粒徑對蛹蟲草活性物質溶出量的影響

李曉倩，郇靖宇，智婷，楊航，李鎵汕，郭紹芬

臨沂大學醫學院（臨沂 276005）

蛹蟲草又稱北冬蟲夏草，是一種昆蟲病原真菌，隸屬于天冬科和子囊菌，是一種有價值的藥用和食用絲狀真菌，在東亞被廣泛用作營養食品和中藥材[1-5]。野生蛹蟲草就是子囊菌寄生在鱗翅目等昆蟲蛹體中[6]，蛹體充滿菌絲變成僵蛹后，自蛹體的頭、胸、腹等長出帶子囊殼的子座，其顏色呈橙黃色或近橙紅色，價格昂貴且稀有。為了馴化蛹蟲草，有研究利用子囊菌接種于桑蠶、家蠶等成功獲得蛹蟲草子實體（即人工培養）[7]。有研究表明，利用大米、麥粒等培養基來模擬蠶蛹的營養環境，成功獲得蛹蟲草子實體（即固體培養基培養）[8]，這種子實體又名為蟲草花。固體培養殘基可通過酵母菌生成可食用乙醇[9]。近年來，蛹蟲草的液體發酵培養成為蛹蟲草培養的一種新模式，蛹蟲草液體培養就是將子囊菌生長發育過程中需要的營養物質混合于水溶液中，通過人為控制外界條件，從而培養出大量菌絲體[10]。

蛹蟲草既可作為一種藥材治療疾病，同時又是具有滋補作用的營養物質，是一種藥食兩用的真菌。蛹蟲草中含有腺苷、蛋白質、噴司他丁、N6-2-羥乙基腺苷等重要有效成分，具有擁有較強的抗腫瘤、抗病毒、抑菌的活性，具有廣闊的前景[11]。經過研究表明，蛹蟲草中富含蟲草酸、核苷類成分和甾醇類等多種藥效成分，并具有降血糖、免疫調節、抗炎抑菌、抗腫瘤等多種藥理作用，其藥用價值和食用價值都很高。對蛹蟲草的研究大多是關于其蟲草素和多糖等有效成分的提取純化及有效成分藥理作用，或探究蛹蟲草植物體本身的生長和培育條件等，而有關不同粒徑對蛹蟲草活性物質的提取和溶出量影響研究尚不多見。試驗采用高效液相色譜儀和紫外分光光度計測定蛹蟲草的活性物質含量，并分析出最佳的粒徑。研究粒徑對有效成分的溶出的影響，可為蛹蟲草的實際應用提供基礎。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

蛹蟲草為善一坊地道藥材、噴司他丁標準品、麥角甾醇標準品、牛血清蛋白、考馬斯亮藍G-250、N6-2-羥乙基腺苷標準品、腺苷標準品（成都埃法生物科技有限公司）；蘆丁標準品（成都普思生物科技股份有限公司）。

1.2 儀器與設備

臺式高速離心機（TDL-80-2B，上海安亭科學儀器廠）；紫外可見分光光度計（T6新世紀，北京普析通用儀器有限責任公司）；高效液相色譜儀（Agilent1200，美國安捷倫有限公司）。

1.3 方法

1.3.1 樣品前處理

取購得的蛹蟲草子實體干樣于50 ℃烘箱烘干1 h，放入粉碎機中粉碎30 s，粉碎的蛹蟲草粉末過藥典篩，取過1號篩而未能過2號篩的為1號樣品（粒徑為1.7 mm），依次類推。樣品編號和粒度關系如表1所示。

表1 樣品編號和粒度關系

1.3.2 噴司他丁含量測定

噴司他丁的測定采用張春楊等[12]的方法，并稍做修改。準確稱取0.05 g樣品于15 mL離心管中，添加10 mL溶劑（V水∶V甲醇∶V乙腈=90∶5∶5），混勻，室溫下，于142 W超聲波清洗器中超聲提取10 min，稱其質量，補足質量，按3 000 r/min離心10 min，取上清液過0.45 μm濾膜，備用。

