納米抗體及其在獸醫(yī)領(lǐng)域的研究現(xiàn)狀

胡湘云,曹艷紅,呂玲燕,劉 征,黃發(fā)才,吳柱月,肖正中

(廣西農(nóng)業(yè)職業(yè)技術(shù)大學(xué) 廣西家畜遺傳改良重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室,南寧 530007)

20世紀(jì)90年代,科學(xué)家先后在駱駝和鯊魚體內(nèi)發(fā)現(xiàn)了一種獨(dú)特的抗體,它們天然缺失輕鏈和重鏈第一恒定區(qū)(constant region 1,CH1),故將其命名為重鏈抗體(heavy chain antibodies,HCAbs)[1-2]。后續(xù)研究發(fā)現(xiàn),重鏈抗體的重鏈可變區(qū)(variable domain of heavy chain of heavy-chain antibody,VHH)是HCAbs結(jié)合抗原的主要功能域,克隆此結(jié)構(gòu)域后所形成的VHH是具有完整抗體功能特性的最小抗體,其大小可達(dá)到納米級,所以也稱之為納米抗體(nanobodies,Nb)。特殊的結(jié)構(gòu)賦予其優(yōu)越的抗原結(jié)合力、穩(wěn)定性、組織穿透力等性能,隨著Nb在獸醫(yī)領(lǐng)域研究的逐步深入,也逐漸展現(xiàn)出優(yōu)秀的應(yīng)用前景。本文重點(diǎn)對Nb的結(jié)構(gòu)、特性、篩選與表達(dá)策略以及在獸醫(yī)領(lǐng)域的研究現(xiàn)狀進(jìn)行綜述,分析其在動物疫病防控、動物產(chǎn)品檢驗(yàn)等方面的應(yīng)用前景和發(fā)展方向,以期對深化和推廣Nb在獸醫(yī)領(lǐng)域的應(yīng)用提供參考。

1 納米抗體的結(jié)構(gòu)

Nb晶體為橢圓形,由3個互補(bǔ)決定區(qū)(complementarity-determining region,CDR)和位于其兩側(cè)的4個骨架區(qū)(framework region,FR)構(gòu)成,大小為2.5 nm×4 nm,分子量為12～15 ku。傳統(tǒng)抗體、HCAbs和Nb的結(jié)構(gòu)示意見圖1,傳統(tǒng)抗體重鏈可變區(qū)(variable region of the heavy chain of conventional antibodies,VH)和VHH的結(jié)構(gòu)示意見圖2。

圖1 各類抗體結(jié)構(gòu)示意圖

圖2 VH、VHH結(jié)構(gòu)示意圖

1.1 CDR結(jié)構(gòu)域

VHH的CDR1和CDR3普遍比VH更長,VHH CDR3平均長度有16～18個氨基酸,而VH僅為9～13個氨基酸,VHH長CDR3區(qū)形成一個大的指狀凸環(huán)結(jié)構(gòu)嵌入抗原分子的裂隙,增加與抗原接觸面積,使VHH具有更強(qiáng)的抗原結(jié)合能力[3]。此外,其 CDR1、CDR3區(qū)存在一個半胱胺酸殘基形成的額外二硫鍵,呈現(xiàn)凸環(huán)結(jié)構(gòu)以固定CDR3區(qū),該結(jié)構(gòu)也可以結(jié)合抗原結(jié)構(gòu)中的裂隙,增加VHH識別表位的多樣性[4]。

1.2 FR2結(jié)構(gòu)域

VH FR2區(qū)高度保守的疏水氨基酸Val37、Gly44、Leu45和Trp47參與和輕鏈的相互作用,而VHH為適應(yīng)缺失輕鏈,使用更親水的氨基酸Phe或Tyr37、Glu44、Arg45和Gly47替代,且部分FR2被CDR3形成的凸環(huán)所覆蓋,這顯著增加了VHH的親水性和穩(wěn)定性[5]。

2 納米抗體的理化特性

納米抗體特殊的結(jié)構(gòu)賦予了其優(yōu)于傳統(tǒng)抗體的諸多優(yōu)良理化特性,突破了傳統(tǒng)抗體免疫原性高、生產(chǎn)成本較高、組織穿透力弱、穩(wěn)定性低等瓶頸。

