基于網絡藥理學和試驗驗證分析小檗堿治療雞沙門菌感染的作用機制

張旭梅,魏玉榮,許丞惠,楊 彤,史慧君,付 強,楊 莉

(1.新疆農業大學動物醫學學院,烏魯木齊 830052;2.新疆動物疫病研究重點實驗室,烏魯木齊 830013;3.新疆畜牧科學院獸醫研究所,烏魯木齊 830013;4.新疆農業大學畜牧學博士后流動站,烏魯木齊 830052;5.新疆草食動物新藥研究與創制重點實驗室,烏魯木齊 830052)

腸道炎癥性疾病是家禽生長過程中面臨的重要問題,對家禽生長發育有重大影響[1]。沙門菌是引起家禽腸道炎癥主要原因之一,其定植在家禽消化道內并侵襲黏附在腸道宿主細胞內,引起細胞膜皺褶和細菌內化,阻斷宿主分泌的抗炎和抑菌因子的傳遞,進而在腸細胞內的囊泡中增殖,不斷改變腸道形態造成腸絨毛脫落影響腸道功能,最終誘導腸道炎癥[2-3]。近年來,研究發現93%的雞場可檢測出沙門菌,而疾病預防控制中心報告的病例,腸炎沙門菌是引起疾病的主要血清型之一[4-5]。腸炎沙門菌不僅會造成肉雞腸炎性腹瀉、采食量下降、生長速度減緩還會導致雞蛋受污染,嚴重影響了家禽及其副產品的生產。目前,應對沙門菌感染主要以預防控制為主,主要體現在在飼料中添加抗生素。但隨著消費者對食品安全的關注日益增加,各國隨后頒布關于禁止使用抗生素生長促進劑的相關法規,迫使畜牧業急需開發安全有效、提高機體免疫能力、預防疾病和控制食源性病原體的綠色添加劑作為抗生素替代品,也是未來幾年控制食源性致病菌和改善動物腸道健康、推動家禽業向前發展的戰略重點和研究領域[6-7]。

小檗堿(berberine,BBR)又稱黃連素,是中藥黃連中分離出的一種異喹啉類生物堿,在臨床上具有抗腹瀉、抗菌、抗炎[8-9]、抗腫瘤[10]和調節血糖[11]等功效,可用于治療消化、心血管、神經系統等多種疾病[12-13]。研究表明小檗堿可通過抑制細菌和毒素、抑制分泌和蠕動、保護腸上皮屏障等方式改善消化系統疾病,可用于治療消化性潰瘍、胃炎、腸炎等消化系統疾病[14]。目前對于BBR的藥物活性研究主要集中在小鼠或大鼠的疾病模型以及人的臨床治療中,以家禽為研究對象研究其藥物療效的鮮有報道。本課題前期發現BBR可有效緩解家禽腸道炎癥反應,但其作用機制尚不明確[15]。因此,本研究利用網絡藥理學、分子對接和分子模擬等技術初步分析和篩選BBR在治療家禽腸道炎癥中的關鍵作用靶點,后續建立肉雞腸道炎癥模型初步驗證小檗堿治療腸炎的分子作用機制,為小檗堿預防和治療腸炎提供科學依據。

1 材料與方法

1.1 網絡藥理學部分

1.1.1 小檗堿靶點篩選 通過pubchem數據庫(https:∥pubchem.ncbi.nlm.nih.gov/)獲取BBR的3 D結構后利用PharmMapper數據庫(http:∥www.lilac-ecust.can/pharmmaper)和Swisstargets數據庫(http:∥www.swisstargetprediction.ch/)進行靶點預測,篩除重復靶點,并通過uniprot數據庫(http:∥www.uniprot.org/)將預測靶點名稱轉換為基因名。

1.1.2 疾病靶點的預測與篩選 以“ulcerative colitis、enteritis、colitis”為關鍵詞在GeneCards數據庫(http:∥www.genecards.org)中查找腸炎靶點,篩除重復靶點,構建腸炎靶點數據庫。

