角膜基質修復的機制和調控因素研究進展

程思敏,楊燕寧

0 引言

角膜是透明、無血管、神經密集的重要屈光結構,分為上皮層、前彈力層、基質層、后彈力層、內皮層,其中基質層對角膜透明度的維持具有重要作用[1]。外傷、感染、手術、遺傳和全身疾病等因素導致基質結構改變,輕度損傷后出現角膜混濁通過基質修復可減退,嚴重損傷后發生角膜基質纖維化,形成角膜瘢痕會降低角膜透明度,影響視力[2-3]。角膜混濁或角膜瘢痕引起的視力障礙是全球致盲的主要原因,影響超過1 000萬人[4]。目前,臨床上角膜移植手術是角膜瘢痕患者恢復角膜功能和視力的主要治療手段,但其效果因角膜供體資源短缺、手術技巧要求和術后移植排斥風險存在限制[5]。角膜基質占角膜厚度的90%,由基質細胞和細胞外基質(extracellular matrix, ECM)組成[6]。角膜基質細胞可分泌膠原蛋白、蛋白多糖和基質金屬蛋白酶(matrix metalloproteinase, MMP)等,具有合成、組裝ECM和防御的功能[7]。ECM由蛋白聚糖和膠原纖維組成,具有維持角膜形狀、硬度和透明度的功能。蛋白聚糖調節膠原纖維形成和排列,膠原纖維規則排列產生最小的光散射從而維持透明度[8]。角膜基質細胞及ECM結構和功能正常是維持角膜透明度的必要條件。因此,深入研究角膜基質損傷修復的機制對于維持角膜透明度具有重要意義,本文就角膜基質損傷修復的機制及其調控因素進行綜述。

1 角膜基質損傷修復的機制

角膜基質修復是一個復雜而有序的過程,涉及細胞凋亡、增殖、分化和遷移,細胞因子分泌和分子信號傳導等相互作用。角膜基質受損后,生長因子激活角膜肌成纖維細胞(corneal myofibroblast, CMF)形成,ECM與膠原蛋白相互作用促進基質重塑,免疫細胞遷移至損失部位驅動角膜基質修復[1]。嚴重角膜損傷后,角膜上皮基底膜(epithelial basement membrane, EBM)不完全再生,肌成纖維細胞持續存在引起基質纖維化,角膜透明度下降[9]。

1.1 角膜基質細胞表型轉變上皮-基質、基質-基質的相互作用促進基質細胞表型改變,對基質傷口愈合發揮關鍵作用。基質細胞凋亡是基質修復的始動環節。受損的角膜上皮細胞分泌白細胞介素1(interleukin 1, IL-1)、腫瘤壞死因子α(tumor necrosis factor α, TNF-α)、轉化生長因子β(transforming growth factor β, TGF-β)等細胞因子進入角膜基質[1]。損傷區IL-1水平升高,激活Fas/Fas配體系統引起基質細胞迅速凋亡,鄰近基質細胞增殖、遷移并填補傷口[10]。基質細胞活化標志基質進入修復階段。TGF-β、血小板衍生生長因子(platelet derived growth factor, PDGF)刺激基質細胞活化形成成纖維細胞,并向受損區遷移、取代凋亡細胞和分泌MMP和膠原蛋白酶參與ECM合成和降解,細胞內角膜晶狀體蛋白和硫酸角質素蛋白聚糖表達降低從而引起角膜混濁[11]。角膜成纖維細胞分化為CMF是基質重塑的關鍵途徑。TGF-β刺激成纖維細胞分化形成CMF,特異性表達平滑肌肌動蛋白α(alpha-smooth muscle actin, α-SMA),收縮傷口、分泌ECM、使周圍基質具有黏附能力[12]。CMF大部分來源于成纖維細胞,部分由巨噬細胞、中性粒細胞、淋巴細胞等骨髓衍生細胞(bone marrow derived cells, BMDC)發育而來,IL-1和TNF-α刺激BMDC從角膜緣血管進入角膜基質,TGF-β誘導其轉化為CMF[13]。隨著角膜EBM再生,上皮細胞分泌的TGF-β進入基質減少,CMF凋亡,基質完成修復和再生[14]。當CMF過度發育,分泌大量無序的ECM沉積在基質中,基質纖維化形成角膜瘢痕[15]。