通過高效液相色譜法測定噴司他丁含量。高效液相色譜儀安裝Venusil MP C18柱（4.6 mm×250 mm，5 μm，柱溫25 ℃），流動相為2.5 g/L乙酸銨、甲醇、乙腈，等度洗脫，V水∶V甲醇∶V乙腈=90∶5∶5。進樣量10 μL，體積流量1 mL/min，檢測波長282 nm。以市售噴司他丁為標準，制作標準曲線。

1.3.3 麥角甾醇含量測定

采用常襯心[13]方法提取游離的麥角甾醇，并稍作修改。準確稱取0.1 g烘干的蛹蟲草粉末于離心管內，加入4 mL甲醇在黑暗中浸泡3.5 h，室溫下超聲提取30 min后，將其放到離心機內按3 000 r/min離心10 min，取上清液，過0.45 μm濾膜，備用。

高效液相色譜儀安裝Ultimate C18柱（4.6 mm×250 mm，5 μm，柱溫30 ℃），流動相為100%甲醇，等度洗脫，進樣量5 μL，流速1 mL/min，檢測波長284 nm。以市售麥角甾醇為標準，制作標準曲線。

1.3.4 類胡蘿卜素含量測定

采用Yang等[14]方法測定類胡蘿卜素含量，并稍做修改。準確稱取0.5 g樣品，加入6 mL鹽酸（1 mol/L）浸泡20 min，溫度30 ℃，按3 000 r/min離心10 min，除去上清液，用蒸餾水洗滌殘渣3次，烘干。于殘渣中添加15 mL有機試劑（V丙酮∶V石油醚=4∶1），于30 ℃水浴提取2 h，按3 000 r/min離心10 min，取上清液，稀釋20倍，通過比色法在445 nm波長處測定吸光度。類胡蘿卜素溶出量（μg/g）按式（1）計算。

式中：A為吸光度；D為稀釋倍數；V為提取溶液體積，mL；W為子實體粉末質量，g；0.16為類胡蘿卜素的消光系數。

1.3.5 蟲草酸含量測定

采用李雪芹等[15]方法測定蟲草酸含量，并稍作修改。準確稱取1 g樣品于錐形瓶中，加入10 mL 20%乙醇溶液，室溫下，于142 W超聲波清洗器中超聲提取20 min，靜置，補足質量。按3 000 r/min離心15 min，提取2次，合并上清液并定容至25 mL，備用。

取40 μL上述上清液，并加入20%乙醇稀釋至1 mL于具塞試管中，加入1 mL 0.015 mol/L高碘酸鈉溶液，混勻，室溫下放置10 min，加入0.1%L-鼠李糖溶液，從而除去過多的高碘酸鈉溶液，加入4 mL Nash試劑（乙酰丙酮試劑），混勻后在53 ℃恒溫水浴鍋中加熱15 min，使其顯色，冷卻至室溫，以蒸餾水為空白，通過比色法在412 nm波長處測定蟲草酸含量。以市售蟲草酸為標準品，制作標準曲線。

1.3.6 蛋白質含量測定

采用超聲輔助堿提法提取蛋白質。準取稱取0.1 g樣品于離心管中，添加6 mL pH 10 NaOH水溶液，在30 ℃下，于142 W超聲波清洗器中超聲提取30 min，靜置，冷卻，補足質量，按3 000 r/min離心5 min，取上清液，備用。取100 μL上述上清液，并加入pH 10 NaOH水溶液稀釋至1 mL于15 mL離心管中，添加5 mL考馬斯亮藍G-250顯色，通過比色法在595 nm波長處測定蛋白質含量。以牛血清蛋白為標準品，制作標準曲線。

1.3.7 黃酮含量測定

準確稱取1 g烘干的蛹蟲草粉末于具塞錐形瓶內，加入30 mL 85%甲醇溶液，在80 ℃超聲提取10 min后，將溶液混勻后轉移至離心管中，放到離心機內，按3 000 r/min離心10 min，取上清液，備用。

吸取2 mL樣品溶液，置于25 mL容量瓶中，量取1 mL 5%亞硝酸鈉溶液加入容量瓶，混勻，靜置6 min，量取1 mL 10%硝酸鋁溶液加入容量瓶，混勻，靜置6 min，量取10 mL 4%氫氧化鈉溶液加入容量瓶，加入60%甲醇溶液定容至刻度線，混勻，靜置15 min，在510 nm波長處測吸光度。

