臨床試驗陰性結果應考慮的問題

王夢星，潘岳松，劉丹丹，金奧銘

臨床試驗是評估新藥或新療法有效性和安全性最有效的方法，目前醫學發展已經進入循證醫學時代，臨床試驗不僅可以提供高質量的循證醫學證據，其結果還可以幫助研究者回答不同的研究問題，指導臨床為患者提供更優化的治療方案。僅根據統計學顯著性或試驗結果方向來判定臨床試驗有無意義是不合理的[1]。當臨床試驗主要結果為陰性時，還需要多方面分析，從中找到潛在益處的線索。

1 臨床試驗陰性結果現狀

目前全球開展的臨床試驗體量巨大，從ClinicalTrials.gov臨床試驗注冊平臺來看，截至目前臨床試驗注冊數量已達45萬個[2]。中國自2016年國家藥品監督管理局改革開始，新啟動的試驗數量也快速增長，2020年之前的年均增長率更是達20%以上[3]。臨床試驗的最終目的是確定治療是否有效，但無效結果其實更為常見。不過，在實際情況下，陽性結果的試驗往往比陰性結果的試驗發表得更快，并且更容易發表在影響因子更高的期刊上[4]。獲得陽性結果的試驗與結果沒有統計學意義的試驗相比，發表概率幾乎是后者的4倍，且陰性結果試驗的中位發表時間還要再晚2年左右[4]。但是，目前這種基于主要結局的P值是否＜0.05便將臨床試驗標記為陽性或陰性的方式過于簡單且不合理，需要根據研究整體證據和效能等做綜合考量，從而使臨床試驗結果更具有參考價值[5]。

2 臨床試驗陰性結果的可能影響因素

Pocock等[5]于2016年在NEJM上發表了The Primary Outcome Fails—What Next?一文，詳細闡述了臨床試驗的主要結局失敗后需要考慮的12個問題，包括：潛在獲益跡象、統計效能、主要結局的定義、人群選擇、合適的治療方案、試驗執行、非劣效分析、亞組結果、次要結局分析、分析方法改變、陽性外部證據和生物學理論。本文對此做了進一步的歸納，重點從臨床試驗設計、研究執行情況、探索性結果分析、外部證據及生物學支持等方面進行討論。

2.1 臨床試驗設計 臨床試驗設計方面主要考慮人群選擇、統計效能、方案的合理性及主要結局的定義問題。首先，要考慮研究人群是否合適，研究對象的入選標準是判斷試驗結果適用范圍的重要依據，只有研究人群具有代表性，才能對適應證總體人群做可靠的推斷。如伊伐布雷定對慢性心力衰竭和左心室收縮功能不全影響（effects of ivabradine on cardiovascular events in patients with moderate to severe chronic heart failure and left ventricular systolic dysfunction，SHIFT）研究在吸取既往相關研究的經驗后，將研究人群從冠心病患者鎖定至心力衰竭患者，研究主要結局定為心血管性死亡或心力衰竭住院，最終獲得了陽性結果[6]。其次，臨床試驗的統計效能也對結果有重要影響。通常來說，納入的病例數不夠有可能導致本來存在的療效不能充分呈現，即出現假陰性結果（Ⅱ類錯誤）。足夠的把握度需要充分的終點事件數，這可以通過增加樣本量、延長隨訪時間、采用復合終點或將以上幾種方式組合來滿足檢驗效能的要求[5，7]。再次，研究也要考慮治療方案的合理性，如果用藥劑量不當，會增大試驗結局陰性的風險。如莫索尼定在心力衰竭患者中的應用試驗（the moxonidine congestive heart failure trial，MOXCON）在使用莫索尼定來治療慢性心力衰竭時，方案中設定的目標藥物劑量遠高于早期研究中所使用的劑量，從而導致臨床試驗結局陰性[8]。最后，主要結局的定義問題也需要重點關注。有時臨床試驗的成功取決于對主要結局的清晰定義及準確判定[9]。在經皮冠狀動脈介入治療患者中cangrelor與氯吡格雷標準治療對比（comparing cangrelor to clopidogrel standard therapy in subjects who require percutaneous coronary intervention，CHAMPION PHOENIX）研究通過仔細評估患者的基線生物標志物狀態，對急性冠狀動脈綜合征患者進行梗死再區分，更加準確地定義了心肌梗死這一主要結局指標，從而證明了cangrelor預防經皮冠狀動脈介入治療患者發生缺血事件的療效[7]。

2.2 臨床試驗執行情況 臨床試驗質量是評價臨床試驗結果的基礎，臨床試驗執行情況直接影響試驗的結果[10]。臨床試驗應嚴格按照藥物臨床試驗質量管理規范（good clinical practice，GCP）執行[11]，如果不能高質量地執行研究方案會導致治療效應被稀釋。高質量的執行及質量控制才能為可靠的研究結果增加保障。