2.1 低免疫原性

免疫原性與分子量呈正相關(guān),分子量越大,免疫原性越高,Nb分子量僅為傳統(tǒng)抗體的10%,使其引起體液或細(xì)胞免疫應(yīng)答的幾率大大降低。此外,Nb缺少可結(jié)晶段(fragment crystallizable,Fc)避免了補(bǔ)體反應(yīng),而且在駱駝科動物中編碼Nb的基因與人類VH家族3系和4系基因序列同源性高達(dá)80%,因此Nb對人的免疫原性低,且具有較好的生物相容性,在人類和其他動物試驗(yàn)中,Nb的重復(fù)給藥均未引起機(jī)體體液和細(xì)胞免疫應(yīng)答,目前尚無Nb免疫原性造成不良反應(yīng)的報道[6-8]。

2.2 易于制備與表達(dá)

傳統(tǒng)抗體表達(dá)時容易形成包涵體,Nb因其 FR2區(qū)氨基酸性質(zhì)的改變具有更強(qiáng)的親水性和溶解性,可以在多種表達(dá)系統(tǒng)進(jìn)行高效表達(dá)且產(chǎn)物多為可溶性,也易于利用外源親和標(biāo)簽進(jìn)行純化[9]。這降低了研發(fā)和生產(chǎn)成本,解決了傳統(tǒng)抗體難以低成本規(guī)模化制備的難題。

2.3 高抗原結(jié)合性

雖然Nb遠(yuǎn)小于傳統(tǒng)抗體,但卻擁有與其相當(dāng)?shù)目乖Y(jié)合活性,這得益于Nb長CDR3區(qū)形成凸環(huán)結(jié)構(gòu)能識別傳統(tǒng)抗體無法到達(dá)的靶抗原內(nèi)部、深處狹小裂隙處,可以結(jié)合半抗原、酶活性位點(diǎn),具有廣泛抗原結(jié)合能力,并有助于發(fā)現(xiàn)傳統(tǒng)抗體無法識別的藥物新靶點(diǎn)[10-11]。

2.4 組織穿透性強(qiáng)

Nb憑借體積小、分子量小的優(yōu)勢,擁有更強(qiáng)的組織穿透能力,能到達(dá)傳統(tǒng)抗體不可及的病灶組織,如實(shí)體瘤;還能穿透血腦屏障為腦部給藥,為大腦疾病研究提供新途徑;同時易被腎組織快速濾過,避免腎毒性;在血液中清除速度快且半衰期短,當(dāng)Nb進(jìn)入組織時,多余未結(jié)合的Nb能快速被清除,可結(jié)合成像技術(shù)用于體內(nèi)疾病的無創(chuàng)傷診斷[12]。

2.5 高穩(wěn)定性

Nb內(nèi)部的二硫鍵使其具有耐熱性和蛋白水解抗性。溫度高于65 ℃會令常規(guī)抗體喪失變性后的可逆性(復(fù)性作用),失去抗體原有功能;而Nb具備高溫耐受性,在90 ℃高溫下?lián)碛锌赡娴娜フ郫B能力,在37 ℃孵育1周后有80%結(jié)合抗原能力[13]。利用Nb在室溫下長期儲存仍能保有活性的特點(diǎn),有望解決傳統(tǒng)抗體需冷鏈運(yùn)輸和儲存的難題。而Nb在非生理條件pH、蛋白酶、離液劑環(huán)境仍能保持穩(wěn)定構(gòu)象[14]。這表明Nb可以實(shí)現(xiàn)口服或霧化方式給藥,在治療動物胃腸道和呼吸道疫病上具有良好應(yīng)用前景。

2.6 易于基因工程改造

Nb為單域結(jié)構(gòu),基因序列簡單,可作為一種理想的構(gòu)建單元,根據(jù)不同的需求構(gòu)建多價、多特異性或融合性Nb(與牛血清白蛋白、IgG-Fc、放射性同位素等結(jié)合),并增強(qiáng)其對目標(biāo)的特異性和功能性。