1.1.3 PPI網絡圖的構建及核心靶點的篩選 使用Venny2.1.0在線工具繪制出藥物和疾病靶點韋恩圖并取交集,將交集靶點錄入String數據庫(http:∥www.string-db.org)中,設置物種“Homo sapiens”,分析結果導入并Cytoscape3.8.2軟件構建蛋白質相互作用(PPI)網絡,對其進行分析,根據度值(degree)篩選核心靶點,degree越大該靶點越核心。

1.1.4 GO與KEGG富集分析 將藥物與疾病的交集靶點導入DAVID生物信息數據庫(http:∥david.abc.ncifcrf.gov/)中進行GO功能與KEGG通路富集。通過微生信在線網站(http:∥www.bioinformatics.com.cn/)進行繪圖。

1.1.5 分子對接及動力學模擬 在PubChem數據庫(http:∥pubchem.ncbi.nlm.nih.gov/)獲取BBR的3 D結構,在PDB數據庫(http:∥www.rcsb.org/)中下載靶點蛋白晶體結構,并利用Protein Preparation Wizard對蛋白質進行去除結晶水、補加氫原子等優化處理。根據SP方法(Standard Precise)進行分子對接,計算結合能,若結合能≤-5 kJ·mol-1,可推測BBR與相應靶點蛋白存在較強的相互作用。使用Desmond版本2020對蛋白與化合物復合物進行分子動力學模擬。

1.2 試驗部分

1.2.1 試驗材料和儀器 腸炎沙門菌(由新疆農業大學蘇戰強教授饋贈);小檗堿(中國食品藥品檢定研究院,編號:110713)。

1.2.2 動物 1日齡三黃雞120只和基礎飼糧均購自天康生物公司。

1.2.3 試驗方法 將120只1日齡的三黃雞(均為公雞),隨機分為4組,每組30只,分別為對照組(C)、BBR給藥組(B)、沙門菌攻毒模型組(S)和BBR治療組(BS)。試驗期間,所有仔雞均處于同一溫度可控的房間內,為避免交叉感染采用物理隔離,每10 d采集4組動物糞樣PCR檢測沙門菌,對照組與給藥組檢測結果均為陰性。1～4日齡,房間溫度保持在34～35 ℃,后續逐漸降至22 ℃,濕度保持在65%～70%。仔雞自由采食與飲水,期間每日對環境進行清潔與消毒,觀察記錄仔雞數量、呼吸、糞便及采食量變化。B組和BS組三黃雞從1日齡開始每日在飼糧中添加120 mg·kg-1BBR,連續給藥21 d;S組和BS組在9日齡時分別連續灌胃3 d 1.2×109CFU·mL-1的沙門菌,C組和B組灌胃等量生理鹽水。

1.2.4 腸道組織病理學檢測 21日齡仔雞經頸椎脫臼處死后,在無菌條件下采取部分盲腸組織沖洗干凈后立即放入液氮罐中保存;用冰PBS沖洗盲腸與十二指腸組織后放入10%甲醛溶液中固定,經包埋,切片后HE染色,光學顯微鏡下觀察并拍照。

1.2.5 qPCR檢測相關基因 利用Trizol法提取各組盲腸組織總RNA,并使用核酸定量儀測定RNA濃度及純度,立即反轉錄或者-80 ℃保存。采用qPCR法檢測各組盲腸組織中HSP90AA1、PPARG、PIK3CA的轉錄量,本研究采用相對定量法,2-ΔΔCt值表示基因相對轉錄量,以β-action為內參。結果用單因素方差分析,P<0.05為差異具有統計學意義。HSP90AA1、PPARG、PIK3CA及內參β-cation的上、下游引物見表1。

表1 引物序列

采用20 μL qPCR反應體系:2×Real PCR EasyTMMix-SYBR 10 μL,上、下游引物(10 μmol·L-1)各0.8 μL,模板(cDNA/DNA)1 μL,50×ROX Reference Dye 0.4 μL,DNase-Free ddH2O 7 μL。qPCR擴增程序:95 ℃預變性10 min;95 ℃變性10 s,62 ℃退火30 s,72 ℃延伸15 s,40個循環,熔解曲線條件為72 ℃10 s。

