黔麥1175和黔麥18的莖稈長度和干重、基部1～2節間長度和干重均無顯著差異;而成熟期黔麥1175的莖稈長度和干重均顯著低于黔麥18,但兩品種間基部1～2節間長度和干重也無顯著差異。黔麥1175的莖稈抗折力為6.80 N,顯著高于黔麥18(4.90 N)(表3)。

表3 黔麥1175和黔麥18的莖稈特性

2.2 黔麥1175和黔麥18莖稈的木質素和纖維素含量

從表4可以看出,黔麥1175的木質素和纖維素含量分別為18.13和310.67 mg·g-1,均顯著高于黔麥18(16.27和233.00 mg·g-1)。又由于黔麥1175的莖稈抗折力顯著高于黔麥18,因此推測黔麥1175的抗倒伏能力與莖稈中木質素和纖維素含量相關。

表4 黔麥1175和黔麥18莖稈的木質素和纖維素含量

2.3 轉錄組測序分析

通過對黔麥1175和黔麥18莖稈伸長早期、莖稈伸長中晚期共 4個處理12個小麥莖稈樣本的轉錄組數據進行分析比較,發現各樣品的有效數據(clean data)均達到13.85 Gb以上,Q20堿基百分比均在97.95%及以上(表5),Q30堿基百分比在93.80%及以上,說明Illumina平臺測序質量較高,可用于后續組裝和分析。

表5 測序數據質量統計表

2.4 差異表達基因統計分析

從圖1可以看出,與黔麥1175莖稈伸長早期相比,黔麥1175莖稈伸長中晚期有4 695個差異表達基因,其中1 122個基因上調表達,3 573個基因下調表達;與黔麥18莖稈伸長早期相比,黔麥1175莖稈伸長早期有9 257個差異表達基因,其中5 287個基因上調表達,3 970個基因下調表達;與黔麥18莖稈伸長中晚期相比,黔麥1175莖稈伸長中晚期有9 535個差異表達基因,其中6 552個基因上調表達,2 983個基因下調表達;與黔麥18莖稈伸長早期相比,黔麥18莖稈伸長中晚期有10 424個差異表達基因,其中3 181個基因上調表達,7 243個基因下調表達。

圖1 各處理間的差異表達基因統計

2.5 差異表達基因的GO注釋分析

從圖2可以看出,差異表達基因的功能注釋可分為生物過程(biological process)、細胞組分(cellular component)和分子功能(molecular function)3個大類,其中黔麥1175莖稈伸長中晚期與其莖稈伸長早期的差異表達基因中,各通路占比從高到低依次為催化活性(46.9%)、結合(44.2%)、代謝過程(36.2%)、細胞部分(34.2%)、膜部分(32.8%)、細胞過程(31.9%)、膜(17.9%)等。黔麥1175莖稈伸長早期與黔麥18莖稈伸長早期的差異表達基因中,各通路占比從高到低依次為結合(53.1%)、細胞部分(43.0%)、細胞過程(38.8%)、催化活性(38.8%)、代謝過程(26.8%)、膜部分(26.8%)、細胞器(27.0%)等。黔麥1175莖稈伸長中晚期與黔麥18莖稈伸長中晚期的差異表達基因中,各通路占比從高到低依次為結合(49.9%)、催化活性(41.5%)、細胞部分(37.9%)、代謝過程(35.7%)、細胞過程(34.4%)、細胞器(20.8%)、膜(16.4%)等通路。黔麥18莖稈伸長中晚期與其莖稈伸長早期的差異表達基因中,各通路占比從高到低依次為結合(48.9%)、細胞部分(46.9%)、催化活性(41.6%)、代謝過程(40.9%)、細胞過程(40.1%)、細胞器(28.1%)、膜部分(28.1%)等。此外,部分差異表達基因還涉及刺激應答、生物調控、轉運活性、轉錄調控活性等通路。

圖2 差異表達基因的GO注釋分類

2.6 差異表達基因KEGG富集分析

從圖3可以看出,黔麥1175莖稈伸長中晚期與其莖稈伸長早期的差異表達基因顯著富集到苯丙烷生物合成谷胱甘肽代謝、淀粉和蔗糖代謝、甘油酯代謝等通路;黔麥1175莖稈伸長早期與黔麥18莖稈伸長早期的差異表達基因顯著富集到苯丙烷生物合成、核糖體、DNA復制等通路。黔麥1175莖稈伸長中晚期與黔麥18莖稈伸長中晚期的差異表達基因顯著富集到光合作用-天線蛋白、植物病菌互作、植物MAPK信號轉導等通路。黔麥1175莖稈伸長中晚期與黔麥18莖稈伸長早期的差異表達基因顯著富集到核糖體、苯丙烷生物合成、DNA復制、光合作用-天線蛋白等通路。

圖3 差異表達基因的KEGG富集分析

續圖3 差異表達基因的KEGG富集分析

2.7 木質素生物合成的相關基因分析

苯丙烷生物合成途徑與木質素合成密切相關[14],因此進一步分析富集到苯丙烷生物合成途徑上的差異表達基因,發現黔麥1175莖稈伸長中晚期與其莖稈伸長早期的差異表達基因有153個(24個上調,129個下調),黔麥1175莖稈伸長早期與黔麥1175莖稈伸長早期的差異表達基因有151個(92個上調,59個下調),黔麥1175莖稈伸長中晚期與黔麥18莖稈伸長中晚期的差異表達基因有136個(98個上調,38個下調),黔麥1175莖稈伸長中晚期與黔麥18莖稈伸長早期的差異表達基因有255個(64個上調,191個下調)。4CL、CCR、CAD、PAL、HCT屬于木質素合成過程中的關鍵酶,因此比較分析了編碼這5種關鍵酶的差異基因表達情況,具體見表6。