1.2ECM重塑ECM重塑是恢復角膜透明度的重要過程。角膜基質細胞凋亡、炎癥因子和纖維化因子分泌(IL-1、TNF-α、單核細胞趨化因子1)、非基質成分的細胞暫時出現(中性粒細胞、巨噬細胞、CMF)和細胞活化產生ECM降解酶等共同參與ECM重塑[16]。角膜基質損傷后,成纖維細胞分泌膠原蛋白酶,參與ECM降解;CMF分泌纖維黏連蛋白、蛋白聚糖和透明質酸組成臨時基質,參與ECM合成和組裝[1]。同時,蛋白聚糖調節膠原纖維生長并促進ECM組裝[17]。此外,ECM合成和組裝過程中可形成異常蛋白質,如Ⅲ、Ⅷ、XⅣ和XⅧ型膠原蛋白、Ⅳ型膠原蛋白角膜緣亞型、胚胎纖連蛋白亞型、血小板反應蛋白1、肌腱蛋白C和原纖維蛋白1等,這些蛋白在正常成人角膜基質中很少或基本不存在[16,18]。嚴重損傷后,由于ECM蛋白代謝和更新緩慢,異常蛋白長期沉積在基質中,形成角膜瘢痕、降低角膜透明度從而影響視力[19]。

1.3 免疫細胞遷移免疫細胞的遷移參與角膜基質修復。中性粒細胞是免疫反應發生的效應細胞,肥大細胞、巨噬細胞、γδT淋巴細胞、朗格漢斯細胞等免疫細胞發揮固有免疫的作用[20]。上皮細胞釋放細胞因子激活樹突狀細胞,吸引中性粒細胞和γδT淋巴細胞向傷口部位遷移[21]。角膜損傷早期,角膜緣中的肥大細胞脫顆粒,分泌細胞因子、趨化因子和生長因子促進炎癥,如趨化因子2引起中性粒細胞募集[22-23]。角膜成纖維細胞分泌單核細胞趨化因子1刺激角膜緣或循環中免疫細胞遷向基質損傷區遷移,清除凋亡的基質細胞[24]。此外,巨噬細胞在角膜修復和再生發揮重要作用。基質修復早期,巨噬細胞激活分泌IL-1β、TNF-α,引起基質炎癥。基質修復后期,中性粒細胞募集激活巨噬細胞遷移進入損傷區,分泌MMP2促進角膜修復[25]。基質損傷刺激BMDC進入角膜基質轉化成CMF,當巨噬細胞的耗竭會引起CMF減少,影響基質傷口愈合[13,26]。隨著基質修復和傷口愈合,免疫炎癥細胞逐漸減少,當免疫細胞持續浸潤,角膜基質纖維化從而引起角膜混濁。

2 角膜損傷因素對角膜基質損傷修復的調控

2.1 創傷外傷、手術導致的創口的形態和損傷程度影響基質修復。外傷產生平行與角膜表面的傷口一般形成細小瘢痕,引起CMF的修復和基底膜的再生,經過1a或更多的時間可完全修復。而垂直與角膜表面的傷口或裂開的傷口會引起膠原蛋白和蛋白聚糖沉積,形成的瘢痕可能存在多年[18]。角膜屈光手術包括準分子激光屈光性角膜切削術(photorefractive keratectomy, PRK)、準分子激光角膜原位磨鑲術(laserinsitukeratomileusis, LASIK)、飛秒激光小切口角膜基質透鏡取出術(small incision lenticule extraction, SMILE)等,術后可出現不同程度的角膜混濁,這與手術對角膜損傷的程度有關。PRK去除中央角膜上皮,術后角膜混濁的消退與EBM再生和上皮愈合有關[27]。Marino等[28]研究發現隨著PRK切口處EBM完全再生,兔角膜術后出現的霧狀混濁逐漸消退。當角膜上皮持續性缺損可引起CMF持續發育導致角膜混濁,因此臨床上PRK術后10d內應積極促進上皮愈合,防止角膜瘢痕形成[29]。LASIK對角膜基質的損傷相對PRK較小,術后出現的圓周形角膜混濁主要由于皮瓣邊緣創口相鄰的基質細胞凋亡,成纖維細胞形成、遷移到切口處并進一步轉化成CMF而形成的[30]。SMILE保留了上皮和EBM以避免對基質和EBM的損傷,從而減輕基質炎癥更少,降低術后出現角膜混濁風險[27]。Luft等[31]研究顯示與LASIK相比,SMILE術后人角膜細胞凋亡和免疫細胞浸潤的情況減輕。因此,創傷、手術通過改變角膜結構的程度不同影響角膜基質修復和再生。

