低磷脅迫下外源褪黑素對大麥幼苗根系發(fā)育的調控作用

馬靜瑋,馬增科,姚立蓉,汪軍成, 司二靜,孟亞雄,馬小樂,李葆春,尚勛武,王化俊

(1.省部共建干旱生境作物學國家重點實驗室/甘肅省作物遺傳改良與種質創(chuàng)新重點實驗室,甘肅蘭州730070;2.甘肅農業(yè)大學農學院,甘肅蘭州730070;3.甘肅農業(yè)大學生命科學技術學院,甘肅蘭州730070)

大麥(HordeumvulgareL.)是世界上第四大谷類作物,是高質量的食品和釀造業(yè)的重要原料,具有抗旱、抗鹽等特性[1];其適應范圍廣,耐瘠薄,是研究環(huán)境脅迫對植物影響的理想材料[2]。低磷脅迫一直是影響大麥生長發(fā)育的主要因素,大麥在進化過程中也演化出了各種適應機制來應對缺磷環(huán)境[3]。根系是植物最先感知營養(yǎng)脅迫的器官[4],也是最先做出反應的部位[5]。低磷脅迫下植物根系長度、表面積等參數(shù)均顯著降低,但側根密度、數(shù)量和細根比例增加,根系的平均直徑降低[6,7]。逆境脅迫下,植物會通過促進更多有機酸的釋放來與脅迫離子螯合,緩解逆境脅迫[8],也可通過增大根長和根表面積來提高磷素的吸附能力,促進生長[9]。褪黑素(MT)是一種胺類激素,是廣泛存在于各種生物體中的優(yōu)良抗氧化劑,可提高抗氧化酶活性,直接消除植物中的自由基,促進與抗氧化酶有關基因的表達,保護植物免受過度的氧化損害,保持細胞膜結構的完整性[10]。施用外源MT可以減少核桃活性氧(ROS)的積累,防止植株受到損傷,提高葉ROS的清除能力[11];鹽脅迫下施加外源MT可以促進玉米種子萌發(fā)[12];外源MT主要通過減少ROS含量來緩解逆境脅迫[13],從而提高抗氧化酶活性,達到清除ROS目的[14,15]。抗逆育種和栽培一直是作物研究和生產實踐所面對的重要課題。低磷脅迫下施加外源MT后大麥幼苗根系如何變化,外源MT是否對大麥所受的低磷脅迫具有緩解效應仍需探究。本研究以磷敏感型大麥品種GN42為材料,通過水培試驗,分析了低磷脅迫下外源褪黑素對大麥幼苗根系表型特征、解剖構造、生理特征和相關基因表達的影響,以期為大麥抗逆育種和栽培提供參考。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

供試大麥為經過前期篩選鑒定試驗確定的磷敏感型材料GN42[16]。

1.2 試驗設計

選取均勻一致的大麥種子用雙氧水表面消毒,清水沖洗干凈后,在鋪有三層濾紙的培養(yǎng)皿中將其萌發(fā),5 d后轉移至人工氣候室中清水培養(yǎng)3 d,再開始不同處理。人工氣候室培養(yǎng)條件:相對濕度50%～70%;光強300 μmol m-2·s-1;25 ℃光照16 h和12 ℃黑暗8 h交替培養(yǎng)。試驗設0.397 mmol·L-1KH2PO4(CK,正常磷供應)、0.039 7 mmol·L-1KH2PO4(LP,低磷)和0.039 7 mmol·L-1KH2PO4+30 μmol·L-1MT(LP+MT)三個處理。MT濃度是通過查閱相關文獻[17,18]和預試驗篩選出的適宜大麥幼苗生長的濃度。因為MT是光敏型物質,因而在避光條件下,采用加熱法配置 MT溶液,并同營養(yǎng)液一起加入10 L水培箱中,營養(yǎng)液每3 d換一次,之后拍照觀察MT處理后5 d、10 d、15 d、20 d的幼苗生長情況。營養(yǎng)液配置見表1。每個處理3個重復,每個重復有兩株幼苗,幼苗用水培籃固定。