2 結 果

2.1 網絡藥理學結果

2.1.1 靶點預測 如圖1,預測得到BBR靶點374個,獲取腸炎靶點16 354個。通過Venny分析,獲得BBR與腸炎有174個共表達靶點。

圖1 小檗堿與腸炎相關靶點交集

2.1.2 PPI網絡構建與核心靶點的篩選 將174個交集靶點導入STRING平臺,構建PPI網絡圖,使用Cytoscape進行可視化,如圖2 所示,其中較為核心的靶點為ALB、HSP90AA1、SRC、VEGFA、PIK3CA、ESR1、PPARG等。

圖2 小檗堿與腸炎共有靶標的PPI網絡

2.1.3 GO與KEGG富集分析 如圖3所示GO富集結果得出197個條目(P<0.01),其中GO生物過程(biological process,BP)112個,細胞組分(cell components,CC)55個,分子功能(molecular function,MF)30個,每組根據P值進行排序,前15的條目以柱狀圖展示。主要涉及信號轉導、蛋白磷酸化、氧化還原、細胞增殖、炎癥反應等生物過程,細胞組分主要分涉及細胞液、漿膜、細胞質、胞外體等,分子功能主要涉及蛋白結合、ATP結合、蛋白激酶活性、蛋白質同源二聚活性等。

圖3 GO富集結果分析

如圖4所示,KEGG通路富集篩選得到73條信號通路(P<0.01),主要涉及癌癥通路、PI3K-Akt信號通路、神經活性配體與受體的相互作用、趨化因子、Ras、cAMP信號通路等。KEGG富集分析結果根據P值排序,選取前30的條目繪制氣泡圖。其中P值越小,提示該通路越可能是BBR治療腸炎的主要通路。

圖4 KEGG通路富集結果分析

2.1.4 分子對接 對核心靶點進行分子對接驗證,其中HSP90AA1、PIK3CA、PPARG與BBR結合最緊密,結合能均小于-5 kJ·mol-1(表2)。蛋白與小分子的復合物采用Pymol2.1進行可視化分析(圖5)。由圖5可看出,BBR與HSP90AA1蛋白位點的LEU-107、ILE-26、TYR-139、ILE-110、VAL-136、ALA-55、VAL-186和PHE-138氨基酸殘基形成疏水相互作用;BBR與PPARG蛋白的活性位點的AVAL-339、ILE-341、LEU-330、MET-36和ILE-281氨基酸形成疏水相互作用;BBR與PIK3CA靶點蛋白的LYS-802殘基形成氫鍵相互作用,與TRP-780、ILE-848、ILE-932、MET-922、THR-856和VAL-850形成疏水相互作用;BBR的氮雜環與TRP-780的苯環形成了π-π共軛相互作用。綜上,表明3個核心靶點與BBR均具有較好的結合活性且結合體構穩定。

表2 蛋白質與化合物的對接結果

2.1.5 分子動力學模擬 如圖6所示,HSP90AA1、PIK3CA和PPARG蛋白的平均RMSD均小于3 ?,表明BBR與3個蛋白之間均能形成穩定的復合物。

如圖7A所示,BBR與HSP90AA1蛋白活性位點的MET-98、LEU-107、PHE-138、VAL-186存在很好的疏水相互作用,在整個分子的動力學模擬過程中氫鍵以及疏水相互作用存在的時間均大于18%,這表明小分子在蛋白位點存在持續有效的相互作用。如圖7B所示,BBR與PIK3CA蛋白活性位點的MET-772、TRP-780、LE-800、ILE-848、VAL-850、MET-922、ILE-932、PHE-934形成很強的疏水相互作用,對穩定蛋白口袋中的小分子起重要作用,另外BBR還能夠與GLN-859形成氫鍵相互作用,對穩定蛋白口袋中小分子也有著重要貢獻。如圖7C所示,BBR與PPARG的ILE-249、LEU-255、ILE-262、LYS-263、LEU-270、ILE-281、PHE-287、ILE-341、MET-348存在很強的疏水相互作用,且疏水相互作用時間均>25%。此外,BBR與GLU-343還存在靜電相互作用。

