Tubastatin A通過降低氧化應激減輕膿毒癥所致心肌損傷的體外研究

尤佳琪，劉暢，崇巍

（中國醫科大學附屬第一醫院急診科，沈陽 110001）

研究［1］顯示，40%～50%膿毒癥患者可發生心肌抑制，其中的7%會發生心力衰竭。目前，對于膿毒癥所致心功能障礙的機制尚未明確，普遍認為心肌抑制與膿毒癥時的炎癥介質、線粒體功能障礙和氧化應激損傷等有關，但確切機制仍不清楚［2］。生理條件下，心臟組織中活性氧 （reactive oxygen species，ROS）生成很少［3］，然而在缺氧、高糖、炎癥等刺激下ROS大量產生［3-6］。膿毒癥時，循環中病原體相關分子模式 （pathogen-associated molecular patterns，PAMPs）、損傷相關分子模式 （damage-associated molecular patterns，DAMPs） 共同作用于心肌細胞［7］，通過誘導胞內的黃嘌呤氧化酶 （xanthine oxidase，XO）、NADPH氧化酶 （NADPH oxidase，NOX） 活化和線粒體損傷產生ROS［8］。過量的ROS引起心肌細胞氧化應激損傷［9］。Tubstatin A （Tub A） 是組蛋白去乙酰化酶6 （histone deacetylase 6，HDAC6） 選擇性抑制劑［10］，本課題組密歇根大學合作伙伴發現Tub A可以提高致死性膿毒癥大鼠的遠期生存率［11］。有研究［12-16］表明，Tub A可以減少心肌細胞、星形膠質細胞、乳腺上皮細胞等ROS的產生，減輕炎癥反應，從而對細胞發揮保護作用。

本研究應用脂多糖 （lipopolysaccharide，LPS） 刺激巨噬細胞獲得細胞上清液，用其刺激心肌細胞，建立體外膿毒癥心肌損傷模型，并用Tub A進行干預，探討Tub A對膿毒癥心肌細胞氧化應激損傷的作用。

1 材料與方法

1.1 細胞培養及分組

RAW264.7巨噬細胞購自美國ATCC公司，培養條件為完全培養基 （DMEM高糖培養基+10%FBS+1%青鏈霉素），37 ℃，5% CO2以及飽和濕度孵箱。巨噬細胞生長達80%左右接觸率時饑餓培養 （DMEM高糖培養基+0.5%FBS+1%青鏈霉素） 過夜，用1 μg/mL LPS （L8247，美國Sigma公司） 刺激8 h后取上清液獲得心肌細胞培養基 （MCM組）；用無LPS刺激的巨噬細胞8 h后取上清液獲得心肌細胞培養基 （Sham組），兩種上清液4 ℃保存備用。

用完全培養基培養H9C2心肌細胞 （美國ATCC公司），培養條件與RAW264.7巨噬細胞一致。待H9C2生長達80%左右接觸率并饑餓過夜后，Sham組用無LPS刺激的巨噬細胞上清液培養；MCM組用LPS刺激巨噬細胞所獲上清液培養；Tub A組預處理 （饑餓培養基+40 μmol/L Tub A） 3 h，正式處理 （MCM組應用的培養基+40 μmol/L Tub A） 孵育24 h［17-18］，收集心肌細胞及上清液檢測相關指標。

1.2 巨噬細胞上清液中一氧化氮 （nitric oxide，NO）水平檢測

應用總NO含量檢測試劑盒 （S0024，中國碧云天公司） 檢測，操作按照說明書步驟進行。酶標儀 （美國Biotec公司） 測定樣本在540 nm的吸光度值，根據標準曲線計算樣品濃度。

1.3 心肌細胞活性檢測

將Sham組、MCM組、Tub A組和空白對照組 （饑餓培養基培養的心肌細胞） 按照1×104/孔接種到96孔板并饑餓過夜后給予相應刺激。在各孔中加入10 μL的CCK8試劑 （日本同仁化工公司），混勻后放回孵箱，2 h后拿出96孔板，酶標儀測定樣本在450 nm處的吸光度值。