2.2 眼化學傷眼化學傷引起角膜混濁和瘢痕是常見的致盲原因。化學物質一定程度上影響基質重塑,主要與角膜的損傷和引起的炎癥相關。化學物質毒性大,可造成角膜各層組織不同程度急性損傷,并引起炎癥細胞浸潤,IL-1、TNF-α等炎癥因子大量釋放[1,32]。上皮和基底膜缺損、基質水腫、ECM破壞等因素可導致CMF持續存在,引起基質纖維化。酸性物質導致細胞和基質蛋白凝固限制進一步滲透,而堿性物質可造成蛋白水解,穿透性強,對全層組織均可破壞[33]。眼化學傷后的預后取決于化學物質的性質、接觸時間和早期治療,臨床上應積極控制炎癥、促進角膜傷口愈合以預防角膜瘢痕等并發癥的發生。

2.3 感染角膜感染是發達國家和發展中國家主要致盲原因。細菌、真菌或病毒等病原體的感染可造成角膜潰瘍,產生不同程度的角膜瘢痕影響視力。角膜結構的恢復和對病原體的免疫反應是影響基質損傷修復的主要因素。微生物感染時先天性免疫系統激活產生炎癥,引起中性粒細胞、巨噬細胞等遷移,產生IL-1、IL-6和TNF-α等炎癥因子,對抗入侵的病原體發揮防御作用[21]。當炎癥持續存在,角膜傷口愈合延遲、免疫細胞浸潤、大量炎癥因子釋放可刺激CMF不斷合成ECM,導致角膜基質纖維化[34]。因此,及時有效的抗感染、抗炎和促進傷口愈合的治療是角膜感染的主要原則,有助于減輕角膜混濁程度。

3 角膜結構因素對角膜基質損傷修復的調控

3.1 上皮層角膜上皮位于角膜最外層,由表層細胞、翼狀細胞和基底細胞組成。角膜上皮可以分泌細胞因子參與基質再生和修復。受損后,上皮細胞分泌IL-1、TGF-β和MMP等進入基質[1]。分泌的TGF-β促進CMF發育和成熟,是調節基質修復的重要細胞因子。IL-1可以激活Fas/Fas配體細胞引起基質細胞凋亡、驅動BMDC向損傷區遷移并進一步分化形成CMF、促進中性粒細胞等分泌MMP作用于損傷,從而影響基質修復[10,35]。Kobayashi等[36]將角膜上皮細胞與成纖維細胞共培養,發現角膜上皮細胞促進角膜成纖維細胞中生長因子表達增加。此外,角膜上皮缺損是影響EBM再生和基質修復的重要原因[37-38]。角膜上皮缺損會引起EBM與上皮間錨定異常,從而影響EBM功能[35]。層黏連蛋白是EBM的主要成分,持續性上皮缺損會引起上皮細胞分泌層黏連蛋白不足,引起EBM不完全再生[39]。于睿等[40]使用角膜準分子激光切除兔角膜上皮,術后4wk出現明顯的角膜霧狀混濁,術后使用雷帕霉素可通過促進自噬抑制角膜混濁的形成。因此,角膜上皮完整性的恢復是角膜基質創口愈合的重要影響因素。

