牛蒡多糖酶法提取工藝及其體外抗氧化活性

陳飛 ，丁朋，丁利，付婷偉，陳安徽，邵穎*

1. 徐州工程學院食品（生物）工程學院（徐州 221111）；2. 江蘇諾普樂生物科技有限公司（徐州 221116）；3. 徐州天益食品科技研究院有限公司（徐州 210009）

牛蒡，菊科牛蒡屬草本植物，俗稱“東洋參”“大力子”“牛鞭菜”，是具有較高營養價值的藥食用食材，享有“蔬菜之王”的美譽[1-2]。牛蒡根中富含膳食纖維、胡蘿卜素、蛋白質、鈣、鐵等營養成分，及多糖、多酚、黃酮等生物活性因子，具有抗菌、降糖降脂、抗突變、利尿、促膽汁分泌等功效，可用于治療風濕、痛風等血液性疾病及皮膚炎癥[3-5]。牛蒡根因豐富的營養價值及多效的生理活性而越來越受到關注，作為在我國具有較高產量的蔬菜，牛蒡顯現出巨大的開發利用潛力，其食用、保健、藥用等方面的系統研究也逐漸成為研究熱點[6-7]。

牛蒡多糖是牛蒡根中主要的生物活性成分，在抗氧化、防衰老、抗炎、免疫調節、抗癌、降血糖、調節腸道菌群平衡等方面均有一定功效[8-10]，其常用提取方法包括熱水浸提法、超聲輔助提取法、微波輔助提取法、酸堿浸提法和酶解法[11]。酶解法的高效、溫和、節能、不易破壞活性物質等優點使其在蛋白質、多肽、多糖等活性物質的提取中被廣泛使用[12-13]。試驗優化牛蒡根多糖的酶法提取工藝并探討牛蒡根多糖的體外抗氧化活性，為牛蒡的精深加工開拓路徑，同時為牛蒡多糖的產業化提供技術支撐。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

新鮮帶皮牛蒡干燥切片[天益食品（徐州）有限公司]；纖維素酶（10萬 U/g，食品級）；葡萄糖標準品（分析純，天津市福晨化學試劑廠）；DPPH試劑（美國Sigma公司）；菲咯嗪（Ferrozine，分析純，上海市源葉生物科技有限公司）；濃硫酸（分析純，上海華科試劑有限公司）；氯化亞鐵（分析純，廣東光華化學廠）；氯仿、正丁醇（分析純，國藥集團化學試劑有限公司）；苯酚（分析純，西隴科學股份有限公司）；30%過氧化氫（H2O2，Aladdin公司）。其余試劑均為分析純。

1.2 儀器與設備

紫外-可見光分光光度計（UV2802PC，上海精密儀器儀表有限公司）；高速離心機（TUMEN TL-15，江蘇圖門離心機廠）；電子天平（梅特勒AE200，上海分析儀器廠）；循環水式多用真空泵（SHB-ⅢS，鄭州長城科工貿有限公司）；旋轉蒸發儀（R501，上海申勝生物技術有限公司）；真空冷凍干燥機（LGJ-10，上海比朗儀器有限公司）。

1.3 試驗方法

1.3.1 牛蒡多糖提取率的測定

1.3.1.1 葡萄糖標準曲線的繪制

準確稱取100 mg高溫烘干至無水恒重的葡萄糖于100 mL容量瓶中，配成1 mg/mL的標準溶液，繼而用蒸餾水分別配成0，0.02，0.04，0.06，0.08，0.10，0.12和0.14 mg/mL的葡萄糖溶液。分別取1 mL不同質量濃度的葡萄糖標準溶液于刻度試管中，分別加入1 mL 6%苯酚溶液，并迅速加入5 mL濃硫酸，靜置10 min，搖勻后室溫下靜置20 min，用蒸餾水替代葡萄糖標準溶液做空白對照。測定各溶液在波長490 nm條件下的吸光度，以葡萄糖標準溶液質量濃度為橫坐標，吸光度為縱坐標，制作標準曲線。標準曲線如圖1所示，曲線回歸方程為y=6.926 4x+0.156，相關系數R2=0.998 4，樣品質量濃度在0.02～0.14 mg/mL范圍內呈線性相關。

