減氮配施生物有機肥對植煙土壤特性及煙草青枯病的防效研究

尹興盛， 包玲鳳， 濮永瑜， 孫加利， 張慶， 李海平，楊明英， 林躍平， 王懷鑫， 何永宏， 楊佩文*

（1.云南省煙草公司保山市公司，云南 保山 678000； 2.云南農業大學植物保護學院，昆明 650201；3.云南省農業科學院農業環境資源研究所，昆明 650205）

現代農業種植體系中，隨著農業產業結構調整，在以烤煙為中心的作物輪作復種制度下，長期施用化肥加速了土壤養分消耗，并衍生板結、耕層變薄等次生障礙，導致土壤中病原菌劇增而引發嚴重根莖類病害[1]。以培育耕地地力和穩定提升肥料利用率為突破口，開展植煙土壤地力提升及養分利用增效機制和技術的多尺度研究，建立土壤地力提升、養分與有害生物間相互關系，研發基于耕地地力提升的有害生物生態防控新途徑是實現病害可持續防控的重要方向。

生物有機肥能改善土壤耕層物理性狀，增加有機質和養分含量，改變土壤微生物環境，促進土壤微生物功能多樣性形成，是植煙土壤質量提升的有效措施。大量研究表明，生物有機肥的施用可以疏松土壤，增加土壤的孔隙度，改善土壤的團粒結構，提高土壤保水保肥性能和通氣狀況，還可以提升土壤有機碳、土壤酶活性和土壤微生物量碳氮等[2-5]。生物有機肥中含有大量易被微生物分解和利用的營養物質，可刺激不同微生物類群的迅速生長和繁殖；另外還含有大量功能微生物，功能微生物輸入土壤后，其種類和數量的變化直接改變了土壤微生物的群落結構，促進了土壤微生物優勢群落的形成[6?7]；而土壤微生物量的增加進一步提高了蛋白酶、脲酶、蔗糖酶和土壤磷酸酶等的活性，從而影響土壤中氮、磷、鉀等養分的礦化速率[8-10]。在當前減施化肥和增施有機肥的大趨勢下，針對植煙土壤質量退化和病害頻發問題，生物有機肥是改善耕作土壤環境和提高作物產量、質量及各項抗逆性能的重要農業生產投入品之一。

面向建立耕地大面積均衡減肥提質的技術需求，針對植煙區主要土壤類型，以消除土壤障礙制約和快速培育地力從而穩定提升地力為突破口，開展功能型微生物菌肥研發，并在植煙土壤開展減氮配施生物有機肥田間小區試驗，通過分析土壤理化性質和生物學特性變化特征與主控因素，揭示減氮配施生物有機肥促進地力提升的效果。進一步通過解析土壤理化性質和生物學特性主控因素與病情指數間的相關關系，建立“穩定提升土壤質量-加速養分循環利用-生態防控根莖類病害”的綜合管理模式，為植煙土壤氮素優化管理和病害防控提供依據。

1 材料與方法

1.1 供試生物有機肥

取菌渣500 kg、中藥渣200 kg、草炭300 kg 混合，堆好后用塑料布覆蓋。堆捂期間控制堆肥物料中水分含量在35%~40%，溫度在65~75 ℃，分別于堆捂第10、20、30 天翻堆1 次，在此過程中加入尿素、過磷酸鈣和硫酸鉀作為肥料添加劑，該肥料添加劑中N、P、K 的質量比為8∶16∶26，堆肥持續至第35 天時即獲得有機肥。初級腐熟發酵結束后，加入10 kg 1.0×109CFU·g-1的多粘類芽孢桿菌（Paenibacillus polymyxa），并翻堆使其混合均勻，次級發酵5~10 d，在此期間控制堆肥物料中水分含量介于25%~28%，溫度介于35~50 ℃，分別間隔2 d翻堆1 次，即獲得生物有機肥。其中，N含量19.82 g·kg-1，P2O533.78 g·kg-1，K2O 29.26 g·kg-1，有機質含量483.30 g·kg-1，多粘芽孢桿菌有效活菌數≥2.0×108CFU·g-1。

