平貝母多糖的提取工藝及其體外抗氧化活性研究

劉佳維，張雪茹，羅付禹，王宣，才玉婷

牡丹江醫學院藥學院（牡丹江 157011）

平貝母為百合科貝母屬多年生草本平貝母（Fritillaria ussuriensisMaxim）的干燥莖[1]，亦稱平貝，為我國東北珍貴藥用植物之一，發展歷史和使用歷史較長，在臨床應用和藥材市場中占有重要位置。平貝母記載始見于《神農本草經》，將其列為中品，具有化痰止咳、清熱潤肺之功效。現代藥理學研究表明平貝母具有平喘、鎮咳祛痰[2]、抗炎[3]、抗氧化等多方面生物活性[4-5]。平貝母中含有皂苷類、生物堿類[6-7]、多糖類[8]、核苷類等有效化學成分。已報道關于平貝母中多糖的研究甚少。

天然的抗氧化劑具有安全、易獲取、穩定性好等特點，因此從藥食同源的植物中提取抗氧化劑成為研究熱點。試驗以平貝母為原料，采用響應面法對平貝母多糖的提取工藝進行優化，平貝母多糖體外抗氧化活性通過其對DPPH自由基的清除能力來評價，以期為平貝母資源的深層次開發與利用提供依據。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

平貝母（購自吉林省吉林市）。

1, 1-二苯基-2-三硝基苯肼（DPPH，國藥集團工業股份有限公司）；維生素C（VC，陜西京西藥業有限公司）；單糖標準品（博睿糖生物科技有限公司）；苯酚、無水乙醇、正丁醇、氯仿、濃硫酸（均為分析純）。

1.2 儀器與設備

HN-1000CT恒溫超聲波提取機（上海汗諾儀器有限公司）；723型可見分光光度計（上海光譜儀器有限公司）；RE-529旋轉蒸發器（上海予華儀器有限公司）；L-550臺式低速離心機（湘儀離心機儀器有限公司）；BS 110S電子天平（北京賽多利斯儀器系統有限公司）。

1.3 平貝母多糖的制備

平貝母粉碎后，過篩（0.180 mm，即80目）。圓底燒瓶內加入平貝母和無水乙醇（1∶5 g/mL），加熱回流2 h，過濾，重復2次。脫脂后的平貝母過濾烘干，待用。平貝母采用超聲輔助法提取，重復2次，濾液合并后濃縮至適當體積，用無水乙醇調整乙醇體積分數至80%，靜置過夜（4 ℃），離心。沉淀復溶后按1/4的比例加入Sevage試劑，磁力攪拌30 min（4 000 r/min），離心20 min，取上層清液重復操作。多糖溶液放入3 500 Da的透析袋中透析48 h，冷凍干燥得到平貝母多糖[9]。

1.4 平貝母多糖提取率的測定

多糖含量采用苯酚-硫酸法[10]測定，獲得回歸方程y=2.39x-0.011 1，R2=0.999 1。根據式（1）計算平貝母多糖提取率。

式中：C為多糖質量濃度，mg/mL；D為溶液稀釋倍數；V為多糖溶液體積，mL；m為平貝母質量，mg。

1.5 單因素試驗

精確稱取2.0 g平貝母干粉，在固定超聲功率50 W、超聲時間20 min、料液比1∶30 g/mL、提取溫度40 ℃條件下，考察料液比（1∶20，1∶25，1∶30，1∶35和1∶40 g/mL）、超聲功率（30，40，50，60和70 W）、超聲時間（10，15，20，25和30 min）和提取溫度（25，30，35，40和45 ℃）對平貝母多糖提取率的影響[11-12]。

1.6 響應面優化試驗

平貝母多糖提取工藝采用響應面法進行優化[13-14]，以料液比（A）、超聲功率（B）、超聲時間（C）、提取溫度（D）為考察參數，多糖提取率為響應值。響應面試驗的因素水平見表1。

表1 響應面試驗因素水平表

1.7 紫外吸收光譜分析

配制平貝母多糖（0.1 mg/mL）溶液，用紫外可見分光光度計在190～900 nm波長范圍內掃描。

1.8 單糖組成分析

1.8.1 單糖標準溶液的配制

配制16種10 mg/mL單糖的儲備液。

1.8.2 樣品準備

精密稱取5 mg樣品置于安瓿瓶中，加入2 mL 3 mol/L TFA，于120 ℃水解3 h。準確吸取酸水解溶液轉移至管中氮吹吹干，加入5 mL水渦旋混勻，吸取50 μL加入950 μL去離子水，按12 000 r/min離心5 min。取上清進IC分析。