圖1 葡萄糖標準曲線

1.3.1.2 牛蒡多糖提取率的測定

將牛蒡干切片研磨過0.850 mm孔徑（20目）篩。牛蒡粉采用酶解、離心、醇沉、離心、復溶、去蛋白、醇沉、離心、冷凍干燥的流程獲取牛蒡粗多糖。準確稱取50 mg牛蒡粗多糖，準確定容至500 mL容量瓶。取1 mL粗多糖溶液于試管中，加入1 mL的6%苯酚，迅速加入5 mL濃硫酸，靜置10 min后搖勻。將試管于40 ℃恒溫水浴鍋中水浴保溫15 min，然后測定溶液于490 nm波長處的吸光度。每個樣品設置3個重復，將測定出的溶液吸光度代入葡萄糖標準曲線計算多糖的質量濃度，并按照式（1）計算多糖的提取率。

式中：W為牛蒡粉質量，g；C為牛蒡多糖質量濃度，mg/mL；V為牛蒡多糖溶液體積，mL；F為測定用牛蒡多糖溶液的稀釋倍數；0.9為葡萄糖換算成多糖的校正系數。

1.3.2 牛蒡多糖提取工藝優化

1.3.2.1 酶解時間對牛蒡多糖提取率的影響

準確稱取5份牛蒡粉，按照1∶20（g/mL）的比例加入蒸餾水，根據牛蒡粉質量加入0.4%的10萬 U/g纖維素酶，并于40 ℃恒溫水浴鍋中酶解40，60，80，100和120 min。獲得的酶解液于沸水浴中滅酶處理并冷卻后在4 000 r/min的條件下離心10 min，收集上清液。將加入95%乙醇且終濃度達到80%的上清液在4 ℃條件下靜置10 h。在4 000 r/min條件下離心10 min后收集沉淀，沉淀冷凍干燥后復溶，加入除蛋白試劑（V正丁醇∶V氯仿=1∶4），使其最終濃度達到25%，充分振蕩1 h左右，在4 000 r/min條件下離心10 min，收集水層。再次加入95%乙醇使其終濃度達到80%，并在4 ℃條件下靜置10 h，在4 000 r/min條件下離心10 min，收集沉淀，沉淀冷凍干燥后測定多糖提取率。每個樣品設置3個重復。

1.3.2.2 料液比對牛蒡多糖提取率的影響

準確稱取5份牛蒡粉，分別按照料液比為1∶10，1∶15，1∶20，1∶25和1∶30（g/mL）的比例加入蒸餾水，根據牛蒡粉質量加入0.4%的10萬 U/g的纖維素酶并于40 ℃恒溫水浴鍋中酶解80 min。獲得的酶解液于沸水浴中滅酶處理并冷卻后在4 000 r/min的條件下離心10 min，收集上清液。后續提取及測定流程同1.3.2.1的方法。

1.3.2.3 加酶量對牛蒡多糖提取率的影響

準確稱取5份牛蒡粉，按照1∶20（g/mL）料液比加入蒸餾水，根據牛蒡粉質量分別加入0.2%，0.4%，0.6%，0.8%和1.0%的10萬 U/g的纖維素酶并于40 ℃恒溫水浴鍋中酶解80 min。獲得的酶解液于沸水浴中滅酶處理并冷卻后在4 000 r/min的條件下離心10 min，收集上清液。后續提取及測定流程同1.3.2.1的方法。

1.3.2.4 酶解溫度對牛蒡多糖提取率的影響

準確稱取5份牛蒡粉，按照1∶20（g/mL）料液比加入蒸餾水，根據牛蒡粉質量加入0.4%的10萬 U/g的纖維素酶并分別于30，40，50，60和70 ℃恒溫水浴鍋中酶解80 min。獲得的酶解液于沸水浴中滅酶處理并冷卻后在4 000 r/min的條件下離心10 min，收集上清液。后續提取及測定流程同1.3.2.1的方法。