1.2 試驗地概況

田間試驗于2020年5—11月進行，試驗地點位于云南保山市昌寧縣柯街鎮臘邑村（24°54′49″ N，99°24′40″ E），海拔145 m，全年平均氣溫19.5 ℃，年降雨量96 mm。土壤類型為砂壤，0—20 cm土壤容重1.67 g·cm-3，有機質35.26 g·kg-1，全氮1.98 g·kg-1，全磷1.02 g·kg-1，全鉀19.07 g·kg-1，堿解氮168.74 mg·kg-1，有效磷40.11 mg·kg-1，速效鉀312.58 mg·kg-1，pH 7.49。煙草青枯病歷年發生，病情指數5.00~20.00。作物種植模式為烤煙-豌豆輪作。

1.3 試驗設計

設置不同氮用量、相同生物有機肥用量田間小區試驗，各小區隨機排列，試驗設置常規施肥（CK1）、常規施肥+農家肥（牛糞發酵而成，N 含量0.32 g·kg-1，P2O5含量0.25 g·kg-1，K2O 含量0.65 g·kg-1，有機質145.70 g·kg-1，施用量7 500 kg·hm-2）（CK2）、常規施肥減氮5%+生物有機肥（3 750 kg·hm-2）（T1）、常規施肥減氮10%+生物有機肥（3 750 kg·hm-2）（T2）、常規施肥減氮15%+生物有機肥（3 750 kg·hm-2）（T3）、常規施肥減氮20%+生物有機肥（3 750 kg·hm-2）（T4）共6 個處理，每個處理4 次重復，共計24 個小區。全部的農家肥和生物有機肥作為基肥（環狀塘肥）施用，其他主要栽培技術參照當地烤煙標準化生產技術方案執行，烤煙品種為云煙系列云煙105。

1.4 指標測量

1.4.1土壤樣品采集與分析 于烤煙收獲后（2020年11月）采集土壤樣品，分別制備新鮮樣品和風干樣品，測試土壤酶活性和主要理化指標。參照鮑士旦[11]的方法，土壤容重（bulk density，BD）采用環刀法測定；pH采用pH儀測定；有機質（organic matter，OM）含量采用重鉻酸鉀外加熱法測定；全氮（total nitrogen，TN）含量采用凱氏定氮法測定，堿解氮（alkaline-ydrolyzed nitrogen，AN）含量采用堿解擴散法測定；速效磷（available phosphorus，AP）含量采用碳酸氫鈉提取法測定；速效鉀（available potassium，AK）含量采用鹽酸浸提-AAS 法測定。土壤蔗糖酶（invertase，INV）和脲酶（urease，URE）活性采用試劑盒（蘇州瑞思生物科技有限公司生產）微板法測定，測定方法按照試劑盒說明書進行。土壤碳儲量（soil carbon storage，SCS）、土壤氮儲量（soil nitrogen storage，SNS）的計算公式如下[12]。

式中，Nmass為土壤中全氮或有機碳儲量（kg·hm-2），C為土壤全氮或有機碳含量（g·kg-1），B為土壤容重(g·cm-3)，H為土層厚度(m)。

土壤微生物量碳（soil microbial biomass carbon，SMBC）、土壤微生物量氮（soil microbial biomass nitrogen，SMBN）采用氯仿熏蒸-硫酸鉀溶液浸提法測定[13]，計算公式如下。

式中，EC為熏蒸土壤浸提測定的總有機碳-不熏蒸土壤浸提測定的總有機碳；kEC為轉換系數，取值0.38；EN為熏蒸土壤浸提測定的全氮-不熏蒸土壤浸提測定的全氮；kEN為轉換系數，取值0.45。

1.4.2烤煙農藝性狀和青枯病發生情況及產質量測試 烤煙農藝性狀調查方法按YC/T 142—2010《煙草農藝性狀調查測量方法》[14]標準調查。于烤煙收獲期測定各區產量、等級和單價。煙葉經濟性狀按GB 2635—1992《烤煙》[15]對烤后煙葉進行分級，記錄煙葉產量、產值、上等煙比例及均價，進行煙葉產量和經濟效益統計。煙草病情分級標準參照GB/T 23222—2008《煙草病蟲害分級及調查方法》[16]調查，計算病情指數和防治效果[17]。

1.5 數據分析

利用Excel 2010 對數據進行統計分析，采用SPSS 20.0軟件進行方差分析，利用Duncan進行差異顯著性檢驗，P<0.05為差異顯著；采用SigmaPlot 12.5制作圖表。