2.3 臨床試驗探索性結果分析 臨床試驗的探索性結果分析部分涵蓋次要結局分析、亞組分析、分析方法改變、非劣效分析以及潛在獲益分析等方面的內容。首先需要關注的是次要結局是否有陽性發現。2022年10月美國食品和藥品管理局發布的臨床試驗多終點指南指出，當次要研究結局的效力足夠強時，也可能會影響臨床實踐[12]。雖然監管部門不會基于次要結局批準藥物上市，但次要結局可以輔助支持主要結局或展示其他臨床重要效果，指明更合理的探索方向。再者，亞組結果是否顯示陽性信號也值得考慮。人用藥品技術要求國際協調理事會（The International Council for Harmonisation of Technical Requirements for Pharmaceuticals for Human Use，ICH）發布的臨床試驗生物統計指導原則以及我國國家藥品監督管理局發布的GCP指出，對主要研究結局為陰性的臨床試驗進行亞組分析是合理的[11，13]。一般研究會基于生物學上合理的假設預先確定幾個亞組，但只有事先設計好的確證性亞組分析所得的結論才可作為藥物申請注冊上市的直接依據[14-15]。亞組分析盡管不能改變受試藥物用于全體人群的陰性結果，卻可以提供可能獲益的亞組人群線索，為進一步的研究可能性提出檢驗假設[16]。因此，臨床試驗也可以考慮改變分析策略，在方案設計之初，通過預設協變量、不同方案集對比或重復事件分析等來進一步驗證結果[17]。不論試驗設計和過程執行得如何標準，如果選擇了不恰當的統計方法，就可能得到陰性甚至完全相反的結果。此外，對于陰性結果，嘗試進行非劣效分析有可能提供額外的參考價值，雖然非劣效性的事后解釋在方法學上是有爭議的，但如果新的治療措施具有除療效外的其他優點并更易于被患者接受，那么非劣效結論就具有一定的參考意義[18-19]。

除了上述方面，在進行臨床試驗探索時，還要關注潛在獲益的趨勢。在P＞0.05的前提下，需要經過充分考慮才能推斷結果是否存在獲益信號或傾向。當主要結局呈陰性時，亞組或次要結局仍可能會展示比較好的療效，所以全面解讀研究結果會比直接將研究定性為“失敗”更加合適[20]。

2.4 臨床試驗的外部證據與生物學支持 對主要結局為陰性的臨床試驗結果解讀，還需要關注研究的外部陽性證據和生物學理論是否充足。如果既往的類似研究結果或相關系列試驗的meta分析證據為陽性，但自己的臨床試驗結果卻為陰性，則應仔細考究并謹慎對待陽性外部證據，找出可能存在差異的原因來對研究結果進行解釋。另外，使用強有力的生物學理論來支持干預措施也是不可或缺的一環。臨床試驗應該建立在充分了解相關科學文獻的基礎上，盡量避開生物學機制尚有爭議的研究領域。對于方法學和執行方面沒有明顯問題的陰性結局試驗，應尋找導致治療失敗的生物學原因，找到強有力的生物學理論證據佐證結果的合理性[21-22]。

3 臨床試驗陰性結果案例分析——以INSURE研究為例

3.1 INSURE研究概況 吲哚布芬對比阿司匹林治療急性缺血性卒中（indobufen versus aspirin in acute ischemic stroke，INSURE）研究是一項關于抗血小板藥物治療卒中的隨機、雙盲、對照、非劣效性的多中心臨床試驗，在2019年6月2日—2021年11月28日從中國的163個分中心入組了5438例中重度缺血性卒中患者，吲哚布芬組在90 d內發生卒中的患者有213例（7.9%），阿司匹林組為175例（6.4%）（HR1.23，95%CI1.01～1.50），CI上限超過了非劣效邊界1.25，表明在降低90 d卒中復發風險方面吲哚布芬未達到非劣于阿司匹林。不過，在安全性終點方面，吲哚布芬組的中度或重度出血數量低于阿司匹林組，提示吲哚布芬的安全性可能相對較好[23]。接下來，本文將從試驗設計、研究執行、探索分析、外部證據及生物學支持方面對INSURE研究的結果做進一步剖析與討論。

3.2 INSURE研究陰性結果的綜合分析

3.2.1 INSURE研究設計 INSURE研究聚焦人群為癥狀出現后72 h內的我國中重度缺血性卒中患者，排除了有出血風險和伴有其他會影響療效疾病的患者，如既往有顱內出血性疾病、心源性栓塞、動脈瘤、嚴重肝腎功能不全以及隨機化前10 d內使用過肝素或口服抗凝藥物等[23]。在充分考慮患者安全性的前提下，使研究人群具有代表性。因此，INSURE研究結果也只適用于我國中重度卒中人群，不能延伸至輕型卒中及其他種族卒中人群。