1.3.2.5 牛蒡多糖提取工藝優化

采用正交試驗法優化牛蒡多糖提取工藝。在單因素試驗基礎上，以酶解時間（min）、料液比（g/mL）、加酶量（%）和酶解溫度（℃）為因素，采用正交設計軟件設計四因素三水平的正交試驗方案L9(34)以確定多糖的最佳提取條件。試驗因素與水平表如表1所示。每個樣品設置3個重復。

表1 正交試驗因素水平表

1.3.3 牛蒡多糖體外抗氧化活性測定

1.3.3.1 還原力的測定

將凍干的牛蒡粗多糖配制成梯度濃度的多糖溶液（0.2～1.4 mg/mL），取2 mL各濃度的多糖溶液，加入2 mL 0.2 mol/L pH 6.6的磷酸緩沖液，加入2 mL 1%（W/W）鐵氰化鉀溶液，振蕩搖勻，置于50 ℃水浴鍋中保溫20 min后加入2 mL 10%（W/W）三氯乙酸溶液，混勻后以3 000 r/min離心10 min。離心后吸取2 mL的上清液，加2 mL去離子水和0.4 mL 0.1%（W/W）FeCl3溶液，振蕩搖勻后在50 ℃水浴條件下保溫10 min，體系溶液的顏色由黃色變成藍色時，測定溶液于波長700 nm處的吸光度A700nm。空白對照用蒸餾水代替樣品，以稀釋至不同質量濃度（0.02～0.1 g/L）的VC作為陽性對照。

1.3.3.2 DPPH自由基清除能力測定

將牛蒡粗多糖配制成梯度濃度（0.2～1.4 mg/mL）的溶液。準確量取1.5 mL各濃度多糖溶液，加入1.5 mL含0.2 mmol/L DPPH的95%乙醇，充分混勻后在室溫下避光靜置30 min，于波長517 nm處測定溶液吸光度。以稀釋至不同質量濃度（0.01～0.5 g/L）的VC作陽性對照。DPPH自由基清除率按照式（2）計算。

式中：Ac為對照組吸光度，即1.5 mL蒸餾水+1.5 mL含 DPPH的95%乙醇；Ai為樣品組吸光度，即1.5 mL多糖溶液+1.5 mL含DPPH的95%乙醇；Aj為空白組吸光度，即1.5 mL多糖溶液+1.5 mL 95%乙醇。

1.3.3.3 超氧陰離子清除能力測定

量取6 mL pH 8的Tris-HCl緩沖液，在25 ℃水浴條件下預熱20 min，加入1 mL配制好的不同梯度濃度的多糖溶液和1 mL 6 mmoL/L的鄰苯三酚溶液并充分混勻，混合液在40 ℃水浴條件下保溫10 min，加入1 mL濃鹽酸終止反應。測定溶液于波長325 nm處吸光度。以蒸餾水代替多糖溶液作為空白組。O2-清除率按式（3）計算。

式中：Aj為空白組吸光度，即未加多糖樣品的溶液吸光度；Ai為樣品組吸光度，即加入多糖樣品的溶液吸光度。

1.3.3.4 羥自由基清除能力測定

采用鄰二氮菲比色法測定。損傷組：量取0.5 mL 0.75 mmol/L鄰二氮菲無水乙醇溶液，加入1 mL 0.2 mol/L pH 7.40的磷酸鹽緩沖液，加入0.5 mL去離子水，振蕩混勻后加入0.5 mL 0.75 mmol/L的FeSO4，混勻后加入0.5 mL 0.01%（V/V）的H2O2，在37 ℃條件下水浴保溫60 min，測定波長536 nm處的吸光度，記為A損。未損傷組：以0.5 mL的去離子水代替損傷管中的H2O2重復上述操作步驟，測定的吸光度記為A未損。樣品組：量取0.5 mL 0.75 mmol/L鄰二氮菲無水乙醇溶液，加入1 mL 0.2 mol/L pH 7.40的磷酸鹽緩沖液，加入0.5 mL去離子水，振蕩混勻后加入0.5 mL 0.75 mmol/L的FeSO4，充分混勻后加入0.5 mL 0.01%（V/V）的H2O2，在37 ℃條件下水浴保溫60 min，測定波長536 nm處的吸光度，記為A樣。

