自體脂肪間充質(zhì)干細(xì)胞對(duì)大鼠乳腺癌前病變組織的作用及影響

林 泉，孔翔玉，莫明添，石身儷，梁海潔，蔡妮娜，陸紅英

（1.廣西愛思特整形外科醫(yī)院美容外科，廣西 南寧，530001；2.廣西南寧七和醫(yī)療美容門診部，廣西 南寧，530001；3.廣西南寧愛瑪莎醫(yī)療美容醫(yī)院美容外科，廣西 南寧，530001）

自體脂肪移植填充是當(dāng)今美容外科的熱點(diǎn)手術(shù)之一，能解決諸多體表凹陷或形體欠飽滿的問題，術(shù)后形體能達(dá)到和諧的美以及面容獲得飽滿的年輕態(tài)。自體脂肪由于是自身組織具備無免疫抗原性、取材容易、量充足等優(yōu)點(diǎn)，已成為整形外科軟組織填充的首選材料。但是，脂肪細(xì)胞的存活率或移植物體積留存率在術(shù)前無法預(yù)知確定，致使其臨床應(yīng)用受到較多限制，據(jù)統(tǒng)計(jì)其吸收率可達(dá)20-90%[1]。自體細(xì)胞輔助脂肪移植技術(shù)（cell-assisted lipotransfer，CAL）解決了存活率低的問題，通過提高待移植脂肪組織中脂肪間充質(zhì)干細(xì)胞等多種血管基質(zhì)成分含量的方式可以顯著提高移植后脂肪的存活率[2]。然而，脂肪間充質(zhì)干細(xì)胞（adipose derived stem or stromal cells，ADSCs）移植雖然能提高移植脂肪組織的成活率，但這種方法對(duì)于乳腺組織，尤其是處于癌前病變期的乳腺組織的作用及影響尚不明確。本實(shí)驗(yàn)應(yīng)用大鼠自體脂肪間充質(zhì)干細(xì)胞移植，觀察其對(duì)乳腺癌前病變組織的作用及影響，結(jié)果報(bào)告如下。

1.材料與方法

1.1 材料

1.1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物

選擇72只雌性未育Wistar大鼠（10周，220±10 g）購(gòu)自廣西醫(yī)科大學(xué)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中心，實(shí)驗(yàn)過程中嚴(yán)格遵守操作流程及倫理標(biāo)準(zhǔn)，大鼠全程自由飲食、進(jìn)水。動(dòng)物證書編號(hào)：SXCK（桂）K2021-0002；SPF動(dòng)物房 22～26℃，相對(duì)濕度 52%～58%；倫理審批號(hào)：gx20210361。

1.1.2 試劑

多聚甲醛溶液（湖北科沃德化工有限公司）、大鼠免疫組化試劑盒（北京百奧萊博科技有限公司）。

1.2 方法

1.2.1 造模方法 通過1 次性胃管灌注DMBA100mg/Kg 的方式構(gòu)建化學(xué)誘導(dǎo)性乳腺癌前病變大鼠模型。

1.2.2 脂肪間充質(zhì)干細(xì)胞制備方法 建模同日，在麻醉情況下，常規(guī)消毒鋪巾，打開實(shí)驗(yàn)組大鼠單側(cè)腹股溝，切取皮下脂肪墊，隨后獲取脂肪組織中的脂肪間充質(zhì)干細(xì)胞并通過流式細(xì)胞儀對(duì)其鑒定。使用CAL技術(shù)，將脂肪間充質(zhì)干細(xì)胞進(jìn)行濃縮提純備用。

1.2.3 移植方法 建模同日，將建模成功的乳腺癌前病變大鼠72 只隨機(jī)分為實(shí)驗(yàn)組和對(duì)照組，每組36 只，在實(shí)驗(yàn)組大鼠第5 對(duì)乳腺組織內(nèi)注射脂肪間充質(zhì)干細(xì)胞1×106，對(duì)照組相同位置注射生理鹽水 0.1ml。

1.2.4 檢測(cè)方法 建模第10 周，處死所有實(shí)驗(yàn)大鼠，無菌操作下切除大鼠第5 對(duì)乳腺及周圍組織，逐一完成以下檢測(cè)。

1.2.4.1 病理學(xué)檢測(cè) 將大鼠第5 對(duì)乳房腺體組織，冰凍切片，進(jìn)行細(xì)胞學(xué)檢查、常規(guī)組織學(xué)檢查。