3 納米抗體的篩選與表達(dá)

根據(jù)不同試驗(yàn)?zāi)康倪x擇相應(yīng)文庫技術(shù)進(jìn)行建庫和Nb靶向篩選,再選擇適宜的表達(dá)系統(tǒng)表達(dá),使得Nb的制備正逐漸成為一個技術(shù)成熟、高效、成本可控的標(biāo)準(zhǔn)化過程。

3.1 納米抗體文庫的類型

根據(jù)獲得的Nb基因來源分為免疫、天然和合成Nb文庫,其在建庫方法、庫容量和特點(diǎn)上存在差異,Nb文庫的類型和特點(diǎn)如表1所示。

表1 納米抗體文庫的類型和特點(diǎn)

3.2 納米抗體的篩選策略

主要利用噬菌體展示、酵母展示、酵母雙雜交、核糖體展示和高通量測序等技術(shù)篩選Nb,其中噬菌體展示技術(shù)是應(yīng)用最廣泛的體外Nb篩選技術(shù)。噬菌體展示技術(shù)通過將抗體基因序列插入噬菌體外殼蛋白結(jié)構(gòu)基因中,使抗體與噬菌體外殼蛋白形成融合蛋白,并隨著子代噬菌體的重新組裝展示在噬菌體表面,實(shí)現(xiàn)表型與基因型的統(tǒng)一[17]。

3.3 納米抗體的表達(dá)策略

與傳統(tǒng)單克隆抗體需要進(jìn)行繁瑣的細(xì)胞培養(yǎng)相比,Nb的優(yōu)勢在于可以在原核宿主(大腸桿菌系統(tǒng))、真核宿主(酵母、真菌、昆蟲細(xì)胞、哺乳動物細(xì)胞)及植物宿主(植物細(xì)胞)中表達(dá)。大腸桿菌表達(dá)系統(tǒng)是最常用的表達(dá)平臺,其操作簡便、生產(chǎn)成本低,但存在部分表達(dá)產(chǎn)物會形成包涵體、缺乏翻譯后修飾、胞內(nèi)形式不利于二硫鍵形成等缺點(diǎn);酵母表達(dá)系統(tǒng)可以產(chǎn)生高水平的Nb,其胞外氧化環(huán)境有利于對抗體進(jìn)行翻譯后折疊、修飾和分泌,促進(jìn)二硫鍵的形成,但可能存在過度糖基化的問題;植物表達(dá)系統(tǒng)具有低成本和安全性,并且能夠進(jìn)行翻譯后修飾,常使用本氏煙草葉和擬南芥種子進(jìn)行高效表達(dá)[18]。

4 納米抗體在動物疫病防控的應(yīng)用

多克隆抗體和單克隆抗體已經(jīng)在動物疫病防控上得到廣泛應(yīng)用,但這兩種抗體均各有局限性。如上所述,Nb具有多種優(yōu)于傳統(tǒng)抗體的優(yōu)良特性,使其成為傳統(tǒng)抗體的有力補(bǔ)充,有望成為新的防控動物疫病的有效手段。

4.1 用于動物疫病的預(yù)防

防控動物疫病的關(guān)鍵在于控制傳染源、切斷傳播途徑和保護(hù)易感動物,Nb在被動免疫、構(gòu)建疫苗載體、監(jiān)測疫苗質(zhì)量上極具發(fā)展?jié)摿Α?/p>

4.1.1 被動免疫 被動免疫是提前給易感動物注射抗體以起到免疫保護(hù)作用,Nb與IgG或IgA的Fc融合能預(yù)防動物疫病[19]。例如將產(chǎn)腸毒素大腸桿菌(EnterotoxigenicEscherichiacoli,ETEC)的Nb與球蛋白IgA的Fc融合,并在擬南芥和畢赤酵母中大規(guī)模生產(chǎn),制備成口服飼料對仔豬被動免疫,可以有效抑制菌毛黏附,防止仔豬感染ETEC[20-21]。再如將針對鞭毛和外膜蛋白的抗彎曲桿菌Nb融合到雞IgA和IgY的恒定結(jié)構(gòu)域,在本氏煙草葉子和擬南芥種子中表達(dá),可以抑制彎曲桿菌的定植,未來可以將Nb制備成飼料添加劑預(yù)防彎曲桿菌[22]。