樣品參比溶液：取1 mL 0.2 mol/L pH 7.40的磷酸鹽緩沖液，加入0.5 mL多糖溶液，混合后加入1.5 mL去離子水，測定波長536 nm處的吸光度，記為A參。空白參比溶液：取1 mL 0.2 mol/L pH 7.40的磷酸鹽緩沖液，加入2 mL去離子水，作為空白管，用于調零，其在536 nm波長處的吸光度記為A空。羥基自由基清除率按式（4）計算。

式中：A樣為樣品組吸光度；A參為樣品參比溶液吸光度；A損為損傷組吸光度；A未損為未損傷組吸光度；A空為空白對照組吸光度。

1.4 數據處理

使用SPSS 24.0軟件對數據進行處理。試驗數據均以平均值±標準差的形式表示。

2 結果與分析

2.1 牛蒡多糖提取工藝優化

2.1.1 酶解時間對多糖提取的影響

采用1.2.3.1的方法探討酶解時間對牛蒡多糖提取的影響，試驗結果如圖2所示。

圖2 酶解時間對牛蒡多糖提取的影響

酶解時間會對牛蒡多糖的提取產生顯著的影響。酶解時間在40～120 min范圍內，多糖提取率呈現先升高后降低趨勢，酶解時間80 min時，牛蒡多糖提取率達到最大19.78%±0.63%，顯著高于其他條件下的提取率（P＜0.5）。這可能是因為80 min時酶解反應和浸提效果達到最佳狀態，而超過80 min酶解體系中纖維素酶的活性受到影響而導致多糖提取率下降。

2.1.2 料液比對多糖提取的影響

提取料液比對牛蒡多糖提取率的影響如圖3所示。提取料液比對多糖提取率的影響較明顯。隨著提取溶劑的增加，多糖提取率先上升后降低，料液比1∶20（g/mL）時提取率最高，達到20.49%±0.46%，顯著高于其他料液比條件的多糖提取率（P＜0.05）。因此多糖提取的最優料液比為1∶20（g/mL）。

圖3 料液比對牛蒡多糖提取的影響

2.1.3 加酶量對多糖提取的影響

加酶量對牛蒡多糖提取率的影響結果如圖4所示。纖維素酶添加劑量在0.2%～1.0%范圍內，牛蒡多糖的提取率呈先升高后降低的變化趨勢。酶添加劑量0.4%時，多糖提取率最高，為20.12%±0.35%，繼續增加纖維素酶的使用劑量反而會降低多糖的提取率。因此適宜的牛蒡多糖提取的酶的最佳添加劑量為0.4%。

圖4 加酶量對牛蒡多糖提取的影響

2.1.4 酶解溫度對多糖提取的影響

酶解溫度對牛蒡多糖提取的影響結果如圖5所示。在30～70 ℃的溫度范圍內，起初隨著酶解溫度的升高，牛蒡多糖提取率顯著提高，在40 ℃時提取率為21.67%±0.81%，達到最高，隨著酶解溫度繼續升高，多糖提取率顯著下降。出現這種現象的原因應該與溫度對酶影響特點有關，40 ℃應該是酶的最適酶解溫度，溫度超過60 ℃后，酶會隨著溫度的升高而逐漸失活，酶解能力也會隨之顯著下降。

