烤煙生長期葉片顏色特征值及其氮素診斷模型

朱瑩雪， 王琪， 馬獻發(fā)*， 焦玉生， 高金旭， 毛衛(wèi)佳，付佳， 孫雪崠， 元野

（1.東北農(nóng)業(yè)大學(xué)資源與環(huán)境學(xué)院，哈爾濱 150030； 2.中國煙草總公司黑龍江省公司牡丹江煙草科學(xué)研究所，哈爾濱 150076； 3.黑龍江省煙草公司牡丹江煙葉公司，黑龍江 牡丹江 157011； 4.中國煙草總公司黑龍江省公司，哈爾濱 150001； 5.牡丹江煙葉公司勃利分公司，黑龍江 七臺河 154500）

氮素是烤煙生長過程中的必需營養(yǎng)元素之一，施氮量過多或過少都會對煙葉的品質(zhì)和產(chǎn)量產(chǎn)生不利影響，適宜的施氮水平和施肥時期是保證煙葉品質(zhì)及產(chǎn)量的關(guān)鍵。因此，如何快速簡便地進行氮素營養(yǎng)診斷是指導(dǎo)烤煙田間管理的當務(wù)之急。烤煙氮素營養(yǎng)診斷的方法主要包括常規(guī)化學(xué)分析法、葉綠素儀法和高光譜技術(shù)。常規(guī)化學(xué)分析法需在實驗室進行，且其前處理和分析過程均較為繁瑣，時效性差。葉綠素可通過葉綠素儀對葉片SPAD 值的檢測間接反映煙葉全氮含量，雖然方便在田間使用且無需采集煙葉，但葉綠素儀價格昂貴，且農(nóng)戶無法得知確切的全氮含量。高光譜技術(shù)能反映植物的物理結(jié)構(gòu)和化學(xué)成分等內(nèi)在品質(zhì)[1]，無需采集煙葉就可估測煙葉全氮含量，但需要專業(yè)儀器，成本較高且操作繁瑣[2]。顏色特征值法是氮素營養(yǎng)診斷的新方法，該法利用紅色（red，R）、綠色（green，G）、藍色（blue，B）、亮度（lightness，L）特征值構(gòu)建葉片氮素含量診斷模型，并將模型應(yīng)用于智慧農(nóng)業(yè)，可實現(xiàn)快速簡便的氮素營養(yǎng)診斷。顏色特征值主要由構(gòu)成各種色彩的3 個原色R、G、B 組成,可通過數(shù)碼相機及智能手機等便攜電子設(shè)備記錄待測葉片顏色特征，并將顏色的深淺轉(zhuǎn)換為數(shù)字[3]，從而快速準確地讀取圖像中包含的顏色信息[4]。植物葉片顏色由葉片細胞內(nèi)色素（葉綠素、胡蘿卜素等）的相對含量決定，因而，前人研究了烤煙葉片顏色特征與質(zhì)體色素的關(guān)系及其估算模型。徐光輝等[5]利用顏色特征值和葉綠素含量構(gòu)建煙葉成熟期葉綠素含量估算模型，模型的估算值與實測值呈現(xiàn)極顯著正相關(guān)。靳雙珍等[6]發(fā)現(xiàn)，顏色特征值與烤煙質(zhì)體色素含量和多酚類物質(zhì)含量之間存在相關(guān)關(guān)系，如顏色特征值正面L 與烤煙β 胡蘿卜素含量呈負相關(guān)，與葉黃素含量呈正相關(guān)；背面黃度（yellow，Y）與烤煙蕓香苷含量呈負相關(guān)[7]，因此，在實際生產(chǎn)中可利用顏色特征值對烤煙質(zhì)體色素和多酚類物質(zhì)含量的高低進行判斷。研究發(fā)現(xiàn)，將R、G、B顏色坐標轉(zhuǎn)換成孟塞爾顏色系統(tǒng)后，可用于烤煙的自動分級[8]，以減少人為因素的誤差。Zhi 等[9]構(gòu)建彩色圖表系統(tǒng)（color chart system，CCS），通過配備電荷耦合器件圖像傳感器（charge coupled device，CCD）精確提取煙葉顏色，利用比例閾值法構(gòu)建HSV（hue，色調(diào)；saturation，飽和度；value，明度）顏色值與RGB 顏色值的轉(zhuǎn)換公式來提高煙葉顏色圖的準確性，使評價者對不同地區(qū)煙葉的顏色鑒別能力提高了30%以上。利用顏色特征值分析植物葉片含氮量及葉綠素含量的研究已在大豆、番茄、苧麻等作物上廣泛應(yīng)用[10-12]。除此之外，通過RGB 圖像構(gòu)建模型還可用于測量葉片含水量[13]、估算微藻生物量[14]、預(yù)測作物產(chǎn)量[15]，由此表明，利用RGB 顏色系統(tǒng)構(gòu)建相關(guān)模型是切實可行的。以葉片顏色特征值R、G、B、L與氮素含量的關(guān)系模型檢測烤煙的氮素盈缺狀況可以為未來智慧農(nóng)業(yè)提供技術(shù)支持。目前，關(guān)于烤煙葉片顏色特征值主要集中在葉片葉綠素、品質(zhì)分級方面，而利用葉片顏色特征值對烤煙葉片進行氮素診斷的深入研究尚未見報道。因此，本文通過研究煙葉顏色特征值、全氮含量及煙葉SPAD 值對氮肥響應(yīng)變化特征，明確與煙葉全氮含量顯著相關(guān)的顏色特征參數(shù)，建立RGB 顏色特征值與煙葉全氮含量之間的診斷模型，為烤煙生長期的氮素營養(yǎng)診斷及未來智慧農(nóng)業(yè)發(fā)展提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 試驗地點

