基于數(shù)據(jù)庫挖掘EIF2A在結(jié)直腸癌中的表達(dá)及意義

李雨晴,詹 妮,魯鶴臻,李海南,何成彥*,于 庭*

(1.吉林大學(xué)第二醫(yī)院,吉林 長春130041;2.吉林大學(xué)中日聯(lián)誼醫(yī)院,吉林 長春130033;3.天津市人民醫(yī)院)

結(jié)直腸癌(colorectal cancer,CRC)[1]是一種常見的大腸黏膜上皮惡性腫瘤,發(fā)病率和死亡率高[2],是全球相關(guān)癌癥死亡的主要原因之一[3]。在美國,2020年報(bào)告了近15萬例結(jié)直腸癌病例和超過5萬死亡病例,預(yù)計(jì)到2030年,結(jié)直腸癌將有超過220萬新發(fā)病例和110萬死亡病例[4]。由于結(jié)直腸癌患者的早期癥狀比較隱匿,多數(shù)患者確診時(shí)已處于中晚期,死亡率較高[5]。研究表明,早期診斷的腫瘤更有可能治愈[6],因此早期診斷成為了預(yù)后良好的重點(diǎn)。真核翻譯起始因子2A(Eukaryotic translation initiation factor 2A,EIF2A)[7-8]是一種細(xì)胞內(nèi)蛋白,分子量為65 kDa,于20世紀(jì)70年代初第一個(gè)被描述為能夠刺激起始甲基t-RNA i與40S核糖體亞基結(jié)合的翻譯起始因子[9-11],EIF2A m RNA由15或16個(gè)外顯子組成,該基因位于3號(hào)染色體上[8]。研究表明,EIF2A是近年關(guān)注到的與腫瘤進(jìn)展有關(guān)的因子,其不僅能調(diào)節(jié)細(xì)胞的翻譯,還能促進(jìn)腫瘤細(xì)胞的增殖及遷移。為此,本研究基于二維色譜與質(zhì)譜聯(lián)用技術(shù)及生物信息學(xué)分析,進(jìn)行重點(diǎn)探究EIF2A與結(jié)直腸癌的關(guān)系,對(duì)基因及蛋白腫瘤水平進(jìn)行研究分析,以期為結(jié)直腸癌的臨床診治和預(yù)后評(píng)估提供一個(gè)新的方向。

1 資料與方法

1.1利用二維色譜與質(zhì)譜聯(lián)用技術(shù)篩選結(jié)直腸癌組織與配對(duì)癌旁組織中的差異蛋白,癌組織及癌旁組織中同一蛋白的豐度通過圖譜數(shù)來衡量。本研究所用的標(biāo)本來源于在吉林大學(xué)第二醫(yī)院和吉林大學(xué)中日聯(lián)誼醫(yī)院接受手術(shù)治療的結(jié)直腸癌患者手術(shù)切除的新鮮結(jié)直腸癌組織和配對(duì)癌旁組織,共16對(duì),標(biāo)本的采集時(shí)間段為2019年1月到2022年12月,研究經(jīng)醫(yī)院醫(yī)學(xué)倫理委員會(huì)批準(zhǔn),且相關(guān)患者均簽署了知情同意書,并且保證術(shù)前未經(jīng)任何方式治療。

1.2 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析SEQUEST算法計(jì)算二維色譜與質(zhì)譜聯(lián)用的圖譜數(shù)據(jù),采用t檢驗(yàn)分析結(jié)直腸癌組織與正常組織中的表達(dá)差異,采用Pearson法進(jìn)行EIF2A基因表達(dá)相關(guān)性分析。P<0.05 為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

1.3 借助GEO數(shù)據(jù)庫挖掘EIF2A基因GEO是一個(gè)基因表達(dá)數(shù)據(jù)庫和在線資源,可用于檢索任何物種或人造來源基因的表達(dá)數(shù)據(jù),本研究的原始數(shù)據(jù)均從 GEO 數(shù)據(jù)庫下載并通過R 4.2.2集成。

1.4 通過Timer數(shù)據(jù)庫在線分析EIF2A基因在各腫瘤組織中的表達(dá)Timer數(shù)據(jù)庫是系統(tǒng)分析不同癌癥類型的免疫浸潤的綜合資源庫,其中Diff Exp模塊探索腫瘤與正常組織的差異蛋白表達(dá)。

1.5利用GEPIA2數(shù)據(jù)庫獲取EIF2A在結(jié)直腸癌組織中的表達(dá)情況及與EIF2A表達(dá)相關(guān)性高的基因,根據(jù)基因表達(dá)水平進(jìn)行生存分析。