圖5 酶解溫度對牛蒡多糖提取的影響

2.1.5 牛蒡多糖提取正交試驗

在料液比、加酶量、酶解溫度、酶解時間的單因素試驗基礎上，設計以牛蒡多糖提取率為指標的正交試驗。試驗結果及正交分析表如表2和表3所示。

表2 正交試驗表

表3 方差分析表

由表2的結果可知，影響牛蒡多糖提取率的因素次序為A＞D＞B＞C，即料液比＞酶解時間＞加酶量＞酶解溫度，最佳的提取組合為A3B2C2D3，即料液比1∶20（g/mL）、酶解時間80 min、加酶量0.4%、酶解溫度40 ℃。方差分析表顯示影響因素料液比、酶解時間和加酶量對牛蒡多糖提取率的影響均達到極顯著水平（P＜0.01）。在最優組合下進行驗證試驗，牛蒡多糖提取率達到39.55%±1.32%，顯著高于正交試驗結果最大值36.17%±0.91%（P＜0.05）。因此，牛蒡多糖的最佳提取工藝為料液比1∶20（g/mL）、酶解時間80 min、加酶量0.4%、酶解溫度40 ℃。

2.2 牛蒡多糖體外抗氧化活性

2.2.1 牛蒡多糖還原力的測定

牛蒡多糖還原能力的結果如圖6所示。牛蒡多糖在0.2～1.4 mg/mL質量濃度范圍內，多糖還原力隨著多糖濃度的提高而逐漸增加，多糖質量濃度1.4 mg/mL時，吸光度為0.84，且還原力與多糖濃度間呈現一定正相關性。說明牛蒡多糖具有還原能力。

圖6 牛蒡多糖的還原力

2.2.2 牛蒡多糖DPPH自由基清除活性

以VC為陽性對照測定牛蒡多糖對DPPH自由基清除活性的影響，結果如圖7所示。

圖7 牛蒡多糖對DPPH自由基清除率的影響

牛蒡多糖對DPPH自由基具有明顯的清除作用。多糖質量濃度在0～1.4 mg/mL范圍內，DPPH自由清除率隨著牛蒡多糖質量濃度的提高而上升。多糖質量濃度1.4 mg/mL時，自由基清除率達到66.86%，且清除率曲線的走勢總體呈現上升趨勢。

2.2.3 牛蒡多糖對超氧陰離子的清除活性

牛蒡多糖對超氧陰離子清除率的影響結果如圖8所示。所示。牛蒡多糖質量濃度在0.2～1.4 mg/mL 范圍內，隨著牛蒡多糖濃度的提高，其對超氧陰離子的清除率隨之增強，說明牛蒡多糖具有一定的超氧陰離子清除能力。從曲線趨勢還可看出，牛蒡多糖的超氧陰離子清除率與多糖濃度間還呈現一定劑量效應關系，經分析計算牛蒡多糖對超氧陰離子的IC50為1.09 mg/mL。

圖8 牛蒡多糖對超氧陰離子清除率的影響

2.2.4 牛蒡多糖對羥自由基的清除能力

牛蒡多糖對羥自由基清除率的影響結果如圖9所示。牛蒡多糖質量濃度在0.2～1.4 mg/mL范圍內，牛蒡多糖對羥自由基清除率隨著多糖濃度的提高而增加，且二者之間還呈現一定量效關系。說明牛蒡多糖具有羥自由基清除活性，牛蒡多糖對羥自由基的IC50為0.79 mg/mL。

圖9 牛蒡多糖對羥自由基清除率的影響

3 結論

以牛蒡多糖提取率為指標，采用正交試驗法優化牛蒡多糖的纖維素酶酶法提取工藝，確定牛蒡多糖的酶法提取最佳工藝：料液比1∶20（g/mL）、酶解時間80 min、纖維素酶添加量0.4%、酶解溫度40 ℃。在此工藝下，牛蒡多糖提取率達39.55%±1.32%。對提取到的牛蒡多糖進行抗氧化活性分析，結果發現牛蒡多糖具有顯著的抗氧化活性。牛蒡多糖質量濃度1.4 mg/mL時，還原力測定中A700nm達到0.84，多糖對DPPH自由基、超氧陰離子及羥基自由基的清除率分別達到66.86%±1.26%，64.23%±2.05%和71.94%±2.18%，經統計分析其對超氧陰離子及羥基自由基半抑制濃度IC50分別為1.09和0.79 mg/mL。說明牛蒡多糖具有較好的體外抗氧化活性，值得對其進行挖掘應用。