1.2.4.2 免疫組化法 清洗載玻片，將大鼠第5 對(duì)乳房腺體組織，進(jìn)行固定、脫水、包埋、切片，厚度為5μ m，然后按照撈組織、脫蠟、抗原修復(fù)、血清封閉、加一抗、加二抗、加SABC、加顯色劑、復(fù)染、脫水、封片等步驟逐一完成，詳按試劑盒說明書進(jìn)行操作。封片后，在顯微鏡（200 倍）下隨機(jī)選取5 個(gè)區(qū)域，用圖像分析系統(tǒng)準(zhǔn)確測(cè)定VEGF 平均光密度值。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)處理采用SPSS23.0進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，計(jì)數(shù)資料采用χ2檢驗(yàn)，計(jì)量數(shù)據(jù)以均數(shù)()表示，組間比較采用方差分析，P＜0.05表示差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 病理細(xì)胞學(xué)觀察

實(shí)驗(yàn)組與對(duì)照組大鼠乳腺增生程度無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異（P＞0.05），見表1、圖1.

圖1a 實(shí)驗(yàn)組大鼠乳腺組織病理學(xué)結(jié)果（X200）圖1b 對(duì)照組大鼠乳腺組織病理學(xué)結(jié)果（X200）

表1.大鼠乳腺組織增生程度

2.2 免疫組

化法檢測(cè)乳腺組織內(nèi)血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子VEGF平均光密度結(jié)果與對(duì)照組比較，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）。見表2、圖2。

表2.大鼠乳腺組織增生程度

圖2a 實(shí)驗(yàn)組大鼠乳腺組織VEGF 的表達(dá)（X200）圖2b 對(duì)照組大鼠乳腺組織VEGF 的表達(dá)（X200）

3 討論

乳房作為性器官一直是反映女性體態(tài)美的重要因素，對(duì)稱、圓潤(rùn)、挺拔、和諧的乳房代表著年輕、活力十足而受到所有人的喜愛。隨著社會(huì)文明的進(jìn)步，主動(dòng)追求乳房形態(tài)美感的人群也越來越多。自體脂肪移植隆乳具有損傷小、無排異性、質(zhì)地柔軟等優(yōu)點(diǎn)已成為臨床乳房美化的重要手段和選擇之一。據(jù)統(tǒng)計(jì)，早在2017年全球已進(jìn)行了137070例自體脂肪移植隆乳手術(shù)，占當(dāng)年總隆乳量的8.2%。但脂肪隆乳技術(shù)仍有至今未解決的臨床問題，即存活率及安全性，引發(fā)較多學(xué)者進(jìn)行研究。即使Torsvik和Bjerkvig報(bào)道脂肪間充質(zhì)干細(xì)胞移植物在腫瘤發(fā)生發(fā)展過程中不同階段發(fā)揮不同的作用[3]，也未見臨床報(bào)道脂肪移植增加了乳腺癌的發(fā)生風(fēng)險(xiǎn)[4]。研究已證實(shí)CAL技術(shù)能夠提高自制體脂肪移植隆乳后脂肪組織的存活率，但在乳腺癌發(fā)病率居高不下的背景下，濃縮獲取的脂肪間充質(zhì)干細(xì)胞是否對(duì)乳腺癌前病變組織有促進(jìn)癌變作用或其它影響，應(yīng)當(dāng)展開深入研究。

乳腺癌癌前病變是指乳腺導(dǎo)管內(nèi)上皮細(xì)胞的異常增生，出現(xiàn)形態(tài)學(xué)改變，這些變異增生的部分病例可能發(fā)展成癌的乳腺增生性病變[5]。研究顯示乳腺癌癌前病變組織5年癌變率為6.6%，25年最高癌變率為 46.0%[6]。探究乳腺癌形成的原因，主要是正常乳腺導(dǎo)管上皮細(xì)胞轉(zhuǎn)化為癌細(xì)胞是復(fù)雜的過程，分為不同階段、不同步驟，受較多因素調(diào)控。乳腺癌癌前病變是這一過程中不可缺少的環(huán)節(jié)，且是這一過程是可逆。如果乳腺癌癌前病變加速發(fā)展，則不可避免的發(fā)展為乳腺癌。ADSCs具有自身多方向分化潛能，而且有發(fā)揮旁分泌和免疫調(diào)節(jié)功能，可調(diào)控周圍細(xì)胞增殖分化。那么，移植以脂肪間充質(zhì)干細(xì)胞為主的血管基質(zhì)成分濃度較高的物質(zhì)后，乳腺癌前病變組織在移植物的調(diào)控作用下，局部血管增加或不變，加速向癌變方向轉(zhuǎn)化或是往正常組織轉(zhuǎn)歸最值得觀察。