3.2 基底膜基底膜是細胞與基質之間高度特化的ECM,角膜中存在EBM和后彈力層(descemet’s basement membrane, DBM)兩種基底膜。基底膜的完整性是影響基質傷口愈合的重要因素。基底膜由層黏連蛋白、Ⅳ型膠原蛋白、硫酸乙酰肝素蛋白多糖(heparin sulfate proteoglycans, HSPG)和巢蛋白組成,EBM分隔上皮與基質,DBM分隔基質與內皮。基底膜可以結合TGF-β、PDGF等生長因子,調節其生物利用度[41-42]。物理或化學因素引起角膜EBM或DBM受損,TGF-β進入基質刺激CMF形成[42]。Wilson等研究發現小鼠角膜屈光切除術后1mo EBM開始再生,角膜混濁減輕,術后4mo EBM完全再生,角膜透明度恢復[28]。DBM再生速度較EBM慢一些,DBM內皮切除術后6mo才完全再生,中央角膜恢復透明[43]。EBM完全再生限制TGF-β進入基質,CMF凋亡,正常基質細胞填補損傷區,角膜基質愈合。當EBM或DBM缺陷或不完全再生,CMF持續存在引起角膜基質纖維化[44]。基底膜蛋白多糖是EBM中主要的HSPG。de Oliveira等[45]研究發現嚴重損傷后再生的EBM中缺乏基底膜多糖,CMF數量增多,角膜混濁消退的時間延長。因此,促進EBM和DBM再生是恢復角膜基質透明度的重要途徑。

3.3 基質層角膜基質層有基質細胞和ECM組成。各種損傷刺激角膜基質中TGF-β、PDGF上調,促進角膜基質細胞或BMDC轉化形成CMF[13]。CMF是影響角膜基質修復的關鍵因素。CMF是特殊的成纖維細胞,具有平滑肌的結構和特征,細胞內存在應力纖維,可對外界刺激產生收縮反應[46]。CMF具有收縮性,細胞內a-SMA表達增加,收縮傷口,促進基質愈合。同時,CMF可分泌ECM成分。當CMF持續存在,大量、無序的ECM過度沉積,導致角膜透明度下降[47-48]。既往研究顯示角膜屈光手術術后應用0.02%絲裂霉素C,抑制角膜基質細胞、成纖維細胞和BMDC增殖,從而減少CMF的生成,有助于治療角膜混濁[49-50]。氯沙坦是一種抗纖維化藥物,最近研究發現堿燒傷小鼠角膜局部應用氯沙坦,淺基質中TGF-β和Ⅳ型膠原蛋白減少,CMF數量減少[51]。因此,抑制基質層中CMF數量的研究有助于發現更多抑制角膜基質纖維化,從而預防角膜瘢痕的調節劑。

基質層中還存在少量角膜基質干細胞(corneal stromal stem cells,CSSCs),是促進基質修復和再生的潛在治療工具。CSSCs是位于角膜緣處,靠近EBM的基質中具有分化為基質細胞潛能的間充質干細胞,具有干細胞分化潛能、調節角膜基質炎癥和纖維化的功能[52]。Hertsenberg等[53]對小鼠混濁的角膜注射CSSCs,發現CSSCs抑制中性粒細胞向基質損傷區遷移,纖維化相關蛋白α-SMA、Ⅲ型膠原蛋白和肌腱蛋白C減少。Jhanji等[54]研究顯示與單一注射CSSCs治療相比,CSSCs和角膜基質細胞聯合治療更有效促進基質再生,減輕角膜瘢痕。CSSCs具有免疫赦免的作用,Bray等[55]發現人和兔的CSSCs共培養可通過抑制T細胞增殖抑制免疫反應。因此,CSSCs可通過向基質細胞分化和抑制炎癥反應來促進角膜基質修復,有希望替代傳統角膜移植成為治療角膜瘢痕、預防移植術后免疫排斥的細胞療法。