2 結果分析

2.1 不同施肥處理對植煙土壤主要理化性質的影響

不同施肥處理下植煙土壤理化性質見圖1，CK2 和T2、T3、T4 處理的土壤容重顯著低于CK1處理（P<0.05）；CK2 和T1~T4 處理pH 顯著低于CK1 處理，土壤有機碳、土壤碳氮比（C/N）顯著高于CK1 處理（P<0.05）；與CK1 相比，CK2 處理堿解氮含量顯著提升，T1~T4 處理無明顯變化；CK2、T1、T2、T4 處理速效鉀含量顯著高于CK1 處理，T3 處理無明顯變化；各處理間有效磷含量無顯著差異。與CK1 相比，T1~T4 處理土壤容重降低2.40%~7.31%，pH 降低3.58%~6.93%，C/N 提高11.71%~15.59%，有機碳提高19.76%~22.64%，堿解氮提高1.97%~3.50%，速效鉀提高7.69%~15.51%。T1~T4 處理間土壤容重、pH、堿解氮先下降后趨于平緩，速效鉀含量先減后增，有機碳含量、C/N、有效磷無明顯變化。

圖1 不同施肥處理下的土壤主要理化性質Fig. 1 Main physical and chemical properties of soil under different fertilization treatments

2.2 土壤碳氮儲量統計分析結果

由圖2 可知，增施生物有機肥處理土壤碳儲量、氮儲量顯著高于單施化肥處理（P<0.05）。其中，CK1 處理土壤碳儲量為42 400 kg·hm-2、氮儲量為4 400 kg·hm-2，CK2 處理的碳儲量為54 900 kg·hm-2、氮儲量為4 900 kg·hm-2，T1~T4 處理碳儲量為63 200~66 000 kg·hm-2、氮儲量為5 800~5 900 kg·hm-2。T1~T4 處理較CK1 處理碳儲量顯著提高49.24%~55.76%、氮儲量顯著提高31.54%～34.94%，較CK2 處理碳儲量顯著提高15.27%~20.31%、氮儲量顯著提高17.46%~20.49%；T1~T4處理間土壤碳氮儲量無明顯變化。

圖2 不同施肥措施下的土壤碳儲量和氮儲量Fig. 2 Soil carbon storage and nitrogen storage of soil under different fertilization treatments

2.3 不同施肥處理對植煙土壤酶活性的影響

如圖3 所示，較單施化肥處理，增施生物有機肥處理的收獲期土壤蔗糖酶和脲酶的活性得到顯著提高。土壤蔗糖酶活性為60.12~66.47 mg·d-1·q-1、脲酶活性為1.78~2.21 mg·d-1·q-1。從圖3 可知，較CK1 處理，CK2 處理蔗糖酶活性提高10.56%、脲酶活性提高24.57%；T2~T4 處理蔗糖酶活性極顯著提高8.45%~8.88%（P<0.01）、脲酶活性顯著提高17.91%~23.03%（P<0.05），T1~T4處理蔗糖酶活性和脲酶活性分別提升8.45%~8.88%、17.91%~23.03%。T1~T4 處理間蔗糖酶和脲酶活性呈逐漸上升趨勢。

圖3 不同施肥措施下的土壤蔗糖酶和脲酶活性Fig. 3 Activity of soil invertase and urease under different fertilization treatments

2.4 不同施肥處理對植煙土壤微生物量的影響

不同施肥措施下，土壤微生物量碳氮變化如圖4所示。與CK1相比，CK2處理下土壤微生物量碳（SMBC）提高63.47%、土壤微生物量氮（SMBN）提高42.67%，微生物熵和土壤微生物量碳氮比（SMBC/SMBN）無顯著變化。T1~T4 處理SMBC 提高73.44%~81.76%，其中T1 和T2 處理SMBC 分別顯著提高75.76%和81.76%（P<0.05）；T1~T4 處理SMBN提高1.47%~51.76%，其中T1 處理SMBN 顯著提高51.76%（P<0.05）；T1~T3處理微生物熵提高12.19%~16.02%；T1~T4 處理SMBC/SMBN 提高15.66%~59.01%，其中T3和T4處理SMBC/SMBN分別顯著提高55.94%和59.01%（P<0.05）。T1~T4處理間SMBC、SME 呈先增加后逐漸降低趨勢，SMBN 逐漸下降，SMBC/SMBN呈上升趨勢。