試驗地在中國煙草總公司黑龍江省公司牡丹江煙草科學(xué)研究所試驗場（44.382 7° N，129.472 8° E），海拔277.34 m，屬中溫帶濕潤季風氣候區(qū)，土壤類型為黑土，土壤基礎(chǔ)肥力如表1所示。

表1 土壤基礎(chǔ)肥力Table 1 Soil basic fertility

1.2 試驗設(shè)計

烤煙品種為‘龍煙911’，采用苗棚育苗，于7葉齡移栽到大田。供試氮肥為硝酸銨（N，34%），磷肥為重過磷酸鈣（P2O5，46%），鉀肥為硫酸鉀（K2O，50%）。試驗共設(shè)置7 個施氮量處理，每處理3 次重復(fù)。其中部分氮肥于移栽前作為基肥施入，剩余氮肥于移栽后作為追肥施入，如表2 所示。各處理磷鉀肥施用量一致，其中重過磷酸鈣150 kg·hm?2，硫酸鉀270 kg·hm?2，均作為基肥于移栽前施入。株距0.5 m，行距1.1 m，壟長6.0 m，小區(qū)面積39.6 m2（6壟）。

表2 各處理施肥量Table 2 Rate of fertilization of different treatments

1.3 樣品的采集及測定

1.3.1樣品的采集 在烤煙團棵期（移栽后35 d）及旺長期（移栽后55 d），每個小區(qū)隨機選取5 株烤煙，分別采集上部葉片（從根部開始第8~9 片葉）、中部葉片（從根部開始第5~7片葉）和下部葉片（從根部開始第3~4 片葉）。煙葉掃描圖像后，用于全氮含量的測定。

1.3.2烤煙葉片全氮含量的測定 將采集的煙葉置于烘箱中105 ℃殺青30 min，65 ℃烘干至恒重，粉碎、過0.25 mm篩后密封保存,采用H2SO4-H2O2消煮的奈氏比色法[16]測定煙葉全氮（total nitrogen，TN）含量。

1.3.3烤煙葉片SPAD 值的測定 在烤煙團棵期及旺長期，隨機在每小區(qū)選取代表平均長勢的10 株烤煙，分別選取下部葉、中部葉及上部葉，利用便攜式葉綠素儀SPAD-502測定每片葉片頂部、中部、基部的SPAD值，取平均值。

1.3.4煙葉圖片的獲取與顏色特征值的提取 煙葉圖像利用掃描儀（Cano Scan 9000F）數(shù)字化成像，逐個掃描葉片正面顏色，圖像分辨率大小為2 550×3 504 像素，存儲格式為JPG 格式。采用Adobe Photoshop 7.0 圖形軟件進行圖像分析并提取顏色特征值。通過工具面板的魔術(shù)棒工具選擇所需要的葉片部分，然后再選擇“窗口”中的直方圖程序讀取R、G、B 和L的圖像均值[17]。若煙葉幅面大于掃描儀最大幅面時，分幅掃描、存儲，取其相應(yīng)特征值的平均值。

1.3.5數(shù)據(jù)的選取 將測定的顏色特征值和煙葉全氮含量分為2 組，其中1 組樣本（n=42）用于分析建模；另1組樣本（n=21）用于檢驗。

1.4 建模方法

煙葉全氮含量與顏色特征值建模采用多元逐步回歸分析，方程如下。

式中,X1，X2，…XP代表顏色特征參數(shù)，ε為參數(shù)。若有n組樣本，則公式（1）會形成矩陣，如式（2）所示。n組樣本分別是（Xi1,Xi2, ...XiP,yi), (i=1, 2, ...,n)，形成矩陣如下。