1.8.3 色譜條件

色譜柱Dionex CarbopacTM PA20（3 mm×150 mm）；流動相A為H2O，流動相B為15 mmol/L NaOH，流動相C為15 mmol/L NaOH-100 mmol/L NaOAC；流速0.3 mL/min；進樣量5 μL；柱溫30 ℃；檢測器為電化學檢測器。

1.9 紅外光譜分析

根據參考文獻[15]方法，精密稱取1 mg平貝母多糖，與100 mg KBr晶體充分研磨，均勻混合后壓片，在4 000～400 cm-1范圍內掃描。

1.10 DPPH自由基的清除作用測定

根據參考文獻[16]的方法，稍作改動。配制VC和平貝母多糖溶液（0.2，0.4，0.6，0.8，1.0，2.0和4.0 mg/mL），分別取2 mL于試管中，加入2 mL 0.1 mmol/L DPPH-乙醇溶液，混勻，避光反應（30 min），測其在517 nm波長處的吸光度，3次重復試驗。以無水乙醇為空白對照，VC為陽性對照，平貝母多糖對DPPH自由基的清除率用式（2）計算。

式中：A0為無水乙醇+DPPH的吸光度；A1為多糖+DPPH的吸光度；A2為多糖+無水乙醇的吸光度。

2 結果與分析

2.1 單因素試驗

2.1.1 料液比對多糖提取率的影響

由圖1可知，料液比中液體占比由1∶20 g/mL增加至1∶30 g/mL后，多糖提取率也逐漸提高。多糖提取率在料液比1∶30 g/mL時最大，為8.31%。料液比中液體占比繼續升高增至1∶40 g/mL時，多糖提取率則降低。其主要原因是料液比中液體占比過小時多糖無法完全滲入溶劑而使得提取率偏低，料液比中液體占比過大時多糖會和其他可溶性組分相結合而造成提取率降低[17]。所以選取料液比1∶25～1∶35 g/mL用于優化試驗。

圖1 料液比對多糖提取率的影響

2.1.2 超聲功率對多糖提取率的影響

如圖2所示，超聲功率由30 W增加到50 W時，多糖提取率逐漸增大。超聲功率50 W時，平貝母多糖提取率達到最大值8.59%。超聲功率大于50 W后，多糖提取率則緩慢降低，這可能是因為空穴效應導致溶劑中的氣泡數增多，導致超聲能量向介質傳播的效率降低[18]。因此選取超聲功率40～60 W用于優化試驗。

圖2 超聲功率對多糖提取率的影響

2.1.3 超聲時間對多糖提取率的影響

由圖3可知，超聲時間10～30 min時，多糖提取率先升高后逐漸下降，超聲時間15 min時達到最大值9.67%，可能是超聲10～15 min內對平貝母破壞作用較強，因此多糖提取率較高。超聲時間繼續增加后，平貝母多糖提取率緩慢下降，可能是由于超聲時間過長，多糖結構被破壞[19-20]。因此選取超聲時間10～20 min用于優化試驗。

圖3 超聲時間對多糖提取率的影響

2.1.4 提取溫度對多糖提取率的影響

如圖4所示，提取溫度25～45 ℃區間內，多糖提取率先升高然后逐漸降低，35 ℃時，平貝母多糖提取率達到最高（10.02%）。因此選取提取溫度30～40 ℃用于優化試驗。

圖4 提取溫度對多糖提取率的影響

2.2 響應面試驗結果與分析

在Box-Behnken試驗設計的基礎上，進行四因素三水平響應面分析試驗。在Design-Expert軟件分析，試驗設計與結果見表2。得到二次多項回歸方程：多糖提取率（Y）=9.678-0.210 833A+0.085B+0.032 5C-0.091 666 7D+1.332 5AB+1.512 5AC+0.077 5AD-0.407 5BC+0.135BD+0.727 5CD-1.289A2-1.332 75B2-1.299C2-0.812 75D2。