3.4 內皮層角膜內皮由一層內皮細胞組成,位于角膜的最內層,通過鈉鉀泵將基質中的水分移到內皮從而調節基質的透明度。內皮細胞數量或功能異常可引起角膜基質水腫增厚從而降低角膜透明度。此外,TGF-β促進內皮細胞發生內皮間質轉化引起內皮纖維化從而降低角膜透明度[56]。當內皮細胞受到損傷后,內皮細胞Fas配體激活,擴散到基質層中與基質細胞膜表面Fas結合引起基質細胞凋亡。損傷的內皮細胞可釋放IL-1進入基質。Medeiros等[57]研究顯示內皮細胞機械損傷可促進基質層中基質細胞凋亡。既往研究顯示內皮細胞可調節基質的透明度和細胞凋亡,但是否調控CMF的發生和發展和炎癥反應尚不清楚,有待研究者進一步研究。

4 分子因素對角膜基質損傷修復的調控

4.1 小分子亮氨酸重復蛋白聚糖小分子亮氨酸重復蛋白聚糖(small leucine rich proteoglycans,SLRPs)是角膜基質中核心蛋白由富含亮氨酸重復序列組成的蛋白聚糖,分為Ⅰ型SLRPs(decorin、biglycan)、Ⅱ型SLPRs(lumican、keratocan和fibromodulin)、Ⅲ型SLRPs(osteoglycin)[58]。SLRPs調節膠原纖維的直徑和間距,從而調控膠原纖維形成、組裝和排列,參與ECM組裝[59]。此外,損傷角膜中SLRPs結合生長因子、趨化因子、細胞因子,從而調節基質重塑、炎癥和免疫反應,參與角膜基質修復[60]。既往研究表明decorin基因過表達可調節膠原纖維形成、抑制TGF-β介導的CMF形成,促進角膜基質愈合和減輕纖維化[61]。Hayashi等[62]研究發現lumican基因敲除小鼠角膜基質損傷區中性粒細胞浸潤減少,膠原纖維結構紊亂,角膜透明度下降。近年來,Chouhan等[63]開發了一種含有decorin的凝膠滴眼液,可持續釋放decorin發揮抗角膜瘢痕作用。SLRPs通過影響ECM的形成調節角膜基質修復,是抑制角膜基質纖維化的潛在分子靶點。

4.2TGF-β TGF-β是一種調節角膜基質再生和纖維化過程的細胞因子,通常存在健康的角膜上皮和淚液中,可分為TGF-β1、2、3三種同工型。TGF-β1、2是調節角膜基質修復和纖維化的主要介質[64],TGF-β1、2水平升高誘導CMF發育和成熟,促進基質傷口收縮,過度表達時可引起角膜基質纖維化的發生和發展[65]。同時,TGF-β可促進角膜成纖維細胞產生Ⅳ型膠原纖維,而生成膠原纖維可競爭性結合TGF-β受體,負反饋調節TGF-β水平[66]。TGFβ-3主要發揮抗纖維化作用,Weng等[67]發現CSSCs中TGF-β3水平上調,將CSSCs移植到小鼠損傷的角膜上可抑制角膜瘢痕形成。此外,基質內TGF-β可通過激活TGF-β/Smad信號通路調節細胞增殖、遷移和分化。Gupta等[68]通過基因治療降低PRK術后兔子角膜Smad7水平,抑制TGF-β/Smad7信號通路,角膜纖維化水平顯著減輕。TGF-β影響CMF形成和角膜成纖維細胞,抑制其表達及其信號傳導可作為治療角膜瘢痕和促進角膜基質再生的有效策略。