表1 營養(yǎng)液成分配置

1.3 測定項目和方法

1.3.1 根系形態(tài)指標測定

用根系掃描儀(Epson,Long Beach,CA,USA)掃描新鮮根部,用Win RHIZO軟件(Quebec,QC,CAN)計算總長度、表面積和體積。

石蠟切片制作過程參考陸錦鴻[19]的方法。

1.3.3 DAB/NBT組織染色觀察

1.3.5 H2O2含量測定

對多次點爐、拆開回火器和燒嘴，利用廢布在爐口燃燒實驗等措施進行分析，發(fā)現(xiàn)造成綠色、紫色回火器炸裂的主因是C排以上形成“鍋蓋”，爐內燃燒氣氛上行受阻，導致回火器和防爆片炸裂；而“鍋蓋”成因主要是C5水冷套管內部有3個砂眼漏水，停爐后吹掃過程中，由于被汽化的水蒸汽比空氣的比熱大，冷卻過程中帶走熱量更多，散熱速度快，C排以上一些已熔化的銅在吹風時下落，下落至C排以上立即凝固，因此堵塞氣體上行的縫隙，加之爐內上部電銅的重力作用，使得C排以上電銅形成一層密封嚴實的電銅塊，即形成“鍋蓋”；點爐過程中，將易燃的廢布、木塊丟進爐口后，未見明顯火焰、氣流上升，則說明爐內氣氛上升受阻。

稱取0.1 g根系鮮樣,在冰浴中用5 mL三氯乙酸(0.1% w/v)提取,冷凍離心15 min,取0.5 mL的上清液加入1 mL碘化鉀(1 mol·L-1)和0.5 mL磷酸緩沖液(pH=7.0),在吸光度390 nm處比色,使用H2O2試劑標準曲線計算H2O2含量。

1.3.6 花青素含量測定

稱取0.5 g新鮮植物樣品,剪碎成5 mm左右碎片,加入1%鹽酸甲醇提取液,放入搖床在避光條件下震蕩18 h左右,直至葉片呈白色,離心后取上清液,在530和657 nm處測定吸光度。

1.3.7 相關基因表達量分析

RNA提取與檢測:在處理15 d后,采集大麥幼苗根系和葉片,用錫箔紙包住后立即放入液氮中,儲存在-70 ℃的冰箱中。總RNA的提取使用總RNA分離試劑盒(TIANGEN,北京,中國)。RNA完整性的檢測用1%瓊脂糖凝膠電泳,RNA濃度和純度由核酸分析檢測。

cDNA第一鏈合成:運用FastKing gDNA Dispelling RT SuperMix(TIANGEN,北京)合成cDNA第一鏈,具體操作步驟參考說明書。

qRT-PCR分析:依據(jù)基因序列,設計花青素合成相關基因Hvant(Anthocyanin synthesis related genes)、MT合成基因Hvcomt(Melatonin synthesis gene)和根系磷轉運蛋白相關基因Hvpht1;1(Root phosphorus transport related gene)的特異性引物用于其表達特性的分析,大麥內參基因用Hv-actin基因,熒光定量PCR的完成采用Super Real PreMix Plus(SYBR Green)(TIANGEN,北京),反應體系共20 μL,包含RNase-Free ddH2O 7.4 μL、反向引物0.6 μL(10 μM)、正向引物0.6 μL(10 μM)、1 μL cDNA(80 ng·μL-1)、0.4 μL 50×Rox Reference Dye、10 μL 2×SuperReal Premix Plus,每個處理設置3個重復。擴增程序包括95 ℃預變性15 min,95 ℃變性10 s,60 ℃延伸退火32 s,40個循環(huán)。擴增后,通過擴增和熔解曲線確認特異性,并利用2-ΔΔCT法對基因表達情況進行分析。

表2 qRT-PCR引物序列

1.4 數(shù)據(jù)分析

采用SPSS 22和Excel 2016軟件分析數(shù)據(jù)及繪圖,采用Duncan(D)法進行統(tǒng)計分析。

2 結果與分析

2.1 低磷脅迫下施加外源MT后大麥幼苗根系表型的變化

與CK比較,低磷脅迫(LP處理)導致大麥幼苗根系總長度、體積和表面積分別下降了 4.80%～37.10%、6.80%～18.00%和6.00%～21.70%,除處理5 d后的根系總長度外均差異顯著。低磷脅迫下添加外源MT(LP+MT)后,大麥幼苗根系總長度、體積和表面積與CK相比總體上依然呈下降趨勢,但變化幅度減少,甚至三個性狀出現(xiàn)增加現(xiàn)象,且基本上均顯著高于LP處理(圖1)。這說明,低磷脅迫對大麥幼苗根系生長有明顯的抑制作用,而添加外源MT會促進低磷脅迫下大麥幼苗根系生長。

2.2 低磷脅迫下施加外源MT后大麥幼苗根系解剖構造的變化

解剖觀察(圖2)發(fā)現(xiàn),低磷脅迫(LP處理)下大麥幼苗的根冠長度短于CK,低磷脅迫明顯抑制了幼苗根冠厚度的增加。低磷脅迫下添加外源MT后,根冠厚度較CK明顯變大,長度增加,外源MT明顯促進了大麥幼苗根冠伸長,進一步證明MT對根系生長具有一定的促進作用。