2 結果與分析

2.1 活性物質標準曲線

從表2可以看出，各標準品在濃度范圍內線性關系良好，可依據此線性方程計算不同粒徑下各成分的溶出量。

表2 各標準品線性關系

2.2 粒徑對噴司他丁溶出量的影響

噴司他丁是一種嘌呤核苷類似物，可用于治療毛細胞白血病[16]。根據已有文獻可知，噴司他丁可被蛹蟲草合成，這一結論從遺傳基因的角度得到證明[17]。噴司他丁被合成的濃度大小與蛹蟲草的質量好壞有關，并且與蛹蟲草是否有毒也有關系。9種粒徑蛹蟲草粉末中噴司他丁溶出量如圖1所示。1和2號粒徑下蛹蟲草粉末中噴司他丁溶出量沒有顯著性差異。從3號樣品粉末之后，噴司他丁溶出量逐漸減小，在6號樣品粉末處噴司他丁溶出量降至最低，在6號蛹蟲草粉末后，隨著藥材粉末粒度不斷縮小，蛹蟲草粉末中噴司他丁溶出量不斷升高，在9號粉末下，噴司他丁溶出量達到最高，為491.534 μg。可能是因為隨著粒徑變小，粉末與溶劑接觸面積增大，而且超聲波破壞藥材粉末的細胞膜，使膜內物質較易溶出，促進噴司他丁的溶解。溶出量變化較大，猜測與噴司他丁熱穩定性差[12]有關。因此，噴司他丁最佳溶出粒徑為0.074 mm（9號），應采用0.106 mm（8號）～0.074 mm（9號），提高噴司他丁溶出量。

圖1 不同粒徑下噴司他丁溶出量

2.3 粒徑對麥角甾醇溶出量的影響

麥角甾醇與蟲草素聯合給藥具有抗肺癌及肝癌的作用[18]。9種粒徑蛹蟲草粉末中麥角甾醇溶出量如圖2所示。隨著篩分的粒徑越來越小，麥角甾醇溶出量越來越多，在3號樣品粉末處麥角甾醇達到最高，為1 785.551 μg/g。在3號篩樣品粉末之后，隨著樣品粉末粒徑逐漸減小，提取的麥角甾醇含量逐漸減少。可能是因為隨著粉末粒徑的減小，比表面積增大，溶劑和溶出成分的接觸面積變大，增加麥角甾醇的溶出。但隨著粉末粒徑的減小，粉末對溶劑吸附力增強，而且超聲時細胞被破壞，細胞介質溶出，增加溶劑的黏性，導致麥角甾醇溶出減少，因此麥角甾醇的最佳溶出粒徑為0.27 mm（3號），應采取1.7 mm（1號）～0.27 mm（3號），提高麥角甾醇溶出量。

圖2 不同粒徑下麥角甾醇溶出量

2.4 粒徑對類胡蘿卜素溶出量的影響

9種粒徑蛹蟲草粉末中類胡蘿卜素溶出量如圖3所示。類胡蘿卜素在1號～7號樣品溶出量不斷增加，在7號樣品粉末類胡蘿卜素溶出量最高達2 982.283 μg/g，在7號～9號樣品溶出量不斷減少?？赡苁且驗殡S著粒徑不斷減小，粉末與溶劑的接觸面積增大，促進類胡蘿卜素的溶出，但隨著粉末粒徑的減小，比表面積增加迅速，對溶劑吸附力增強，導致類胡蘿卜素溶出量減少。因此，類胡蘿卜素最佳粒徑為0.12 mm（7號），應采取0.15 mm（6號）～10.27 mm（8號），提高類胡蘿卜素溶出量。