4.1.2 構(gòu)建疫苗載體 針對黏膜表面受體的疫苗可以有效誘導(dǎo)腸道病原體黏膜免疫反應(yīng),但口服遞送的亞單位疫苗在腸上皮細(xì)胞存在吸收不良、運(yùn)輸效率低下和免疫反應(yīng)較弱的問題,成為黏膜疫苗接種的重要瓶頸。制備靶向豬氨肽酶N (porcine aminopeptidase N,pAPN)的Nb與鼠IgG2a的Fc融合形成二價融合蛋白,給豬只口服后在豬腸道上皮細(xì)胞中顯示體內(nèi)內(nèi)化,能夠引發(fā)全身和黏膜抗體反應(yīng)[23]。證明了Nb作為腸道病原體疫苗抗原遞送載體的巨大潛力。

4.1.3 監(jiān)測疫苗質(zhì)量 Nb具有高抗原結(jié)合能力,能精準(zhǔn)識別蛋白質(zhì)表面裂隙、蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)域和亞基,可以用于監(jiān)測蛋白質(zhì)構(gòu)象。蛋白質(zhì)納米粒子構(gòu)象狀態(tài)分析是疫苗質(zhì)量控制的關(guān)鍵步驟,布魯菌LS蛋白(Brucellalumazine synthase,BLS)是通用疫苗載體,將僅識別BLS天然構(gòu)象的Nb作為分子探針,可以在基于BLS平臺的疫苗制備過程中監(jiān)測疫苗質(zhì)量[24]。再如,FMD疫苗的功效主要取決于完整病毒粒子(146 S)的含量,在疫苗制造、配制和儲存過程中,146 S可能分解成12 S亞基,降低了疫苗效力,通過篩選能廣泛識別146 S的Nb,制備雙抗體夾心ELISA(double antibody sandwich ELISA,DAS-ELISA)進(jìn)行抗原定量,可以監(jiān)測疫苗完整衣殼的數(shù)量和穩(wěn)定性,從而評估疫苗質(zhì)量[25]。

4.2 用于動物疫病的診斷

早期、快速、正確的診斷對于動物疫病防控至關(guān)重要,臨床上各種動物病原體混合感染或繼發(fā)感染的情況已成常態(tài),目前動物重要疫病的診斷技術(shù)已經(jīng)比較豐富,然而還存在操作復(fù)雜、便利性差等缺點(diǎn)。

4.2.1 ELISA檢測 在生產(chǎn)診斷中,目前使用常規(guī)抗體制備的ELISA檢測試劑需要冷鏈運(yùn)輸和儲存,不利于臨床診斷,而Nb的高穩(wěn)定性則有望改變這一局面,基于辣根過氧化物酶、生物素等標(biāo)記Nb建立的酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)(enzyme linked immunosorbent assay,ELISA),在豬、禽、牛等動物病毒病的診斷上已取得較大進(jìn)展(表2)。

表2 基于納米抗體的ELISA檢測方法

4.2.2 體內(nèi)定位和成像 Nb對分子靶標(biāo)的穩(wěn)定性、親和力和特異性高,靶向性和穿透性強(qiáng),在腎組織能被快速清除,具有構(gòu)建不同形式(放射性核素、磁性離子、量子點(diǎn)標(biāo)記)抗體的靈活性,可以作為良好的靶向示蹤分子應(yīng)用于體內(nèi)定位和成像。通過從免疫Nb文庫中獲得靶向O型口蹄疫病毒(foot and mouth disease virus,FMDV)的病毒顆粒或豬流行性腹瀉病毒(porcine epidemic diarrhea virus,PEDV)、豬瘟病毒(classical swine fever virus,CSFV)結(jié)構(gòu)蛋白的Nb,與量子點(diǎn)結(jié)合構(gòu)成納米探針,可以在細(xì)胞內(nèi)進(jìn)行病毒示蹤和病毒成像;Nb也可以與超順磁性納米珠共軛,構(gòu)建用于分離病毒的免疫磁性納米珠,可以從臨床樣品中分離病毒或在體外捕獲病毒粒子[40-42]。