圖4 不同施肥處理下的土壤微生物量Fig. 4 Soil microbial biomass analysis of soil under different fertilization treatments

2.5 不同施肥處理對烤煙農藝性狀和經濟性狀的影響

如圖5所示，不同施肥處理的烤煙生物學性狀存在顯著差異（P<0.05）。各處理平均有效葉片數為18.00～21.55片，平均株高為112.80~131.66 cm，平均莖圍10.44~11.47 cm，平均單株葉面積2 060 ~4 240 cm2。T1~T4 處理顯著提高了有效葉片數、株高、莖圍和單株葉面積，烤煙促生長效果顯著（P<0.05）。T1~T4 處理間煙株單株葉面積先增加后下降，烤煙莖圍、節距、有效葉片數、株高無顯著差異。

圖5 不同施肥處理下的烤煙農藝性狀Fig.5 Agronomic characters of flue-cured tobacco under different fertilization treatments

不同施肥處理的烤煙經濟性狀存在明顯差異（圖6）。各處理產量為2 120~2 760 kg·hm-2，上等煙比例為27.14%~58.79%，中上等煙比例為62.05%~86.74%。T1~T4 處理顯著提高了烤煙產質量，產量提升3.92%~30.70%、上等煙比例提升16.20%~116.66%、中上等煙比例提升8.95%~39.78%。T1~T4 處理間烤煙產量、上等煙比例和中上等煙比例先增加后降低，以T3處理的烤煙經濟性狀最好。

圖6 不同施肥處理下的烤煙產量和質量Fig.6 Yield and quality of flue-cured tobacco of soil under different fertilization treatments

2.6 不同施肥措施對煙草青枯病的防控效果

如表1 所示，不同施肥處理的青枯病病情指數和防控效果差異顯著（P<0.05）。與CK1 相比，CK2 處理的病情指數顯著下降37.65%，防治效果為37.64%；T1~T4 處理的病情指數顯著下降70.32%~75.31%，防治效果為69.64%~75.97%；T1~T4處理間病情指數和防治效果差異不顯著。

表1 煙草青枯病的發生情況Table 1 Controlling effect of different treatments on Ralstoniasolanacearum

2.7 相關性分析

由表2 可知，病情指數與pH 呈極顯著正相關（P<0.01），與土壤C/N、有機碳、碳儲量、氮儲量、蔗糖酶、脲酶、微生物量碳和微生物量碳氮比呈極顯著負相關（P<0.01），與土壤容重、堿解氮、有效磷和速效鉀呈正相關關系，與微生物量氮呈負相關關系。

表2 病情指數與土壤理化性質、碳氮儲量、酶活、微生物量的相關性分析Table 2 Correlation analysis between disease index and soil physical and chemical properties， carbon and nitrogen storage，enzyme activity， and microbial biomass

3 討論

土壤容重和pH是土壤物理性質的重要指標，土壤有機碳是土壤養分轉化的核心，反映土壤疏松程度和耕地質量好壞[18-20]。本研究中，減氮配施生物有機肥顯著降低了土壤容重和pH，顯著提高土壤C/N、有機碳含量，與胡瑋等[21]研究結果相似。T1~T4 處理隨氮素施用量減少，堿解氮、有效磷和速效鉀含量表現為T1>T2>T4>T3，速效養分先減后增，可能是等磷、等鉀條件下氮肥施用量減少，導致土壤中速效養分含量降低，這與張永亮等[22]研究結果相似。土壤碳、氮對調節土壤生產力和維持土壤養分穩定性起重要作用[23]。本研究中，增施生物有機肥后土壤碳氮儲量較CK1、CK2 處理顯著增加，原因可能是生物有機肥中含有大量易被微生物分解和利用的營養，外源性養分輸入會導致土壤環境及作物養分轉化發生改變[24]，從而影響土壤碳氮儲量的變化，同時生物有機肥中含有大量的功能微生物，而土壤微生物對棲境微環境十分敏感，環境改變易引起微生物的變化，而土壤微生物又反作用于土壤環境，調控生態系統物質循環和能量流動[25]。