圖7 HSP90AA1(A)、PIK3CA(B)、PPARG(C)蛋白與BBR相互作用殘基圖

2.2 試驗驗證結果

2.2.1 一般行為學表現 經造模后,S組明顯出現腹瀉,采食量下降,精神萎靡不振,毛發無光澤,體重下降的情況,BS(治療組)癥狀有所緩解。

2.2.2 BBR和沙門菌對腸道組織的影響 如圖8,肉雞盲腸和十二指腸組織切片結果顯示,B組與BS組肉雞盲腸和十二指腸未見異常;與對照組相比,S組盲腸與十二指腸有明顯的炎性細胞浸潤。

a.C組盲腸組織切片;b.B組盲腸組織切片;c.S組盲腸組織切片;d.BS組盲腸組織切片;e.C組十二指腸切片;f.B組十二指腸切片;g.S組十二指腸切片;h.BS組十二指腸切片

2.2.3 BBR對腸炎關鍵靶點HSP90AA1、PIK3CA、PPARG轉錄的影響 如圖9所示,與對照組相比,S組(沙門菌攻毒模型組)中HSP90AA1基因轉錄量升高,PIK3CA基因轉錄量降低,PPARG基因表達量降低;與S組相比,BS組(治療組)中HSP90AA1基因轉錄量降低(P<0.001),PIK3CA基因轉錄量升高(P<0.01)。

*.P<0.05;**.P<0.01;***.P<0.001

3 討 論

BBR是一種天然的以季異喹啉為基礎的生物堿,小檗堿及相關中藥(如黃連)數千年來一直被廣泛應用治療腹瀉等胃腸道疾病,《傷寒論》中記載:“傷寒胸中有熱,胃中有邪氣,腹中痛,欲嘔吐者,黃連湯主之”。研究表明,BBR能夠顯著緩解急性腸胃炎患者嘔吐、腹痛和腹瀉癥狀,改善白細胞計數和中性粒細胞百分比。BBR能有效治療潰瘍性腸炎,降低血清和結腸組織促炎因子IL-6、IL-1β、TNF-α 含量及蛋白水平,增加抗炎因子IL-10、TGF-β、IL-4含量及蛋白水平[16]。此外,近年來,有許多研究證實小檗堿對由三硝基苯磺酸、脂多糖、葡聚糖硫酸鈉、乙酸誘導的腸道炎癥模型中表現出極強的治療作用,可緩解腸道屏障損傷[17]。例如,徐曉帆[8]研究發現,BBR可以緩解聚糖硫酸鈉誘導的小鼠腸道炎癥損傷,抑制溶菌酶的分泌。Li等[18]研究表明,BBR可通過調控腸神經系統中的腸膠質細胞功能,減輕炎癥浸潤和免疫細胞過度激活,調節腸黏膜免疫穩態,維持腸黏膜屏障的結構和功能,進而改善小鼠的潰瘍性結腸炎。

網絡藥理學作為重要的系統生物學研究方法,從整體的角度探索藥物與疾病的關聯性,可建立藥物與疾病靶點之間的預測模型,整合兩者之間的相互作用網絡,分析藥物與各個網絡模塊中特定節點的相互作用,從系統的角度研究藥物與潛在靶點之間的相互作用關系[19]。本研究基于網絡藥理學尋找BBR與腸炎的靶點,篩選出BBR治療腸炎的核心靶點,對交集靶點進行分析,核心靶點為ALB、HSP90AA1、PIK3CA、VEGFA、ESR1、SRC、NOS3、IGF1R和PPARG等。其中,HSP90AA1與炎癥密切相關,可調節細胞的增殖和凋亡,抑制HSP90AA1能誘導自噬從而改善潰瘍性結腸炎[20-22],Su等[23]研究發現,BBR與HSP90抑制劑功能相似,可抑制結腸癌SW840細胞中HSP90蛋白的表達,進而抑制SW840細胞的增殖。PPARG參與體內多種生理及病理過程,包括細胞的分化、炎癥反應、凋亡[24]。PPAR在腸上皮、巨噬細胞和血管內皮細胞中均具有高表達,有助于在疾病狀態下保持腸道內穩態[25]。Feng等[26]利用LPS建立大鼠急性內毒血癥模型,發現BBR可抑制LPS誘導的PPARγ磷酸化,證明黃連素對PPARγ活性具有潛在的保護作用,此外BBR也是PPARγ途徑調節劑,可緩解腸黏膜炎癥。有研究發現,灌服BBR可通過激活PPARγ途徑減少誘導COX-2的過量生產,可負向干擾p38/ATFs信號級聯,緩解回腸黏膜損傷[27]。黃連素可通過PPARγ途徑對腸、肺、肝等其他器官具有保護作用[26]。現有研究表明,PIK3CA的表達可激活PI3K-Akt信號通路,改善細胞凋亡和氧化應激[28-29]。本研究利用qRT-PCR檢測沙門菌攻毒后肉雞盲腸組織中HSP90AA1、PIK3CA以及PPARG的mRNA轉錄量,借以進一步研究HSP90AA1、PIK3CA以及PPARG在盲腸中對細菌感染過程中發揮的作用,結果發現,沙門菌攻毒后HSP90AA1 mRNA水平顯著上升,PIK3CA和PPARG的mRNA水平顯著降低,而在飼料中添加BBR可顯著降低由沙門菌攻毒引起的盲腸組織中HSP90AA1和PIK3CAmRNA的異常轉錄。此外,分子對接結果也發現BBR與HSP90AA1、PIK3CA和PPARG蛋白的多個殘基相結合且結合穩定,進一步佐證了BBR可能通過調控HSP90AA1、PIK3CA和PPARG的表達進而干預腸道炎癥的發生發展。由此,可以推測小檗堿對腸炎的治療作用可能與多靶點協同合作有關,具體體現在小檗堿能調控細胞增殖、分化、凋亡、炎癥反應等。