4.3 用于動物疫病的治療

抗體在對抗病毒、細(xì)菌等感染方面都能發(fā)揮重要的天然防御作用,其應(yīng)用于動物疫病的治療已有數(shù)十年的歷史,但傳統(tǒng)抗體因尺寸大不易穿透組織影響治療效果、生產(chǎn)步驟繁瑣且成本高限制其發(fā)展。作為傳統(tǒng)抗體的有利替代品,Nb擁有的小尺寸、強(qiáng)抗原結(jié)合能力、組織穿透性強(qiáng)等優(yōu)勢為研發(fā)高效治療方法提供新選擇。

4.3.1 抗病毒治療 Nb是中和抗病毒試劑的主要來源,其通過抑制靶標(biāo)與受體間相互作用治療動物病毒病。筆者分別以新城疫病毒(Newcastle disease virus,NDV)HN蛋白和F潛在中和表位為靶標(biāo),篩選具有良好反應(yīng)活性和中和活性的Nb,其中靶向HN的Nb能識別NDV感染的細(xì)胞[43-44]。Zhang等[45]在畢赤酵母體內(nèi)將靶向豬呼吸與繁殖障礙綜合征病毒(porcine reproductive and respiratory syndrome virus,PRRSV) nsp9的Nb與豬IgG Fc融合表達(dá),之后發(fā)現(xiàn)該嵌合抗體通過內(nèi)吞作用進(jìn)入宿主細(xì)胞體內(nèi)并發(fā)揮抗病毒作用。而將PRRSV nsp9的Nb與細(xì)胞穿膜肽(cell penetrating peptide,CPP)融合表達(dá)也能進(jìn)入宿主細(xì)胞,可以減弱PRRSV感染后引起的癥狀,發(fā)揮抗病毒功能[46]。以上,Nb有望成為治療動物病毒病的新型工具。

4.3.2 抗菌素治療 臨床上使用口服或靜脈注射抗生素治療細(xì)菌病,但抗生素濫用和耐藥菌的出現(xiàn)給細(xì)菌類疾病的治療帶來難題。Nb的特異性和靶向性能夠靶向細(xì)菌表面蛋白,通過拮抗細(xì)菌黏附宿主細(xì)胞等方式治療細(xì)菌感染。炭疽芽胞桿菌(Bacillusanthracis)能引起急性人畜共患細(xì)菌病,篩選靶向其S-層蛋白Sap的Nb經(jīng)表達(dá)純化后通過皮下注射給炭疽病小鼠模型,結(jié)果顯示炭疽芽胞桿菌的增殖被抑制,小鼠模型中的病原菌被清除[47]。這證實(shí)了Nb的抗菌治療能力。

5 納米抗體在動物產(chǎn)品檢驗(yàn)中的應(yīng)用

5.1 檢驗(yàn)食源性病原體

動物源性食品中常存在各類細(xì)菌和真菌毒素,這導(dǎo)致食源性疾病嚴(yán)重影響人類健康,而保障食品安全最重要的措施是建立快速有效的檢測方法。近年來,Nb應(yīng)用于動物產(chǎn)品檢驗(yàn)的研究多有報道,研究人員針對動物產(chǎn)品(牛奶、肉等)中的食源性致病菌,篩選其特異性高、反應(yīng)性好的Nb作為識別元件,并基于抗原抗體特異性反應(yīng)開發(fā)出各類檢驗(yàn)方法,表3列出了用于檢驗(yàn)動物產(chǎn)品中食源性病原體的Nb,這為準(zhǔn)確高效檢測食源性病原體提供了新思路,有助于提高動物產(chǎn)品的質(zhì)量安全水平。

5.2 檢驗(yàn)獸藥殘留

在規(guī)模化和集約化養(yǎng)殖條件下,為追求養(yǎng)殖利益,生產(chǎn)中常用抗生素和殺菌劑來防控動物疫病,用激素和促生長劑來提高動物生長性能和飼料利用效率,這可能會導(dǎo)致動物源性食品中存在藥物殘留,對人類健康造成潛在危害。發(fā)展快速、準(zhǔn)確的獸藥殘留檢驗(yàn)技術(shù)是防范其危害的最后一道防線,而Nb的出現(xiàn)帶來了新技術(shù)力量。