1.4 流式細胞儀檢測心肌細胞內ROS水平

收集各組心肌細胞制備細胞懸液，應用ROS檢測試劑盒 （CA1410，中國索萊寶公司） 將DCFH-DA探針裝載入心肌細胞內 （陰性對照除外），應用流式細胞儀檢測熒光強度，用FITC通道檢測2，7-二氯熒光素 （2，7-dichlorofluorescein，DCF） 熒光，應用Flow Jo軟件分析結果。

1.5 心肌細胞內丙二醛 （malondialdehyde，MDA） 含量檢測

收集各組心肌細胞，檢測MDA含量。按照試劑盒 （BC0025，中國索萊寶公司） 說明書步驟進行操作，檢測心肌細胞內MDA含量，應用酶標儀測定樣本在532 nm和600 nm處的吸光度值。各組分別計算：ΔA532=A532測定-A532空白，ΔA600=A600測定-A600空白，ΔA=ΔA532-ΔA600； MDA含量 （nmol/107cell） =107.5×ΔA。

1.6 細胞釋放的乳酸脫氫酶 （lactate dehydrogenase，LDH） 檢測

按照試劑盒 （BC0685，中國索萊寶公司） 說明書檢測2組巨噬細胞上清液中以及各組心肌細胞上清液中的LDH，應用酶標儀測定樣本在450 nm處的吸光度值，根據標準曲線計算樣品濃度。心肌細胞所產生的LDH=LDH （心肌細胞上清液） -LDH （所用的巨噬細胞上清液）。

1.7 心肌細胞釋放心肌型肌酸激酶同工酶 （creatine kinase-MB，CK-MB） 檢測

收集各組心肌細胞上清液，按照試劑盒 （SEKR-0059，中國索萊寶公司） 說明書步驟檢測CK-MB水平，應用酶標儀測定樣本在450 nm、630 nm處的吸光度值，根據標準曲線計算樣品濃度。巨噬細胞不產生CK-MB，因此心肌細胞上清液中的CK-MB是心肌細胞產生的。

1.8 統計學分析

應用Excel 2016錄入數據，計量資料采用±s表示，組間比較采用獨立樣本t檢驗，P＜ 0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 MCM組和Sham組巨噬細胞上清液中NO水平

結果顯示，MCM組和Sham組巨噬細胞上清液NO含量分別為 （16.27±3.57） μmol/L、 （0.90±0.68） μmol/L，2組比較差異有統計學意義 （P＜ 0.001）。

2.2 各組心肌細胞氧化應激水平比較

檢測各組細胞ROS熒光強度，以陽性對照組熒光強度峰值為標準，測量各組大于該熒光強度的細胞占比。結果顯示，陽性對照組、Sham組、MCM組、Tub A組、陰性對照組細胞占比分別為46.2%、22.9%、33.0%、22.5%和0。見圖1A。對各組平均熒光強度進行定量分析，結果顯示MCM組熒光強度顯著高于Sham組和Tub A組 （均P＜ 0.05），而Sham組和Tub A組熒光強度比較無統計學差異 （P＞ 0.05），見圖1B。與Sham組比較，MCM組心肌細胞中MDA含量顯著增加 （P＜ 0.05）；與MCM組比較，Tub A組MDA含量顯著減少 （P＜ 0.05）。見圖1C。

圖1 各組心肌細胞中ROS及MDA水平比較Fig.1 Comparison of ROS and MDA levels in each group

2.3 各組心肌細胞損傷情況比較

與Sham組比較，MCM組心肌細胞釋放的LDH水平明顯升高 （P＜ 0.05）；與MCM組比較，Tub A組LDH水平明顯下降 （P＜ 0.05），見圖2A。與Sham組比較，MCM組CK-MB水平明顯升高 （P＜ 0.05），與MCM組比較，Tub A組CK-MB水平有下降趨勢，但差異無統計學意義 （P＞ 0.05），見圖2B。