乳腺癌癌前病變模型的制造學(xué)界一直有爭(zhēng)論，通常分為自發(fā)性模型、誘發(fā)模型或可移植模型三種，李靜蔚等[7]認(rèn)為DMBA誘導(dǎo)的SD大鼠乳腺增生及癌變,造模10周后出現(xiàn)乳腺癌癌前病變,成功率優(yōu)于wister大鼠，但也學(xué)者持不同觀點(diǎn)[8]。本實(shí)驗(yàn)選擇了Wistar大鼠，緣于其體型較SD大鼠短胖大腿內(nèi)側(cè)脂肪相對(duì)較豐富，利于實(shí)驗(yàn)。建立乳腺癌癌前病變模型時(shí)，選擇了1次性胃管灌注DMBA100mg/Kg的方式構(gòu)建化學(xué)誘導(dǎo)性乳腺癌前病變大鼠模型，成模便捷穩(wěn)定。文獻(xiàn)報(bào)道還有利用DMBA+雌孕激素序貫5天組建立乳腺癌癌前病變方法，雖然該方法是建立乳腺癌癌前病變模型較好的方法之一[8]，但耗時(shí)、繁瑣，亦不為首選。

VEGF又稱血管通透因子，能增加血管通透性，而且還可以促進(jìn)細(xì)胞外基質(zhì)變性，也能夠促進(jìn)新生血管形成。VEGF不僅促進(jìn)腫瘤血管生長(zhǎng)，對(duì)乳腺癌細(xì)胞本身也有促進(jìn)作用，與乳腺的發(fā)生、發(fā)展、轉(zhuǎn)移呈正相關(guān)[9]。因此，檢測(cè)VEGF的值可以判斷癌前病變的轉(zhuǎn)歸方向。本實(shí)驗(yàn)的免疫組化結(jié)果提示，VEGF光密度值無明顯變化，這可能是脂肪間充質(zhì)干細(xì)胞移植后可能已直接替代作用參與組織修復(fù)，對(duì)周圍乳腺組織發(fā)揮旁分泌和免疫調(diào)節(jié)功能，調(diào)控組織周圍相關(guān)細(xì)胞改善微循環(huán)等作用參與組織修復(fù)和重建[10,11]，致使乳腺組織局部微循環(huán)得到明顯改善，而不是加速癌前病變向癌癥轉(zhuǎn)歸。因此，運(yùn)用CAL技術(shù)制備的高濃度脂肪間充質(zhì)干細(xì)胞移植物對(duì)乳腺癌前病變起到修復(fù)、抑制及促使增生細(xì)胞逆轉(zhuǎn)的作用，是一種良好的作用。本實(shí)驗(yàn)的研究手段通用可靠，采用的病理檢測(cè)、免疫組化均已被廣泛應(yīng)用與乳腺癌的發(fā)病機(jī)制研究[12-14]，其準(zhǔn)確性得到公認(rèn)。

此外，研究證實(shí)乳腺增生程度與乳腺血液流變學(xué)的諸多因素關(guān)系密切，特別是與乳腺的血液黏稠度、局部微循環(huán)障礙呈正相關(guān)[15]，檢測(cè)乳腺血液流變學(xué)對(duì)乳腺癌癌前病變的診斷、轉(zhuǎn)歸均有積極的意義和重要價(jià)值。在實(shí)體腫瘤乳腺癌發(fā)生前的非典型增生階段，病變組織中已有新血管生成，尤其在中、重度非典型增生及原位癌階段，新生血管明顯增多[7，16]，因此，檢測(cè)局部血管數(shù)量及微循環(huán)可以判斷組織的轉(zhuǎn)歸方向，也可作為腫瘤發(fā)生發(fā)展演變的佐證，需要下一步再研究。

綜上所述，自體脂肪間充質(zhì)干細(xì)胞移植可安全用于乳腺癌前病變組織，不會(huì)導(dǎo)致乳腺癌前病變組織加速向乳腺癌發(fā)展。對(duì)于正常乳腺而言，脂肪隆乳致癌的可能性更低、安全性更高。