圖2 不同處理下大麥幼苗根部石蠟切片圖

2.3 低磷脅迫下施加外源MT對大麥幼苗抗氧化特性的影響

2.3.1 花青素含量

花青素具有很強的抗氧化性,可以減少活性氧對植物組織造成的損害。與CK比較,低磷脅迫(LP處理)下,大麥幼苗植株花青素含量顯著增加,增幅為35.0%～69.9%。低磷脅迫下外源添加MT后,花青素含量較CK增加8.4%～78.6%,其中在處理15和20 d時顯著高于CK和LP處理(圖3)。

圖3 不同處理下大麥幼苗花青素含量

圖4 外源MT對低磷脅迫下大麥幼苗根系含量及組織染色的影響

2.4 低磷脅迫下施加外源MT對大麥幼苗相關基因表達的影響

與CK比較,低磷脅迫(LP處理)下大麥幼苗根系和葉片中Hvant和Hvcomt基因表達量均呈下調趨勢,其中根系中表達量分別下降了78.9%和13.5%,葉片中表達量分別降低了46.1%和80.1%;而Hvpht1;1基因呈上調表達趨勢,表達量增加了72.1%。低磷脅迫下添加外源MT后,與CK比較,三個基因在根系中均上調表達,表達量分別增加了10.9%、96.2%和81.7%;葉片中的Hvant和Hvpht1;1也上調表達,表達量分別增加了48.3%和83.7%,但Hvcomt的表達量降低了78.5%。

3 討論

3.1 外源MT對大麥幼苗根系影響

根系在改善土壤物理、化學性質和合成激素等方面有重要作用,對植物生長發(fā)育尤為重要[20]。Liu等[21]研究發(fā)現(xiàn),MT可以提高干旱脅迫下番茄根系活力,促進根系形態(tài)建成和水分的吸收[22]。本試驗結果也表明,在低磷脅迫下30 μmol·L-1MT可促進大麥GN42幼苗根系總長度、表面積和體積的增加,說明外源MT可以使作物在逆境脅迫下不斷整合環(huán)境信號,調節(jié)生長發(fā)育。

根系解剖結構的研究對了解植物逆境脅迫適應機制起著重要作用,其變化可以直觀反映植物抗逆性[23]。在正常生長的植物中,根尖細胞處于不斷脫落和補充的動態(tài)平衡,調動著根冠細胞的變化,使植物能夠進行一系列的生理和生化反應,從而成功地適應不利的環(huán)境[24]。本試驗中,低磷脅迫下大麥幼苗根系的生長發(fā)育減緩,根冠厚度增加受抑制,而添加外源MT促進了GN42中根冠厚度的增加,這與Liu等[25]的研究結果一致。

圖5 不同處理下大麥幼苗根系相關基因表達量

3.2 外源MT對大麥幼苗根系生理特征影響

3.3 外源MT對大麥幼苗根系基因表達量影響

花青素也可以提高植物的抗逆能力,是非常有效的自由基清除劑[31]。在葡萄中花青素合成相關基因SNAT2的過表達會導致MT積累增多[32]。本試驗中,低磷脅迫促進了大麥幼苗植株中花青素的積累,使其含量增加,表現(xiàn)為植物莖部呈紫紅色。同時,與CK比較,低磷脅迫下,GN42根系和葉片中Hvant和Hvcomt基因下調表達,Hvpht1;1基因上調表達,而外源MT施加后三種基因在根系中均上調,葉片中的Hvant和Hvpht1;1基因也上調表達。Hvpht1;1是一種高親和性的PI轉運蛋白,與植物根系密切相關[33],且大多數(shù)的PHT1基因在根部表達,參與磷素的吸收。在本試驗中,低磷脅迫下GN42中Hvpht1;1的相對表達量在低磷脅迫下無論添加外源MT與否都提高,說明其對逆境脅迫下的植物生長過程起正調控作用。

4 結論

低磷脅迫會促進大麥幼苗根系ROS的積累,抑制根系生長發(fā)育。低磷脅迫下施加外源MT后大麥幼苗根系總長度、根表面積和根體積均有不同程度增加,根冠伸長也得到了較大的促進,根系中ROS積累減少,抗氧化能力增強,根系中相關基因上調表達,說明外源MT可通過抑制ROS的產生和提高抗氧化能力來減緩低磷脅迫對大麥根系生長的的不利影響。