1.6 基于UALCAN 數(shù)據(jù)庫根據(jù)患者的腫瘤分期和淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移狀態(tài)分析正常組織和癌組織中EIF2A的表達(dá)情況UALCAN是一個(gè)全面的、用戶友好的、交互式的網(wǎng)絡(luò)資源,用于分析癌癥組學(xué)數(shù)據(jù)。

1.7 通過The Human Protein Atlas(HPA)數(shù)據(jù)庫探究EIF2A基因在人正常結(jié)直腸組織的表達(dá)情況與在結(jié)直腸癌組織中的表達(dá)情況人類蛋白質(zhì)圖譜包含正常組織和癌癥組織通過免疫組織化學(xué)獲得的組織學(xué)切片圖像。

1.8 利用String 數(shù)據(jù)庫分析與EIF2A相互作用的蛋白網(wǎng)絡(luò)String數(shù)據(jù)庫是一個(gè)搜尋蛋白質(zhì)之間相互作用的數(shù)據(jù)庫[12],可應(yīng)用于2031個(gè)物種,包含960萬種蛋白和1380萬種蛋白質(zhì)之間的相互作用。

2 結(jié)果

2.1本實(shí)驗(yàn)的癌組織及癌旁組織中的同一蛋白的豐度通過圖譜的數(shù)來衡量,兩個(gè)樣品中蛋白圖譜數(shù)比值≥1且蛋白圖譜數(shù)差值≥72是差異蛋白的滿足條件。以此為標(biāo)準(zhǔn),此研究檢測(cè)出包括IMA1、SETD3、KDM1A、CPR56等30個(gè)上調(diào)蛋白,MYH11、SYNM、TPM1、CNN1等23個(gè)下調(diào)蛋白。EIF2A為其中的一個(gè)上調(diào)蛋白,質(zhì)譜圖結(jié)果,見圖1。

圖1 EIF2A質(zhì)譜圖結(jié)果

2.2 EIF2A基因結(jié)構(gòu)及數(shù)據(jù)集的表達(dá)情況EIF2A基因編碼真核翻譯起始因子,催化嘌呤霉素敏感的80 s預(yù)起始復(fù)合物的形成和低濃度Mg2+下聚(U)定向合成多苯丙氨酸。利用GEO數(shù)據(jù)庫可得知EIF2A基因位于3號(hào)染色體,該基因編碼細(xì)胞內(nèi)蛋白,見圖2。

圖2 EIF2A染色體定位及基因數(shù)據(jù)圖譜

2.3 EIF2A在各腫瘤組織中的表達(dá)情況通過Timer數(shù)據(jù)庫分析EIF2A在各腫瘤組織中的表達(dá)情況可知,EIF2A在多種癌組織和癌旁組織中存在差異表達(dá),且在癌組織中表達(dá)上調(diào)。其中EIF2A在結(jié)腸癌和直腸腺癌中均高表達(dá)(P<0.001和P<0.05),見圖3。

圖3 EIF2A在各腫瘤組織中的表達(dá)情況

2.4 在結(jié)直腸癌組織中EIF2A的表達(dá)情況及相關(guān)基因分析通過GEPIA2數(shù)據(jù)庫分析可知EIF2A在結(jié)腸癌及直腸癌組織中均呈上調(diào)表達(dá),見圖4。根據(jù)GEPIA2數(shù)據(jù)庫已經(jīng)分析過的相關(guān)基因,得出與EIF2A基因表達(dá)相關(guān)性最高的4個(gè)基因,分別為NMD3、SLC33A1、U2SURP、CNBP,以上 4 個(gè)基因均與EIF2A基因的表達(dá)呈正相關(guān),即EIF2A基因的表達(dá)量越高,相關(guān)基因的表達(dá)量也隨之升高,見圖5。EIF2A mRNA的表達(dá)與結(jié)直腸癌患者的總生存率(overall survival,OS)和無病生存率(disease free survival,DFS)無相關(guān)性,見圖6。

圖4 EIF2A在結(jié)直腸癌組織中的表達(dá)情況

注:圖A～D分別為NMD3、SLC33A1、U2SURP及CNBP與EIF2A mRNA 表達(dá)水平的關(guān)系

注:A:EIF2A mRNA表達(dá)量與結(jié)直腸癌患者OS的關(guān)系;B:EIF2A mRNA表達(dá)量與結(jié)直腸癌患者DFS的關(guān)系

2.5 蛋白質(zhì)表達(dá)分析根據(jù)EIF2A在結(jié)直腸癌中的不同樣本、結(jié)直腸癌的不同癌癥分期階段、患者年齡及患者種族差異綜合分析出以下數(shù)據(jù),EIF2A主要參與蛋白質(zhì)翻譯,與結(jié)直腸癌的臨床病理特征具有相關(guān)性,推測(cè)EIF2A可能通過調(diào)控不同條件下的腫瘤細(xì)胞周期從而促進(jìn)腫瘤細(xì)胞增殖,進(jìn)而影響患者預(yù)后。其中Z值表示給定癌癥類型樣本中位數(shù)的標(biāo)準(zhǔn)偏差,見圖7。