表6 編碼木質素生物合成關鍵酶的差異表達基因數量及表達模式

2.8 纖維素生物合成的相關基因分析

纖維素的生物合成主要與蔗糖合成酶(sucrose synthas, SUSY)、胞質轉化酶,UDP-葡萄糖焦磷酸化酶、纖維素合成酶等有關[15]。與纖維素合成相關的基因中,黔麥1175莖稈伸長中晚期與其莖稈伸長早期的差異表達基因有53個,其中12個上調表達(如NAC轉錄因子基因和MYB轉錄因子基因),41個下調表達(如蔗糖合成酶基因、MYB 轉錄因子基因和NAC轉錄因子基因),黔麥1175纖維素合成酶基因的表達量在莖稈伸長中晚期低于早期,但仍維持在較高水平,且差異不顯著。黔麥1175莖稈伸長中晚期與黔麥18莖稈伸長中晚期的差異表達基因有75個,其中55個上調表達,20個下調表達,黔麥1175纖維素合成酶基因的表達量顯著高于黔麥18。黔麥18莖稈伸長中晚期與其莖稈伸長早期的差異表達基因有110個,其中29個上調表達,81個下調表達。

黔麥18莖稈伸長早期和黔麥1175莖稈伸長早期的差異表達基因有71個,其中41個上調表達,30個下調表達,上調表達基因主要編碼纖維素合成酶、蔗糖合成酶、NAC轉錄因子6A、MYB轉錄因子SM155-1、NAC轉錄因子4等。

2.9 熒光定量PCR驗證

為驗證轉錄組測序結果的準確性,以莖稈伸長中晚期的黔麥1175和黔麥18為材料,挑選木質素合成相關基因(PAL、4CL、CCR、CAD和HCT)和纖維素合成相關基因(纖維素合成酶基因和NAC轉錄因子基因)共7個基因進行qRT-PCR,結果(圖4)顯示,這些基因的表達趨勢與轉錄組測序所得結果基本一致,證明了轉錄組數據的可靠性。

1: NAC轉錄因子基因;2:纖維素合成酶基因;3:羥基肉桂酰CoA轉移酶基因;4:肉桂酰輔酶A還原酶基因;5:4-香豆酸輔酶A連接酶基因;6:苯丙氨酸解氨酶基因;7:肉桂醇脫氫酶基因。

3 討論

植株抗倒伏性狀與株高和莖稈重心高度有關,在一定株高范圍內,株高越高,倒伏率越高;重心高度上移也使莖稈頭重腳輕,易于倒伏[16]。本研究中,揚花期黔麥1175的株高和莖稈重心高度均顯著低于黔麥18,這也是生產上黔麥1175抗倒伏能力強的原因之一。黔麥1175和黔麥18的莖稈長度和干重在揚花期無顯著差異,而在成熟期差異顯著,說明黔麥1175在揚花期就已經具備較強的抗倒伏能力,而黔麥18在揚花后的灌漿期,莖稈繼續伸長生長,因此灌漿期是黔麥18預防小麥莖稈倒伏的關鍵發育時期。

增加小麥次生壁中木質素和纖維素含量來增強莖稈的機械強度,是提高小麥抗倒伏能力的有效途徑。本研究發現黔麥1175莖稈伸長早期與黔麥18莖稈伸長早期、黔麥1175莖稈伸長中晚期與黔麥18莖稈伸長中晚期的差異表達基因中,與木質素合成相關的基因(4CL、CCR、CAD、PAL和HCT)在抗倒伏品種黔麥1175中的表達量均顯著上調,說明抗倒伏品種黔麥1175比對照品種黔麥18的木質素合成代謝旺盛,木質素含量高是其抗倒伏的重要原因之一。尤其是PAL基因上調表達30多倍,qRT-PCR也驗證了轉錄組數據的準確性。PAL是苯丙烷類代謝途徑中的限速酶,催化L-苯丙氨酸觧氨生成反式肉桂酸,為下游木質素等次級代謝產物合成提供底物,不僅與木質素含量呈顯著正相關,而且與白粉病和條銹病抗性相關[17]。與莖稈伸長早期的黔麥1175相比,莖稈伸長中晚期的黔麥1175體內4CL、CCR、CAD、PAL和HCT基因均下調表達,說明木質素合成基因在莖稈伸長早期表達量較高,隨著莖稈伸長,木質素的含量呈下降趨勢。

UDP-葡萄糖為纖維素合成的底物,而蔗糖合成酶在UDP-葡萄糖的合成中具有重要作用[18]。MYB轉錄因子可直接結合木質素合成基因順式作用元件,直接調控其基因表達[19]。纖維素合成酶復合體以UDP-葡萄糖為底物,催化β-1,4糖苷鍵的形成,進一步合成纖維素[20]。在抗倒伏品種黔麥1175莖稈形成早期,蔗糖合成酶基因、MYB轉錄因子基因和NAC轉錄因子基因的表達量均較高,隨著莖稈形成,其表達量逐漸下調,而抗倒伏品種黔麥1175莖稈形成中晚期,纖維素合成酶基因的表達量仍顯著高于黔麥18。植物激素尤其是生長素,對維管組織的分化具有重要作用。Chini等[21]研究表明,JAZ是一類在植物發育和防御反應中起廣泛作用的蛋白家族,是茉莉酸信號轉導途徑中的關鍵抑制因子,參與作物莖稈形態建成。本研究也表明,與莖稈伸長早期和中晚期的黔麥18相比,莖稈伸長早期和中晚期的黔麥1175中,一個茉莉酮酸酯ZIM結構域蛋白基因(JAZ)均持續上調表達,說明JAZ基因與莖稈形成有關。