孔雀石綠是一種殺菌劑,曾被廣泛應(yīng)用于水產(chǎn)養(yǎng)殖業(yè),但其進(jìn)入人體后代謝產(chǎn)物具有高殘留和致畸、致癌、致突變等毒性,已被我國列入《食品動物禁用的獸藥及其化合物清單》,但實(shí)際生產(chǎn)上仍存在濫用的現(xiàn)象。目前檢驗(yàn)孔雀石綠的方法為液相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用方法,但其檢測成本高,操作復(fù)雜且耗時長。通過從免疫的孔雀石綠文庫中篩選Nb,以此制備膠體金免疫層析檢測試紙條,其檢測時間僅需15 min,檢測限為0.5 ng·mL-1,判定速度快,靈敏度高[55]。

萊克多巴胺(ractopamine,RAC)是一種苯酚胺類的β-腎上腺素興奮劑,鹽酸克倫特羅(clenbuterol hydrochloride,CL)是一種β2型腎上腺素受體激動劑,兩者均會對人體產(chǎn)生毒副作用,眾多國家都已禁止將兩者用于畜禽養(yǎng)殖。已經(jīng)成功從天然Nb庫中靶向篩選出對RAC、CL反應(yīng)性良好的Nb,這為后續(xù)研發(fā)基于Nb技術(shù)的藥殘檢測方法奠定基礎(chǔ)[56-57]。

6 研究展望

綜上所述,Nb因其特殊結(jié)構(gòu)展現(xiàn)出了低免疫原性、易于制備與表達(dá)、高抗原結(jié)合性、組織穿透性強(qiáng)、高穩(wěn)定性和易于改造等諸多優(yōu)良理化特性,同時其制備技術(shù)成熟、成本可控,有潛力成為替代傳統(tǒng)抗體應(yīng)用于動物疫病預(yù)防、診斷、治療以及動物產(chǎn)品食源性病原體和藥物殘留檢驗(yàn)等領(lǐng)域的優(yōu)秀迭代產(chǎn)品。隨著研究的深入,Nb此前的一些局限性也正在逐步得到修正和彌補(bǔ),例如通過CRISPR-Cas9技術(shù)將駱駝基因轉(zhuǎn)入小鼠,可以獲得能產(chǎn)生Nb的小鼠,解決了駱駝類和鯊魚類等試驗(yàn)動物不易獲得、免疫操作困難等問題,為Nb的建庫提供了新選擇[58];又如通過構(gòu)建多聚化Nb或與Fc融合、聚乙二醇化等方法,可以解決Nb體積和分子質(zhì)量小導(dǎo)致半衰期短,影響治療時效的問題,從而提高其在體內(nèi)的治療效果,但這一做法會增加Nb尺寸,可能會減弱Nb活性,未來要繼續(xù)探索最佳構(gòu)建方案,增加融合Nb在體內(nèi)作用時間和作用效果。

筆者認(rèn)為,Nb在獸醫(yī)領(lǐng)域的應(yīng)用場景廣泛、前景明朗,下一步,一是可以加強(qiáng)Nb與其他新興技術(shù)(生物傳感器、微流控芯片、高通量測序、單顆粒冷凍電鏡技術(shù)等)的協(xié)同研究和應(yīng)用,最大限度發(fā)揮Nb的優(yōu)良特性,并不斷優(yōu)化和彌補(bǔ)其局限性;二是要建立和推廣商用Nb篩選和制備技術(shù),推動Nb應(yīng)用商品化。廣西屬于養(yǎng)豬大省,近年來,豬腸道冠狀病毒病的發(fā)生制約著本地養(yǎng)豬產(chǎn)業(yè)的發(fā)展,筆者團(tuán)隊致力于研發(fā)能實(shí)現(xiàn)豬口服給藥的納米抗體,為新時代獸醫(yī)發(fā)展提質(zhì)增效帶來新動能。