表2 試驗設計與結果

由表3可得，該模型F=85.46，P＜0.000 1，表明模型極顯著。試驗設計中，響應面回歸模型AB、AC、BC、CD、A2、B2、C2、D2項為極顯著差異項（P＜0.001），A項為顯著差異項（P＜0.01）。影響平貝母多糖提取率的排序是料液比（A）＞提取溫度（D）＞超聲功率（B）＞超聲時間（C）。模型決定系數R2等于0.988 4，表明回歸模型顯著性很高，而Radj2等于0.976 9，可以解釋試驗響應值在97.69水平上的變異情況，并且它與預測相關系數Rpred2=0.941 6的數值也較為相近，表明該試驗模型對真實數據有較好的擬合程度，對實際工作有一定的指導意義，據此可利用該模型對多糖提取率的最優提取工藝進行分析及預測。

表3 回歸方程方差分析

應用Design-Expert軟件分析得到提取平貝母多糖的最佳提取工藝：料液比1∶29.112 mg/mL、超聲功率49.545 W、超聲時間14.408 min、提取溫度34.391 ℃，通過模型預測出的平貝母多糖提取率為9.789%。

在軟件預測結果的基礎上，考慮到實際工藝設定的可行性，將最佳工藝調整為料液比1∶29 mg/mL，超聲功率50 W、超聲時間14 min、提取溫度34 ℃，在此條件下，重復試驗3次，多糖提取率均值達到9.70%±0.10%，與模型預測結果相近，說明基于響應面模型的多糖提取率優化工藝分析方法有效且可行。

2.3 紫外光譜分析

如圖5所示，平貝母多糖在200 nm波長處有強吸收峰，在260和280 nm波長處有小的吸收峰，可能存在少量的核酸及蛋白質[21]。

圖5 平貝母多糖的紫外光譜

2.4 單糖組成分析

用16種單糖標準品作為對照，用離子色譜法測定平貝母多糖的單糖組成，單糖標準品和平貝母多糖的離子色譜圖如圖6和圖7所示。結果表明，平貝母多糖主要由Glc組成，含有少量Ara和Gal，摩爾比為99.3∶0.3∶0.4。

圖6 單糖的離子色譜圖

圖7 平貝母多糖的離子色譜圖

2.5 紅外光譜分析

如圖8所示：3 419.06 cm-1處吸收峰為O—H和N—H伸縮振動產生[22]；2 926.83 cm-1處吸收峰由C—H伸縮振動產生[23]；1 653.62 cm-1處吸收峰為多糖內—CHO及—COOH基團C＝O伸縮振動產生，提示有糖醛酸存在；1 369.17 cm-1處吸收峰由C—H變角振動產生[24]，1 155.40 cm-1和1 022.47 cm-1處有吸收峰為糖環的特征吸收峰，表明具有吡喃環特征結構[25]，852.87 cm-1和761.39 cm-1處吸收峰為α-糖苷鍵的特征吸收[26]。綜上，平貝母多糖具有多糖的一般特征峰，具由α-糖苷鍵連接的吡喃環型多糖。

圖8 平貝母多糖的紅外光譜

2.6 平貝母多糖對DPPH自由基的清除能力

DPPH清除率檢測是一種靈敏、快速、簡單的方法，被廣泛用于藥品和食品抗氧化能力評估[27]。由圖9可知，平貝母多糖質量濃度在0.2～4.0 mg/mL時，對DPPH自由基清除率隨質量濃度的增大逐漸增強，質量濃度4.0 mg/mL時，其清除率為60.40%，達到最大值。平貝母多糖對DPPH自由基具有一定清除能力，表現出較好的體外抗氧化能力，但效果弱于VC。

圖9 平貝母多糖的對DPPH自由基清除作用

3 結論

試驗采用響應面法優化平貝母多糖超聲提取工藝，通過平貝母多糖對DPPH自由基清除能力評價其體外抗氧化活性。得到最優工藝：料液比1∶29 g/mL、超聲功率50 W、超聲時間14 min、提取溫度34 ℃。影響平貝母多糖提取率的排序是料液比＞提取溫度＞超聲功率＞超聲時間。在此工藝條件下，平貝母多糖提取率為9.70%。離子色譜測定平貝母多糖主要由Glc、Ara和Gal組成，摩爾比99.3∶0.3∶0.4。平貝母多糖對DPPH自由基具有一定清除能力，質量濃度4 mg/mL時，其清除率達到最大值60.40%。試驗結果為平貝母多糖研究及其開發利用提供理論依據。