土壤酶在土壤養分的轉化和運輸過程中具有重要作用，能有效反映作物對養分的吸收利用情況，是評價土壤肥力的重要生物活性指標[26?27]。武杞蔓等[28]研究發現，施用生物有機肥后可顯著提高土壤脲酶和蔗糖酶的生物活性進而提升土壤肥力，本研究的結論與之相一致。由于配施生物有機肥加快了煙草根際土壤中有機化合物的分解，提供了酶促反應充足的底物，從而促進了微生物的分解[29]。增施生物有機肥處理以T3 處理的土壤蔗糖酶和脲酶活性最高，表明該施肥模式下土壤肥力提升效果較明顯。

土壤微生物量可促進土壤養分轉化，對土壤碳氮等元素的循環利用起主要作用，是評價土壤肥力的重要依據[30]。施肥是影響土壤微生物量碳氮的主要因素之一[31]，本研究發現增施生物有機肥后土壤微生物量均有不同程度提高，可能是添加生物有機肥后促進了土壤微生物的生長繁殖[32]。但減氮配施生物有機肥處理中隨著化肥用量的減少，微生物量碳氮并未一直呈上升趨勢，說明化肥用量并非越少越好。研究表明，土壤細菌、真菌的SMBC/SMBN 分別為3~6 和7~12[33]。本研究CK1 和CK2 處理SMBC/SMBN 均值分別為3.35、3.81，T1~T4 處理SMBC/SMBN 為3.87~5.32，說明增施農家肥和生物有機肥提高了土壤中細菌數量。而T1~T4 處理隨著化肥用量的減少，SMBC/SMBN也逐漸增大，可能是土壤中有機氮比例增加促進細菌生長的同時也促進了真菌的生長，但土壤中微生物仍以細菌型為主。

作物產量、質量的降低及土壤肥力的退化是由于土壤中養分缺失導致的，因而科學合理的施肥方式能提高土壤中養分的循環利用[34]。研究表明，生物有機肥中含有大量的微生物，增加作物根際土壤中有益菌生物量的同時，還能提升土壤養分含量，從而達到促進作物生長，提高作物產量和品質的效果[35?36]。石磊等[37]研究發現化肥減量10%配施600 kg·hm-2生物菌肥對色素辣椒生長的綜合效益最佳。本研究中，生物有機肥配施化肥模式下顯著提高了煙草植株農藝性狀、產量和品質（P<0.05），其中，產量提升率達3.92%~30.70%，上等煙比例提升率達16.20%~116.66%；T3處理提升效果最顯著且顯著高于其他處理，表明增施生物有機肥減氮15%施肥模式能更好地促進煙草生長，提高產量和質量，這與周進[38]、楊志剛等[39]發現生物菌肥配施化肥可提高辣椒生長性能、光合特性、產量和品質的研究結果相似。

目前，煙草根莖類病害已成為制約煙草產業綠色可持續發展的主要限制性因子。因而，發掘并利用新型環保的生物肥料是防治煙草根莖類病害最有效的技術方法。生物有機肥中含有大量的有益微生物，施入生物有機肥后，大量有益微生物聚集在作物根系周圍迅速生長繁殖，抑制病原菌的生長，形成優勢菌群，分泌次級代謝產物抑制病原菌的生長繁殖，提高植物體的抗逆性能[40]。本研究中減氮配施生物有機肥明顯提高了煙草青枯病的防治效果，這與陳巧玲等[41]認為施用生物有機肥顯著降低了烤煙抗病品種和感病品種青枯病的發病率的研究結果一致。生物有機肥有效抑制了煙草青枯病的發生，整體上提高了煙葉的經濟性狀。此外，有研究表明生物有機肥可通過激活作物體內的防御酶活來提高作物的抗逆性，如過氧化物酶、兒茶酚氧化酶、苯丙氨酸解氨酶等，過氧化物酶能減緩不同作物間的相互排斥或抑制作用，苯丙氨酸解氨酶是苯丙烷類次級代謝途徑的限速酶和關鍵酶[36]。為探索此類防御酶對煙草青枯病的防病機制，后續可進一步開展驗證研究。相關性結果表明，病情指數與土壤C/N、有機碳、pH、碳儲量、氮儲量、蔗糖酶、脲酶、微生物量碳和微生物量碳氮比呈極顯著負相關，可能是生物有機肥能通過改善植煙土壤質量和環境提高烤煙抗病能力，并降低土壤有害微生物數量。