2.6 EIF2A在結(jié)直腸癌組織中蛋白層面的表達(dá)情況對(duì)HPA數(shù)據(jù)庫中收集的免疫組織化學(xué)圖片進(jìn)行分析,EIF2A蛋白在正常結(jié)直腸組織和典型結(jié)直腸癌組織中的表達(dá)情況,結(jié)果顯示EIF2A在結(jié)直腸癌組織中高度表達(dá),見圖8。

圖8 EIF2A蛋白在結(jié)直腸癌中的表達(dá)情況

2.7 與EIF2A相互作用的蛋白網(wǎng)絡(luò)通過String數(shù)據(jù)庫分析得到EIF2A基因相互作用的蛋白分別有EIF2S1、EIF2S2、EIF2S3、EIF2S3L、RPS6、RPS7、RPS10、RPS13、RPS19、YWHAE。這10個(gè)關(guān)聯(lián)蛋白均屬于蛋白質(zhì)編碼基因,其中與鄰近正常組織相比,屬于核糖體蛋白質(zhì)S19E家族的RPS19在結(jié)直腸癌表達(dá)水平較高。該蛋白網(wǎng)絡(luò)節(jié)點(diǎn)數(shù):11個(gè),邊數(shù):411,平均節(jié)點(diǎn)度:7.45,平均局部聚類系數(shù):0.934,期望邊數(shù):13,PPI富集P值:9.62e-10,此網(wǎng)絡(luò)具有比預(yù)期更多的交互性,見圖9。

圖9 與EIF2A相互作用的蛋白網(wǎng)絡(luò)

3 討論

結(jié)直腸癌是最常見的癌癥類型之一,是在結(jié)腸上皮中連續(xù)獲得明確的基因突變后發(fā)生的一種異質(zhì)性疾病,其特征是多種分子改變,這些改變決定不同信號(hào)通路的失調(diào),導(dǎo)致腫瘤發(fā)生、發(fā)展和侵襲。多種遺傳因素與結(jié)直腸癌的發(fā)生相關(guān),包括BRAF突變、微衛(wèi)星不穩(wěn)定性(MSI)、KRAS突變和PIK3CA突變[3],不同遺傳水平上腫瘤間和腫瘤內(nèi)的高度變異性凸顯了腫瘤復(fù)雜的分子生物學(xué),而這又影響了腫瘤對(duì)治療的應(yīng)答和患者生存期。雖然結(jié)直腸癌是一種可預(yù)防的疾病[13],但在美國和全球范圍內(nèi),它仍然是癌癥死亡的第二大原因[14-15],約20%的患者以轉(zhuǎn)移性結(jié)直腸癌為初始臨床表現(xiàn)[16]。此外,高達(dá)50%的局限性疾病患者最終會(huì)發(fā)生轉(zhuǎn)移,終生風(fēng)險(xiǎn)約為4%～5%[17]。

真核生物蛋白質(zhì)合成起始是一個(gè)復(fù)雜的過程[9],需要12種以上的起始因子,包含30多種多肽鏈。EIF2A蛋白N端為具有S1型寡核苷酸/寡糖結(jié)合折疊子(OB)結(jié)構(gòu)域和α螺旋結(jié)構(gòu)域,C端為α折疊結(jié)構(gòu)域,α亞基為調(diào)節(jié)亞基和功能位點(diǎn),研究表明,EIF2A通過MHC-1類分子參與抗原提呈、應(yīng)激反應(yīng)和腫瘤的發(fā)生[18],具有調(diào)節(jié)腫瘤細(xì)胞增殖的作用,在人類癌癥模型中,EIF2A在多種癌癥類型中高度表達(dá),其表達(dá)的升高可能與癌細(xì)胞適應(yīng)性增加有關(guān),這些均提示EIF2A基因在腫瘤的發(fā)生發(fā)展過程中可能作為促癌因子發(fā)揮作用,然而,EIF2A在細(xì)胞功能中的作用仍然是一個(gè)謎[19]。

綜上所述,EIF2A蛋白是結(jié)直腸癌組織與癌旁組織的差異蛋白,在結(jié)直腸癌中呈現(xiàn)高表達(dá),與結(jié)直腸癌的發(fā)生發(fā)展存在一定的關(guān)系,有望成為結(jié)直腸癌的預(yù)后評(píng)估和臨床診治的有效靶點(diǎn)。但本文僅僅通過二維色譜與質(zhì)譜聯(lián)用技術(shù)篩選差異蛋白及生物信息學(xué)方法進(jìn)行初步分析,仍有待后續(xù)實(shí)驗(yàn)進(jìn)一步證實(shí)。