系統性紅斑狼瘡患者外周血中T細胞α7nAChR mRNA的表達及其臨床意義

王思茹，楊娉婷

（中國醫科大學 1. 附屬盛京醫院風濕免疫科，沈陽 110004； 2. 附屬第一醫院風濕免疫科，沈陽 110001）

系統性紅斑狼瘡 （systemic lupus erythematosus，SLE） 是以產生自身免疫性抗體以及免疫復合物為特點的慢性、炎癥性自身免疫性疾病［1］。免疫復合物沉積激活了經典補體通路，導致了自身炎癥和多系統的損傷。SLE病因比較復雜，目前其發病機制尚未完全闡明。已有研究［2］表明，免疫系統和神經系統共同調控炎癥的發生和發展。近年來迷走神經介導的“膽堿抗炎通路”受到廣泛關注［3］。作為免疫的核心細胞，T細胞表達大部分膽堿能系統的組成成分，包括膽堿乙酰轉移酶、乙酰膽堿酯酶受體以及毒蕈堿型和煙堿型乙酰膽堿受體 （muscarinic acetylcholine receptors，mAChRs；nicotinic acetylcholine receptors，nAChRs）。在乙酰膽堿酯酶受體中，免疫細胞表達mAChRs 5 個亞型 （M1～M5） 和nAChRs中的α2、α4、α5、α6、α7、 α9、α10 亞型［4］。

nAChRs廣泛表達，是乙酰膽堿門控離子通道，具有不同的性質和功能［5］。在神經肌肉連接處和自主神經節中，nAChRs介導興奮性突觸傳遞；而在中樞神經系統神經元中，nAChRs主要起調節作用。nAChRs也在非興奮性細胞中表達，影響細胞分化和增殖［6］。α7煙堿型乙酰膽堿受體 （α7 nicotinic acetylcholine receptor，α7nAChR） 在非興奮細胞中的作用體現在膽堿能抗炎途徑中。免疫細胞中α7nAChR表達，通過迷走神經的傳出神經抑制炎癥［5］。在炎癥發展過程中，外周細胞因子激活迷走神經的傳入纖維，使迷走神經遠端釋放乙酰膽堿；乙酰膽堿激活α7nAChR，進而參與調節機體炎癥反應［7］。

FUJII等［8］研究提示T細胞表面α7nAChR參與慢性炎癥的免疫調節及 輔助T細胞 （T helper cell，Th） 分化，α7nAChR與腎臟慢性炎癥和腎臟損傷相關。SLE患者外周血中乙酰膽堿水平低且不穩定，乙酰膽堿受體表達水平也相對較低，因此，檢測乙酰膽堿受體mRNA表達是目前常用的方法［8］。關于SLE患者外周血T細胞α7nAChRsmRNA水平的研究目前尚未見報道。本研究探討SLE患者外周血中CD4+T細胞和CD8+T細胞α7nAChRmRNA的表達情況及臨床意義，旨在為SLE的發病機制及治療提供新的思路。

1 材料與方法

1.1 臨床資料

選取2019 年 7 月至12 月中國醫科大學附屬第一醫院風濕免疫科住院的16例女性SLE患者為SLE組。下載患者電子病歷收集一般臨床資料 （年齡、性別、病程和主要癥狀） 和實驗室檢測指標 ［血常規、尿常規、肝腎功能、24 h尿蛋白定量、紅細胞沉降率 （erythrocyte sedimentation rate，ESR）、 C反應蛋白 （C-reactive protein，CRP）、免疫球蛋白 （IgA、IgG、IgM）、補體 （complement，C） 3、C4、細胞因子和T細胞亞群、SLE疾病活動指數 （systemic lupus erythematosus disaease activity index，SLEDAI） ］。

納入標準：符合歐洲風濕病聯盟 （EULAR） 和美國風濕病學會 （ACR） 的SLE分類標準［9］。排除標準：（1） 原發性腎臟疾病、腎血管畸形；（2） 糖尿病、心腦血管疾病、惡性腫瘤、腦梗死、病毒性肝炎、肝硬化、血液病及其他嚴重疾??；（3） 并發感染。選取 16 例年齡相匹配的女性健康志愿者作為對照組 （NC組）。本研究獲得中國醫科大學附屬第一醫院倫理委員會批準，患者均知情同意并簽署知情同意書。