由GO富集結果及KEGG代謝通路的結果分析可知,GO-BP與信號轉導、蛋白磷酸化、凋亡過程、氧化還原過程、細胞增殖等有關,GO-MP集中于蛋白結合、ATP結合、蛋白激酶活性、酶結合等。

KEGG結果顯示,BBR通過多種通路途徑干預腸炎的發展,如PI3K-Akt、Ras、cAMP、Rap1、HIF-1、AMPK、FoxO信號通路及趨化因子信號通路、癌癥通路等。其中,PI3K-AKT信號通路參與眾多細胞因子的表達和分泌,可調節促炎和抗炎細胞因子的表達失衡,有研究表明BBR引起細胞阻滯的的機制可能與抑制PI3K信號通路有關,且PI3K-Akt信號通路參與細胞的生長、存活、增值、凋亡、自噬等過程[30-32]。Wu等[33]研究發現,BBR可抑制LPS誘導的RAW 264.7巨噬細胞炎癥反應,BBR通過抑制PI3K/Akt磷酸化,細胞中組胺、IL-4和TNF-α的產生進而緩解炎癥反應。本研究KEGG結果顯示,核心靶點HSP90AA1、PIK3CA均參與此信號通路,推測BBR緩解家禽腸道炎癥可能主要通過調控該信號通路。另有研究發現BBR可以呈劑量和時間依賴性降低ox-LDL誘導的炎癥,其中p-AMPK/AMPK的比例增加,說明小檗堿發揮抗炎作用可能與激活p-AMPK/AMPK信號通路相關[34]。徐曉帆[8]研究發現,BBR可緩解葡聚糖硫酸鈉誘導的小鼠腸炎,此外還可通過BBR顯著增加p-AMPK蛋白的表達量,IEC-18細胞自噬,緩解炎癥反應。cAMP信號通路是環核苷酸系統的一種,上調能調控星形細胞的極化,從而降低炎癥的發生[35]。FoxO信號通路主要與炎癥信號轉導相關,一旦被激活,其介導的NF-κB就會釋放大量的炎癥因子進而加劇炎癥反應[36]。有研究發現,BBR對甲氨蝶呤誘導的大鼠腸道炎癥具有良好的治療效果,主要通過下調NRF2、SIRT1、FOXO-3、Akt和mTOR的表達,上調GSK-3β、JAK1和STAT-3的表達[37]。據此推測,BBR可能通過調節細胞周期與細胞凋亡參與治療腸炎的過程。

4 結 論

本研究通過網絡藥理學和分子對接技術發現BBR通過多靶點、多通路協同作用緩解家禽腸道炎癥,進一步建立家禽腸道炎癥模型,發現BBR可調控HSP90AA1和PIK3CA的表達,顯著緩解家禽腸道屏障損傷,但更深入的分子機制還需進一步挖掘與驗證。