4.3 離子通道角膜受到外界刺激可引起特定離子通道激活,調節TGF-β的信號通路及細胞內信號傳導影響角膜基質修復。瞬時受體電位通道(transient receptor potential channel,TRP)是一類對溫度、機械、化學等刺激敏感的膜離子通道,其亞型TRPV1和TRPV4可調節角膜基質炎癥和纖維化[69]。Okada等[70]研究發現TRPV1基因敲除小鼠堿燒傷角膜通過下調IL-6、單核細胞趨化因子1和TGF-β1,抑制中性粒細胞、巨噬細胞的浸潤和角膜基質纖維化。TRPV1參與TGF-β誘導基質纖維化,既往研究認為TGF-β刺激活性氧生成,促進成纖維細胞內TRPV1的表達,TRPV1進一步通過增加細胞Ca2+內流、激活p38/MAPK/Smad信號通路,促進CMF形成[71]。此外,TRPV4的激活也參與角膜基質纖維化,TRPV4基因敲除和使用TRPV4拮抗劑可減少小鼠堿燒傷角膜基質內中性粒細胞、巨噬細胞和CMF的數量[72]。KCa3.1是Ca2+激活離子通道,Fuchs等[73]使用一種含有KCa3.1拮抗劑TRAM-34和抗壞血酸的新型滴眼液,發現可抑制堿燒傷角膜中TGF-β誘導的基質纖維化反應。離子通道的激活可通過細胞內信號傳導調節基質纖維化和炎癥反應,TRPV1、TRPV4和KCa3.1離子通道是治療角膜瘢痕的潛在藥物靶點。

4.4 細胞外囊泡細胞外囊泡(extracellular vesicles,EVs)是由細胞分泌的囊泡,細胞膜內陷選擇性包含蛋白質、脂質、核酸和轉錄因子等多種生物分子形成EVs,通過細胞間通訊調控信號通路和基因表達[74]。角膜上皮和基質通過EVs相互作用,調節基質修復和纖維化過程[75-76]。McKay等[77]從角膜上皮細胞分離出EVs與角膜成纖維細胞共培養,發現α-SMA表達增加,EVs中纖連蛋白、血小板反應蛋白和層黏連蛋白促進CMF形成。CSSCs促進角膜基質再生,其修復作用可能與CSSCs分泌EVs傳遞miRNA相關。既往研究從CSSCs中提取出EVs應用于小鼠堿燒傷角膜,中性粒細胞浸潤減少,Ⅲ型膠原蛋白和α-SMA表達下調,體內實驗表明EVs中miRNA 29a和miRNA 381抑制脂多糖誘導巨噬細胞的炎癥和TGF-β誘導的纖維化反應[78-79]。姚克團隊開發了一種含有間充質干細胞分泌EVs的水凝膠,EVs內miRNA 432-5p抑制膠原蛋白表達,減少ECM沉積,促進基質修復[80]。EVs具有脂質雙層結構,直徑小、易穿過血腦屏障,可作為藥物運輸載體或聯合干細胞治療促進角膜修復,在角膜再生醫學中具有研究前景。

5 小結

角膜基質是影響角膜透明度的重要結構,受到各種疾病和創傷損傷后形成的角膜瘢痕是全球范圍內主要致盲原因。角膜基質修復的病理生理過程包括基質細胞表型轉變、ECM重塑和免疫細胞遷移,其過程可受到角膜損傷因素、角膜結構因素和分子因素的調控。外傷、手術、眼化學傷和感染等損傷因素主要改變角膜的結構和引起炎癥影響角膜基質再生。角膜上皮細胞、基底膜、基質細胞、基質干細胞和內皮細胞等角膜結構參與角膜基質修復的發生和發展過程。SLRPs、TGF-β、離子通道和EVs等分子因素通過信號傳導和細胞通訊調控角膜基質傷口愈合。研究角膜基質修復的機制及其調控因素對促進角膜基質再生和治療角膜瘢痕具有重要意義。臨床上可根據角膜損傷因素不同,針對性促進角膜傷口愈合和抑制炎癥反應治療疾病,從而預防晚期角膜瘢痕的發生。探究角膜結構和分子因素對角膜基質的調控作用可為促進角膜基質再生和抑制角膜基質纖維化提供新途徑,幫助發現潛在治療藥物。角膜基質修復是一個復雜的級聯反應,是否存在其他潛在的促進基質修復和抗纖維化的細胞和分子靶點,以及如何基于調控機制開發新型藥物應用于臨床有待進一步研究。