2.5 粒徑對蟲草酸溶出量的影響

9種粒徑蛹蟲草粉末中蟲草酸溶出量如圖4所示。蟲草酸在1號～7號樣品溶出量不斷增加，在7號樣品粉末蟲草酸達到最高，達62.255 mg/g。在7號～9號樣品蟲草酸溶出量隨粒徑的減少而不斷減少?？赡苁且驗殡S著粒徑的減小，粉末比表面積增大，可以有助于粉末中的有效成分的溶出和釋放。隨著粉末粒徑的減小，比表面積增加迅速，對溶劑吸附力增強，另外超聲時細胞打破，細胞介質溶出，增加溶劑的黏性，均導致蟲草酸的溶出量減少。因此，蟲草酸最佳粒徑為0.12 mm（7號），應采取0.15 mm（6號）～0.106 mm（8號），提高蟲草酸溶出量。

圖4 不同粒徑下蟲草酸溶出量

2.6 粒徑對蛋白質溶出量的影響

蛹蟲草的蛋白質具有各種各樣的作用，如免疫調節蛋白可以增強多種免疫功能的作用[19]。9種粒徑蛹蟲草粉末中蛋白質的溶出量如圖5所示。隨粒徑逐漸減小，蛋白質溶出量逐漸增多，在4號粉末處蛋白質的溶出量達到最大，為12 678.201 μg/g。在4號粉末之后，蛋白質溶出量隨著粒徑的不斷變小而逐漸降低?？赡苁且驗殡S著粉末粒徑的減小，比表面積增大，溶劑和溶出成分的接觸面積變大，增加活性物質的溶出，此外，超聲波提取可對蛹蟲草粉末進行加熱，有助于粉末中有效成分的溶出和釋放。達到最大溶出量后，粉末粒徑過小，對蛋白質溶出量影響不明顯。因此，蛋白質的最佳溶出粒徑為0.23 mm（4號），應采取0.27 mm（3號）～0.18 mm（5號），提高蛋白質的溶出量。

圖5 不同粒徑下蛋白質溶出量

2.7 粒徑對黃酮溶出量的影響

9種粒徑蛹蟲草粉末中黃酮的溶出量如圖6所示。黃酮在1號～6號樣品粉末溶出量不斷增加，在6號樣品粉末黃酮溶出量最高達到19.845 mg/g，在6號～9號樣品粉末黃酮溶出量隨著粉末粒徑的減小而不斷減少，可能是因為粉末粒徑減少比表面積增大，溶劑和溶出成分的接觸面積變大，增加活性物質的溶出，而且超聲波提取可以對蛹蟲草粉末進行加熱，促進粉末中的有效成分的溶出和釋放。達到最大溶出量后，隨著粉末變小，表面能增大，易聚集，另外超聲時蛹蟲草細胞打破，細胞介質溶出，增加溶劑的黏性，均導致黃酮的溶出量減少。因此，黃酮最佳溶出粒徑為0.15 mm（6號），與黃亞軍等[20]研究結果一致，應采用0.18 mm（5號）～0.12 mm（7號）。

圖6 不同粒徑下黃酮的溶出量

3 結論

粒徑對活性物質的溶出具有較大影響。張德斌等[21]研究粒徑對多糖、腺苷、蟲草素、N6-2-羥乙基腺苷的溶出量的影響。試驗增加噴司他丁、麥角甾醇等活性物質，測定蛹蟲草活性物質提取的最佳粒徑及粒徑對活性物質溶出量的相關關系。結果表明：粒徑0.074 mm時的噴司他丁溶出量（491.534 μg）顯著高于其他粒徑；0.27 mm藥材粉末的麥角甾醇溶出量高于其他粒徑，達1 785.551 μg/g，之后隨著粒徑減小，溶出量減少，類胡蘿卜素溶出量在粒徑0.12 mm達到最高2 982.283 μg/g，蟲草酸溶出量在粒徑0.12 mm達到最高62.255 mg/g，蛋白質溶出量在粒徑0.23 mm高于其他粒徑，達12 678.201 μg/g，此后溶出量穩定，粒徑0.15 mm粉末的黃酮溶出量（19.845 mg/g）高于其他粒徑。不同粒徑下活性物質的溶出量各有差別，不同活性物質最大溶出量的粒徑大小不同，但粒徑減小能增加活性物質的溶出，粒徑過小會導致粉末吸附溶劑，對于活性物質的溶出量并不是粉末粒徑越小越高，因此可以選擇最佳粒徑得到某活性物質最大溶出量，為蛹蟲草實際加工應用提供一定參考。