根據(jù)式（2）得出多元線性逐步回歸方程。

式中，β代表斜率。

1.5 數(shù)據(jù)處理

采用Excel 2007 軟件進行數(shù)據(jù)分析，采用SPSS 22.0 軟件進行方差分析，利用Duncans 法進行多重比較。

2 結(jié)果與分析

2.1 不同施氮量對烤煙葉片全氮含量的影響

由圖1 可知，團棵期各部位葉片的全氮含量均高于旺長期，且團棵期和旺長期葉片全氮含量均表現(xiàn)出上部葉片>中部葉片>下部葉片。其中，在團棵期，僅上部和中部葉片的全氮含量在處理間存在顯著差異；在旺長期，各部位葉片在不同處理間均存在顯著差異。由此表明，不同施氮量處理對旺長期的葉片全氮含量影響較大。

圖1 不同處理下各部位葉片在團棵期和旺長期的全氮含量Fig. 1 Total nitrogen content of leaf under different treatments in rosette and fast growing periods

2.2 不同施氮量對烤煙葉片顏色特征值的影響

由圖2 可知，顏色特征值B 的上下邊緣相距較近，數(shù)據(jù)最大值與最小值間的差值較小，說明數(shù)據(jù)較為集中，離散程度小，對不同施氮量變化不敏感；而顏色特征值R、G、L 的上下邊緣相距較遠，數(shù)據(jù)最大值與最小值間的差值較大，離散程度較大，且顏色特征值的中位數(shù)均靠近上部，說明顏色特征值R、G、L 對氮素含量的變化較為敏感，其中顏色特征值G的數(shù)值最大。

圖2 顏色特征值箱形圖Fig. 2 Box-plot of color characteristic value

2.3 煙葉全氮含量、SPAD 值及顏色特征值之間的關(guān)系

2.3.1煙葉全氮含量與SPAD 值關(guān)系 SPAD 值可以反映葉片的葉綠素含量。分析烤煙葉片全氮含量與葉片SPAD 值之間的關(guān)系（圖3）表明，烤煙葉片SPAD 值隨葉片全氮含量的增加而增加，二者呈極顯著正相關(guān)(P<0.01)。由此說明，葉片SPAD 值的大小可以間接反映葉片的全氮含量，即烤煙葉片葉綠素含量越高，其葉片全氮含量也越多。

圖3 葉片全氮含量與葉片SPAD值的關(guān)系Fig. 3 Correlation between the total nitrogen content and SPAD value of tobacco leaves

2.3.2煙葉SPAD 值與顏色特征值關(guān)系 由圖4可知，葉片SPAD 值與顏色特征值之間存在顯著或極顯著的負相關(guān)關(guān)系，其中與顏色特征值R、G、L 均呈極顯著負相關(guān)(P<0.01)，與顏色特征值B 呈顯著負相關(guān)(P<0.05)。相關(guān)系數(shù)（r）表現(xiàn)為rR>rL>rG>rB，說明顏色特征值R與葉片SPAD值之間的相關(guān)性最高。

圖4 煙葉SPAD值與顏色特征值相關(guān)性Fig. 4 Correlation between SPAD value and color characteristic value of tobacco leaves

2.3.3煙葉全氮含量與顏色特征值關(guān)系 對烤煙葉片全氮（total nitrogen,TN）含量和顏色特征值進行相關(guān)分析，結(jié)果（表3）表明，煙葉全氮含量與顏色特征值L、R、G 及L/(R+G)、B/R、B/G、L/B、R+B、B+G、R+B+G+L均呈極顯著相關(guān)，與顏色特征值R/(G+B)、R+B/(R+B+G)呈顯著相關(guān)，與顏色特征值B和G/R相關(guān)不顯著。

表3 煙葉全氮含量與顏色特征值相關(guān)性Table 3 Correlation between total nitrogen content and color characteristic value of tobacco leaves

2.4 煙葉氮素診斷模型的建立與檢驗

2.4.1模型的建立 由于煙葉全氮含量與顏色特征值之間存在較好的相關(guān)關(guān)系，因此利用SPSS 22.0軟件對旺長期煙葉的全氮含量與顏色特征值進行多元逐步回歸分析。以顏色特征值為自變量，以葉片全氮含量作為因變量Y，將數(shù)據(jù)帶入1.4中的建模理論，得出以下方程。