圖2 各組心肌細胞損傷情況比較Fig.2 Comparison of myocardial cell injury in each group

2.4 各組心肌細胞活性比較

結果顯示，空白對照組與Sham組比較心肌細胞活性無統計學差異 （P＞ 0.05）。與Sham組比較，MCM組與Tub A組心肌細胞活性明顯降低 （P＜ 0.001）；與MCM組比較，Tub A組心肌細胞活性明顯升高 （P＜0.001），見圖3。

圖3 各組心肌細胞活性比較Fig.3 Comparison of myocardial cell activity in each group

3 討論

3.1 經LPS刺激的巨噬細胞可以導致心肌細胞氧化應激和損傷

本研究結果顯示，使用經LPS刺激巨噬細胞的上清液培養心肌細胞后，細胞內ROS 及脂質過氧化產物MDA水平均顯著增加，LDH和CK-MB釋放明顯增加，同時細胞活性明顯下降，提示經LPS刺激的巨噬細胞可以導致心肌細胞氧化應激和損傷。

JI等［16］、RUAN等［18］研究結果與本研究相似，經LPS刺激的巨噬細胞使心肌細胞發生氧化應激損傷，加劇細胞的炎癥反應。過量產生的ROS可抑制線粒體氧化磷酸化，減少細胞內ATP的產生，使細胞活性下降。另外，磷脂膜對ROS的攻擊十分敏感，可發生脂質過氧化，產生MDA和4-羥基壬烯酸等脂質過氧化產物［19］，這些產物可以破壞DNA、蛋白質和酶活性，并激活信號通路，引發細胞的自噬、凋亡、鐵死亡等［20］；大量ROS導致脂質過氧化還可破壞細胞膜結構，導致通透性增加，大量釋放心肌酶及其他細胞損傷標志物［21］。

3.2 Tub A可減輕經LPS刺激的巨噬細胞所致的心肌細胞氧化應激和損傷

本研究結果顯示，應用Tub A對心肌細胞進行干預后，細胞內ROS 及脂質過氧化產物MDA水平均明顯降低，細胞釋放LDH明顯減少，CK-MB作為臨床和體外實驗中診斷膿毒癥心肌損害的關鍵指標，同樣呈下降趨勢。此前已有研究［14］證實，Tub A在星形膠質細胞、乳腺上皮細胞等的膿毒癥模型中具有減輕氧化應激損傷的作用，且在缺氧/復氧的H9C2心肌細胞中也具有減少ROS產生的作用［17］，因此Tub A可能通過降低細胞的氧化應激水平，減輕經LPS刺激的巨噬細胞所致的心肌細胞損傷。

大量研究證實，巨噬細胞受LPS等刺激發生M1極化，形成促炎表型，產生促炎性細胞因子，而NO可作為巨噬細胞發生M1極化的標志物之一。本研究中LPS刺激后的RAW264.7巨噬細胞產生大量NO，可以認為其發生了M1極化，形成促炎表型。膿毒癥引起的靶器官損傷來自于PAMPs、DAMPs的共同作用［7］。本研究應用LPS刺激巨噬細胞獲得的上清液，同時具備了PAMPs和DAMPs，模擬膿毒癥時復雜的內環境，成功構建體外細胞模型，符合膿毒癥心肌損害的病理機制。此外，眾多研究［22-24］表明，氧化應激損傷是膿毒癥心肌損害發生的重要病理生理過程，即心肌細胞內ROS、MDA含量、心肌細胞損傷標志物的釋放水平及細胞活性的改變，與本研究結果一致。JI等［16］、RUAN等［18］同樣應用本研究方法成功建立了膿毒癥心肌損害體外模型，故應用此方法建立體外膿毒癥心肌損傷模型具有較高科學性。

綜上所述，心肌損傷作為急診科常見的膿毒癥并發癥，其發生機制與氧化應激損傷有著十分密切的關系。Tub A可以通過減少ROS的產生，減輕膿毒癥導致的心肌細胞氧化應激損傷，進而保護心肌細胞，提高心肌細胞的生存率，維持心臟功能的穩定。本研究為體外實驗，無法完全模擬復雜的體內過程，因此有待體內實驗進一步驗證。