實時熒光PCR檢測駝乳營養粉中蛋白的源性成分

劉德，章潔，占忠旭，張玥琦，朱應飛

江西省檢驗檢測認證總院食品檢驗檢測研究院（南昌 330000）

駱駝乳具有較高的營養價值和藥用價值，它富含蛋白質、礦物質和維生素，同時還具有抗微生物、抗氧化劑、抗病毒和抗癌等治療特性，此外駱乳還可以添加到其他產品中制成增值產品[1-2]。駝乳營養粉是其制成增值產品的一種，它是以糖、乳及乳制品，適量添加駝乳和其他輔料制成的固體飲料[3]。隨著人們生活節奏的加快和對醫療保健方面的重視，營養粉的消費需求日益增長[4]，駝乳營養粉因其方便沖泡、口感清爽香甜且營養豐富，已經成為人們經常消費的食品之一[1]。但是由于駱駝乳產量不僅受駱駝飼料轉化方面的影響，還跟駱駝泌乳期和獨特的氣候天氣息息相關，導致駱駝乳主要是在干旱或半干旱地區生產[5-7]，而高昂的人力、運輸和儲藏成本，使得目前駱駝乳價格是牛乳的8～10倍[8]。營養粉中會添加多種蛋白粉[9]，而不同的源性成分的蛋白粉具有相似的口感和化學成分[10-11]，難免有不法商家會虛假宣傳、以次充好從中牟取暴利。實時熒光PCR技術通過檢測不同物種的特異性保守序列，已有報道可應用于蛋白粉中源性成分的鑒定[12-13]。文章利用實時熒光PCR技術對23個駝乳營養粉樣本分別檢測駱駝、牛、羊、大豆源性成分，判斷其質量狀況及其標簽真實性。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

駝乳營養粉，隨機采購23批不同商家的駝乳營養粉樣品見表2。無水乙醇（純度≥99.7%，國藥集團化學試劑有限公司）；廣譜型基因組DNA小量純化試劑盒[寶生物工程（大連）有限公司]；駱駝源性成分核酸檢測試劑盒、羊源性成分核酸檢測試劑盒、牛源性成分核酸檢測試劑盒、大豆源性成分核酸檢測試劑盒（廣州雙螺旋基因技術有限公司）。

1.2 儀器與設備

CFX 96 Touch實時熒光PCR檢測儀（BIO-RAD公司）；Multifuge X 1 R冷凍高速離心機（Thermo Fisher Scientific公司）；ScanDrop 100核酸蛋白測定儀（Analytik Jena公司）；Vortex Wizard渦旋震蕩儀（Velp Scientifica公司）；Practum 224-1 CN電子天平（Sartorius公司）；MINIB-100金屬浴恒溫器（北京智云達科技股份有限公司）。

1.3 試驗方法

駱駝源性成分、牛源性成分、羊源性成分參考GB/T 38164—2019《常見畜禽動物源性成分檢測方法》[14]，大豆源性成分參考BJS 201707《植物蛋白飲料中植物源性成分鑒定》[15]，結合試劑盒進行測定，每次試驗分別設置陰性對照、陽性對照、空白對照、內參基因，樣品和對照設置2個平行反應體系。引物和探針序列見表1。

表1 引物和探針序列

1.3.1 DNA提取與純化

稱取50 mg駝乳營養粉置于2 mL離心管中，按照DNA提取試劑盒說明書步驟提取DNA，DNA提取質量用核酸蛋白測定儀（A260/A280）檢測。

1.3.2 PCR擴增反應

反應試劑解凍后，每PCR管中加入20 μL反應液，再加入5 μL各樣品DNA模板，蓋好管蓋，渦旋混勻30 s，離心1 min，確認各管無氣泡后放入實時熒光PCR儀中，熒光基團選擇FAM，淬滅基團選擇MGB。反應條件：去污染37 ℃ 10 min，預變性95 ℃ 5 min，變性95 ℃ 15 s，退火延伸60 ℃ 60 s（收集熒光信號），40個循環。

2 結果與分析

DNA提取液A260/A280的值均在1.6～1.8范圍內，質量濃度為10～200 ng/μL，表明DNA模板的純度和濃度均符合后續PCR的要求。

23份樣品DNA模板按照1.3.2小節方法進行駱駝、牛、羊、大豆源性成分的PCR擴增反應，擴增曲線見圖1～圖4。閾值基線設置為陽性對照熒光強度的1/50，當熒光強度達到閾值時的擴增循環數即為Ct值。Ct值≤35.0，判定為陽性；Ct值≥40.0，判定為陰性。此次試驗陽性對照Ct值均小于20.0，陽性樣品Ct值均小于35.0，符合判定要求。如表2所示，駝乳營養粉標簽成分均標稱含駝乳粉、全脂乳粉，部分標稱含有大豆蛋白粉。23個樣品中，檢出駱駝源性成分的為1個，占總數的4.3%，檢出牛源性成分的為23個，占總數的100%，檢出羊源性成分的為0個，占總數的0，檢出大豆源性成分的為13個，占總數的56.5%。

圖1 駱駝源性成分檢測

圖2 牛源性成分檢測

圖3 羊源性成分檢測

圖4 大豆源性成分檢測

表2 駝乳營養粉檢測結果

3 結論與討論

駝乳營養粉屬于固體飲料，側重飲料工藝，奶粉含量較低。雖然所有樣品標簽都標明添加了駝乳粉，但是添加量存在較大差異，添加量最多的為10%，最少的僅為0.5%。表明駝乳營養粉質量良莠不齊。雖然駝乳粉添加量較少的樣品分離后的DNA產量較低，但通過實時熒光PCR擴增，分離出的DNA片段很容易被特異性識別[13]，本次試驗方法參考標準配合試劑盒使用，檢出限為0.1%[14-15]。從試驗結果可以看出：多數生產駝乳營養粉的企業沒有嚴格按照標簽值添加駝乳粉；企業在蛋白的源性成分選擇上，所有的企業都添加了牛乳粉，部分企業添加了大豆蛋白粉，沒有企業添加羊乳粉，造成這一現在主要原因可能是牛乳粉和大豆蛋白粉價格低廉，駝乳粉和羊乳粉價格相對較貴造成的[8]。

此次試驗利用PCR技術來檢測駝乳營養粉中蛋白源性成分，特異性和靈敏度較好，可為駝乳營養粉的監督抽檢及產品標準的修訂提供參考依據。大致了解了駝乳營養粉中蛋白源性成分的組成及含量，也能更好的維護消費者的合法權益，促進駝乳營養粉產業健康發展。