1.2 外周血單個核細胞 （peripheral blood mononuclear cell，PBMC） 分離

采集患者早晨空腹肘靜脈血 （5 mL）。采用Ficoll-PaqueTMPLUS （美國Amersham Biosciences公司） 以梯度離心法從5 mL乙二胺四乙酸 （ethylene diamine tetraacetic acid，EDTA） -新鮮抗凝全血中分離獲得PBMC。

1.3 CD4+ T和CD8+ T細胞分選

以等體積磷酸鹽緩沖液 （phosphate buffer saline，PBS） 重懸PBMC，PBS和PBMC按1 ∶1混合，共230g。 25 ℃下220g離心8 min，離心后取上清液，重復上述操作。然后使用人CD4 MicroBeads、人CD8 MicroBeads （德國Miltenyi Biotec公司）按照試劑說明書分選并獲得CD4+T細胞和CD8+T細胞。

1.4 實時PCR （real time PCR，RT-PCR） 檢測CD4+T細胞、CD8+ T細胞中α7nAChR mRNA表達

使用Axyprep? Multisource Total RNA Miniprep Kit （#AP-MN-MS-RNA-50，美國Axygen公司） 試劑盒分別從CD4+T細胞、CD8+T細胞中提取RNA 。使用Primescript? RT reagent Kit with gDNA Eraser（#RR047A，大連TaKaRa公司） 試劑盒將RNA逆轉錄為cDNA。RT-PCR采用TB Green? Premix EX Taq?Ⅱ （#RR820A，大連TaKaRa公司） 試劑盒，引物系列：α7nAChR，正向5’-CCGACGGGGGCAAGATGC-3；反向5’-GGCCGCGGAAGCCGATGTAC-3’。GAPDH，正向5’-GCACCGTCAAGGCTGAGAACC-3；反向5’-TGGTGAAGACGCCAGTGGA-3’。

實驗前對引物進行PCR驗證，1.5%瓊脂糖凝膠電泳可以得到擴增后的單一片段。RT-PCR反應體系為20 μL，TB Green qPCR Master Mix 12.5 μL，正向、反向引物各1 μL，cDNA模板2 μL，ddH2O 3.5 μL。擴增條件：95 ℃預變性3 min，然后95 ℃溶解15 s，65 ℃退火30 s，72 ℃延伸40 s，共39個循環。采用2-ΔΔCt計算基因相對表達量。

1.5 統計學分析

采用SPSS 13.0軟件進行統計學分析。符合正態分布的計量資料采用±s表示；偏態分布的計量資料采用M（P25～P75） 表示，對數轉化后數據符合正態分布。2組間CD4+T細胞和 CD8+T細胞α7nAchRmRNA表達比較采用獨立樣本t檢驗。α7nAchRmRNA表達與各臨床指標的關系采用Pearson或Spearman相關分析。P＜ 0.05為差異有統計學意義。

2 結果

SLE組年齡 （33.42±14.60） 歲，NC組年齡 （25.33±5.66） 歲，2組比較差異無統計學意義 （P＞ 0.05）。SLE組患者各項臨床指標見表1。

表1 SLE組患者各項臨床指標Tab.1 Clinical indicators in the SLE group

2.1 2組外周血中CD4+T細胞和CD8+T細胞α7nAChR mRNA的表達比較

結果顯示，SLE組患者外周血中CD4+T細胞和CD8+T細胞α7nAChRmRNA表達分別為0.50±0.27、0.83±0.58；NC組CD4+T細胞和CD8+T細胞α7nAChRmRNA表達分別為1.02±0.49、1.83±0.46，SLE組均顯著低于NC組 （P分別為0.005、0.001）。

2.2 SLE患者外周血中CD4+ T細胞和CD8+ T細胞α7nAChR mRNA的表達與各項臨床指標的相關分析

結果顯示，SLE患者CD4+T細胞α7nAChRmRNA表達與SLEDAI （r= -0.605，P= 0.03） 血清IgG （r=-0.637，P= 0.035） 和CRP （r= -0.611，P= 0.034） 水平顯著負相關。見表2。

表2 SLE患者CD4+ T細胞和 CD8+ T細胞α7nAChR mRNA水平與各項臨床指標的相關分析結果Tab.2 Correlation analysis of α7nAChR mRNA levels in CD4+ and CD8+ T cells with various clinical indicators in patients with SLE