經(jīng)分析該模型未達到顯著水平（P>0.05），因此剔除不顯著項，得到以下模型。

分析發(fā)現(xiàn)該模型達到顯著水平（P<0.05），說明剔除不顯著項后的模型預(yù)測效果更好。

2.4.2模型的檢驗 首先將旺長期測得的顏色特征值數(shù)據(jù)代入公式（5），計算葉片全氮含量；然后將模型計算出的預(yù)測值與旺長期葉片全氮含量的實測值進行相關(guān)性分析，結(jié)果（圖5）表明，模型計算出的煙葉全氮含量預(yù)測值與煙葉全氮含量實測值呈極顯著正相關(guān)(P<0.01)，說明模型的預(yù)測效果較好。

圖5 煙葉全氮含量預(yù)測值與實測值的相關(guān)分析Fig. 5 Correlation analysis between simulated and actual values of total nitrogen content in tobacco leaves

3 討論

本研究表明，不同施氮量處理下烤煙葉片的全氮含量在旺長期差異更為顯著，這可能是由于團棵期煙株需氮量較少，因此各處理間葉片氮素含量變化差異較小；而旺長期是烤煙吸收氮素的高峰期[18]，低氮量處理氮肥供應(yīng)不足，葉片全氮含量開始有所降低，導(dǎo)致各處理間差異顯著。團棵期和旺長期各部位葉片的全氮含量均呈現(xiàn)出下部葉片<中部葉片<上部葉片的趨勢，這可能是因為上部葉多為剛長出的新葉，其生長速度較快，且生長所需的營養(yǎng)物質(zhì)主要依靠老葉的輸送[19?20]，因此烤煙下部葉對氮素含量的變化更為敏感。

葉片顏色特征值RGB 對葉片氮素含量的響應(yīng)表現(xiàn)不同，其中顏色特征值G、R 對氮素含量變化較顏色特征值B更為敏感。這一規(guī)律不受葉片圖像采集與顏色特征值提取方法影響，這在不同烤煙品種間[21]及其他作物[12]也具有相同趨勢。因此，烤煙葉片顏色特征值RGB 預(yù)測葉片全氮含量具有廣適性。

葉片顏色特征值RGB 對葉片氮素含量響應(yīng)變化主要由葉片細胞內(nèi)色素決定。Li 等[22]發(fā)現(xiàn)，紅光波段的反射率與作物氮指數(shù)密切相關(guān)，且可見光區(qū)域作物的光譜反射率主要由光合色素（主要是葉綠素a 和b）的光吸收特性決定。Evans[23]發(fā)現(xiàn)，葉片氮含量與光合作用間存在一定的因果關(guān)系，即氮素含量和葉綠素含量間存在很強的線性關(guān)系，說明葉片含氮量可通過影響葉片葉綠素含量間接影響顏色特征值。Sun 等[24]探討了西蘭花葉綠素降解機理，發(fā)現(xiàn)隨著西蘭花葉綠素的降解，R 值和B 值均出現(xiàn)明顯變化。植物葉色變化是由葉片內(nèi)的葉綠素、類胡蘿卜素和花青素3 種色素含量變化決定的[25]，當葉綠素含量高于其他2 種色素時，葉片呈現(xiàn)綠色。研究發(fā)現(xiàn)，葉綠素在光合作用中主要吸收紅光和藍光，反射綠光，其中R/(R+G+B)可作為估算玉米葉綠素含量最主要的顏色特征參數(shù)[26]；水稻葉片的顏色特征值與SPAD值呈指數(shù)關(guān)系[27]。因此，葉片的葉綠素、SPAD 值與顏色特征值間存在一定的相關(guān)性。

對比高光譜成像技術(shù)復(fù)雜的算法和昂貴的機器、葉綠素儀只能逐點測量且需要多次重復(fù)測量保證準確性的弊端[28]，應(yīng)用顏色特征值技術(shù)構(gòu)建出的烤煙氮素含量診斷模型，可以快速檢測烤煙葉片全氮含量以及葉綠素含量[29-31]。但由于烤煙葉片診斷時期、葉位及采集圖像設(shè)備的差異，基于葉片顏色特征參數(shù)構(gòu)建的氮素診斷模型會略有不同。本研究基于掃描成像技術(shù)，在一定程度上保證了一致的光照、成像距離，且不受采集光照、時間和天氣等因素影響，構(gòu)建了煙葉全氮含量與顏色特征值的模型Y=1.465G+84.377(B/G)-1.004(B+G)?36.959，經(jīng)檢驗，模型預(yù)測值與實測值呈極顯著相關(guān)（P<0.01），故此模型可以應(yīng)用于烤煙葉片的氮素診斷。由于不同烤煙種植區(qū)品種和水熱條件可能存在差異，為了準確預(yù)測田間烤煙葉片的氮素水平，建議在田間應(yīng)用顏色特征值氮素診斷模型時做進一步研究。