目前如何精準地對中重度卒中患者進行個體化抗血小板治療并降低出血風險的循證醫學證據仍舊不足，且沒有合適的抗血小板藥物能使重度人群獲益。吲哚布芬作為一種可逆性的環氧合酶-1抑制劑，其生化、功效和臨床效果與標準劑量的阿司匹林相當，卻具有胃腸道反應和出血風險較低的優勢，據此INSURE研究選擇在中重度卒中人群中使用吲哚布芬進行抗血小板治療。此外，INSURE的主要結局定義與既往國際抗血小板藥物臨床試驗保持一致，為3個月內卒中復發情況，以便后續與其他研究的結果進行對比分析。最后，INSURE研究通過嚴格的樣本量估計來獲得需要納入的人群數量，采用隨機、雙盲的方法，盡可能控制可能存在的混雜偏倚。

3.2.2 INSURE研究執行情況 從研究的實施情況來看，INSURE研究過程完全根據ICH指南中的臨床試驗質量管理原則開展，詳細記錄了方案違背和不良事件情況，并根據風險大小制定相應的數據安全監察計劃，設置數據安全監測委員會定期監督研究的進展與安全性信息[13]。從整體數據來看，5438例隨機入組的患者中只有不到1%不符合入組標準，僅7例患者在3個月隨訪時失訪，1.5%的患者使用了方案禁忌用藥，受試者依從性較高。盡管研究執行期間受新型冠狀病毒感染疫情沖擊，但也基本上按照方案要求完成了研究內容，研究質量可靠。

3.2.3 INSURE研究結果分析 INSURE研究的整體結果未達到非劣效，研究者隨后進行了一系列的探索性分析。在預設的亞組分析中發現，吲哚布芬在女性、既往接受過抗血小板治療、發病至隨機化時間＜24 h和NIHSS評分≥10分的患者中有不劣于阿司匹林的趨勢，可能在這些特定亞組患者中，吲哚布芬仍具某些潛在的優勢特征和應用價值，這有待進一步驗證。既往的TAXUS洗脫支架或冠狀動脈搭橋手術治療動脈狹窄（TAXUS drug-eluting stent versus coronary artery bypass surgery for the treatment of narrowed arteries，SYNTAX）研究分析主要結局顯示TAXUS洗脫支架經皮冠狀動脈介入治療組的血管事件發生率更高[24]，但經過亞組分析發現在左主干病變亞組中經皮冠狀動脈介入治療的潛在優勢。隨后，研究者在該亞組人群基礎上設計了XIENCE藥物洗脫支架與冠狀動脈搭橋術對左主干血運重建效果的評價（evaluation of XIENCE versus coronary artery bypass surgery for effectiveness of left main revascularization，EXCEL）研究，驗證了SYNTAX研究特定亞組經皮冠狀動脈介入治療的療效優勢[25]。因此，未來INSURE研究也可以針對潛在優勢的亞組進行分析挖掘，以找出更有針對性的治療人群。從INSURE研究的次要結局來看，吲哚布芬組90 d內發生顱內出血和不良事件的比例低于阿司匹林組。雖然安全性結局的差異未達到統計學意義，但其結果提示吲哚布芬的安全性可能更好。所以對于易發生胃腸道反應或有較高出血風險的患者，吲哚布芬仍然可以作為可選擇的抗血小板治療方案。

3.2.4 INSURE研究外部證據和生物學支持吲哚布芬作為一種能快速有效阻止血栓形成的可逆性環氧合酶-1抑制劑，其抗血小板作用持續時間短，出血風險低且出血后易止血[26]。雖然吲哚布芬組與阿司匹林組安全性結局差異并無統計學意義，但90 d內吲哚布芬組發生出血和不良事件的比例更低，以上結果基本符合吲哚布芬的生物學機制，提示吲哚布芬安全性可能會更好。近期發表的一項關于使用氯吡格雷聯合吲哚布芬或阿司匹林治療冠狀動脈藥物洗脫支架置入術后患者的研究也表明，吲哚布芬聯合氯吡格雷能顯著降低患者1年內凈不良臨床事件的風險[27]。這主要是因為出血事件減少且缺血事件沒有增加，因此吲哚布芬可能具有更“溫和”的抗血小板作用且出血風險更低。

綜上所述，應以科學和理性的態度看待臨床試驗的成敗。當試驗的主要結果為陰性時，研究者可以通過研究設計與執行、探索性結果以及外部和生物學證據等方面批判性地對研究進行解讀。陰性結果的出現是正常的，并不一定就意味著研究失敗。有統計學意義的結果未必具有臨床意義，有些通過可靠的研究方法獲得的陰性結果有時甚至比陽性結果更有價值，研究人員必須認識到臨床研究是有價值的，無論其顯著性水平如何，當結果得到適當的解釋時，就能為后續臨床研究的設計提供寶貴的經驗。