3 討論

膽堿能抗炎途徑是一種免疫反應調節機制，取決于自主神經系統，是由迷走神經、乙酰膽堿及其受體等組成的經典神經免疫調節通路，也稱為抗炎反射［10］。膽堿能抗炎途徑可激活調節免疫細胞，通過抑制細胞增殖分化和細胞因子釋放發揮抗炎作用［11-12］。在敗血癥、結腸炎和心肌缺血性損傷模型中，增加副交感神經張力可以抑制細胞因子釋放、減輕組織損傷并改善炎癥介導的損傷［13］。

膽堿能神經元可以抑制急性炎癥，迷走神經刺激在多種炎癥介導疾病模型中具備有益作用［14］。膽堿能抗炎途徑的核心成分是α7nAChR。研究［14］顯示，在α7-/-小鼠分離的巨噬細胞中，尼古丁對腫瘤壞死因子-α （tumor necrosis factor alpha，TNF-α） 產生的抑制作用減弱。同樣，迷走神經刺激降低血清TNF-α水平。

既往研究［15］闡明a7nAChR對T細胞和抗原呈遞細胞 （antigen-presenting cells，APCs） 具有特異性功能，a7nAChR通過抑制抗原加工而干擾抗原遞呈，從而抑制CD4+T細胞活化；CD4+T細胞a7nAChR促進Treg和效應T細胞的發育。a7nAChR對APCs和T細胞的不同功能可能與免疫應答強度的調節有關［16］。核因子κB （nuclear factor κB，NF-κB） 是炎癥反應中不可代替的關鍵性轉錄因子，NF-κB可與多種調控基因的啟動子結合并活化，調控炎癥反應相關基因的轉錄，促進大量炎性細胞因子的表達［17-18］。CHRNA7是α7nAChR的編碼基因，大量表達于免疫細胞及線粒體表面［19］。α7nAChR與乙酰膽堿特異性結合后可激活下游信號因子，抑制NF-κB信號通路激活，使炎癥介質合成下調來發揮抗炎作用［20］。

既往研究［21］證實了脾膽堿能信號在促進自身反應性B細胞生成和SLE發生發展中起重要作用。通過中和乙酰膽堿能遞質或拮抗膽堿能受體來抑制膽堿能信號傳導可能是使體內B細胞代謝正?；臋C制，并可作為SLE患者的治療藥物靶點。FAIRLEY等［22］研究發現SLE狼瘡小鼠膽堿抗炎通路受到抑制，刺激膽堿抗炎通路可以使炎癥反應減弱，從而保護腎臟。此外，SLE部分患者還會表現自主神經病變［22］，這些均提示迷走神經低活性和膽堿抗炎通路受損參與了SLE的發生和發展。

已有研究［22-23］表明，免疫T細胞表面高度表達乙酰膽堿受體，其中α7nAChR受體與膽堿抗炎通路顯著相關；研究還發現尼古丁體外作用于α7 缺陷小鼠的CD4+T細胞，能抑制CD4+T細胞對外來抗原的應答，下調T細胞的自身增殖，降低Th1 細胞的免疫應答，從而下調TNF-α和INF-γ的表達，并降低Th17細胞的免疫應答，下調IL-17、 IL-21、 IL-22 分泌，從而提升膽堿抗炎通路的活性。提示α7nAChR參與免疫調節，α7nAChR拮抗劑 （尼古丁等） 有望成為免疫系統疾病的有效治療靶點。本研究結果顯示，SLE組外周血CD4+T細胞和CD8+T細胞α7nAChRmRNA表達較NC組顯著降低 （均P＜ 0.05）。SLE患者外周血CD4+T細胞α7nAChRmRNA表達與SLEDAI、血清IgG和CRP水平呈顯著負相關 （均P＜ 0.05）。提示SLE患者外周血中CD4+T細胞表面α7nAChR可能參與了SLE的發生發展，因此α7nAChR可以作為判定SLE疾病活動的臨床新指標，與以往研究結果一致。

綜上所述，SLE患者外周血CD4+T細胞及CD8+T細胞表面α7nAChRmRNA與正常人相比顯著降低，其水平與SLEDAI、IgG、CRP水平顯著負相關。本研究為進一步明確 SLE發病中的具體機制及臨床工作中病情活動評價提供了依據。今后將進一步擴大樣本量，同時按照器官受累情況進一步分組，深入探討α7nAChRmRNA表達在SLE患者中的臨床意義。