解毒護肝方防治APAP致藥物性肝損傷作用與腸道微生態的相關性探討*

石家莊醫學高等專科學校

胡巍巍 彪雅寧△ 彭小園△△ 巨 曉△△△ 劉晨旭△ 路 帥 張一昕△(石家莊 050599)

提要 目的：探討解毒護肝方防治藥物性肝損傷(DILI)的作用與腸道微生態的相關性。方法：60只C57BL/6N小鼠隨機分為正常組、模型組、水飛薊賓組及解毒護肝方低、中、高劑量組。采用對乙酰氨基酚(APAP)藥液灌胃復制DILI模型，造模同時給予相應藥物治療，連續14 d。半自動生化儀檢測血清中丙氨酸氨基轉移酶(ALT)、天門冬氨酸氨基轉移酶(AST)、總膽紅素(TBIL)和直接膽紅素(DBIL)的含量或活性，蘇木素-伊紅(HE)染色法觀察肝臟病理形態，16SrRNA測序法分析糞便中腸道菌群組成結構。結果：與正常組比，模型組小鼠血清中ALT、AST、DBIL、TBIL的含量或活性均顯著升高(P<0.01)，肝細胞內可見大量的嗜酸性變和炎性細胞浸潤，Chao1、Observed species、Simpson和Shannon指數均顯著降低(P<0.01或P<0.05)，厚壁菌門、變形菌門相對豐度以及厚壁菌門/擬桿菌門(F/B)值均明顯升高(P<0.01或P<0.05)，擬桿菌門相對豐度明顯降低(P<0.05)。與模型組比，解毒護肝方能顯著改善肝組織病理損傷，顯著降低血清中ALT、AST、DBIL、TBIL的含量或活性(P<0.01或P<0.05)，顯著升高Chao1、Observed species、Simpson、Shannon指數以及擬桿菌門相對豐度(P<0.01或P<0.05)，顯著降低厚壁菌門、變形菌門相對豐度以及F/B值(P<0.01)。相關性分析結果表明，厚壁菌門、變形菌門相對豐度與肝損傷標志物成正相關，而擬桿菌門相對豐度與肝損傷標志物成負相關。結論：解毒護肝方防治DILI的機制可能與改善腸道菌群失衡有關。

藥物性肝損傷(DILI)是最常見的藥物不良反應之一，我國大陸住院患者的DILI年發病率約為23.80/(10萬)人，占臨床急性肝損傷的50%以上，已成為嚴重威脅人們身體健康的公共衛生問題[1]。對乙酰氨基酚(APAP)是臨床上常用的解熱鎮痛藥，在多種感冒藥中均存在，正常劑量下安全有效，一旦重復用藥或錯誤用藥導致APAP在肌體含量過高，就會損傷肝臟。在西方國家，APAP已成為臨床上造成的急性DILI患者比例較大的藥物之一，但其發病較急，就醫時常常錯過最佳救治時間。因此，積極開發防治APAP致DILI的藥物為當前DILI治療領域的研究重點。

DILI發病是一個多因素、多機制的復雜過程，新近研究表明DILI發病過程中伴隨腸道菌群失調現象，腸道菌群失調后可通過內毒素血癥、膽汁酸代謝、脂質代謝等參與DILI的發生[2-3]。課題組以茵陳蒿湯、小柴胡湯和逍遙丸為基礎，加減化裁自擬解毒護肝方。茵陳蒿湯、小柴胡湯和逍遙散均可改善肝損傷[4-6]，且前期研究已證實該方對APAP誘導的肝損傷大鼠有一定的保肝效果[7]。本實驗選用APAP誘導DILI模型，從腸道微生態的角度探討解毒護肝方防治DILI的機制，進一步明確其作用機制。

1 材料與方法

1.1 實驗動物 60只SPF級C57BL/6N小鼠，雄性，體質量20～24 g，購自北京維通利華實驗動物技術有限公司，合格證號：110011210101691148，許可證號：SCXK(京)2016-0006。

1.2 實驗藥物 解毒護肝方組成：柴胡、五味子、生甘草各10 g，炒白芍、炒白術、丹參、生黃芪、楮實子、茵陳各15 g，田基黃30 g。方中所用藥物均為廣東一方制藥有限公司生產的中藥配方顆粒，批號分別為1030913、1010233、17120058、0122303、1030293、1012143、18010046、11080711、1016583、0075913。水飛薊賓膠囊(天津天士力圣特制藥有限公司，35 mg/粒，批號：750709172)；對乙酰氨基酚片(石藥集團歐意藥業有限公司，0.5 g/片，批號：016171002)。

1.3 實驗試劑 丙氨酸氨基轉移酶(ALT)、天門冬氨酸氨基轉移酶(AST)、總膽紅素(TBIL)、直接膽紅素(DBIL)試劑盒(批號分別為201001、201201、201002、210101)購自深圳市庫貝爾生物科技股份有限公司；QIAampDNA提取試劑盒購于上海恒斐生物科技有限公司；瓊脂糖凝膠試劑、瓊脂糖凝膠電泳緩沖液(批號分別為AM9870、75510-019)均購于賽默飛世爾科技公司。

1.4 實驗儀器 Humalyzer2000型半自動生化儀(德國Millimeter Mike公司)；1-15K型高速冷凍離心機(美國Sigma公司)；RM2016型切片機(上海徠卡儀器有限公司)；DP73型數碼顯微鏡(日本OlymPus公司)；Illumina MiSeq型測序儀(美國Illumina公司)。

1.5 動物分組、造模與給藥 60只小鼠隨機分為正常組、模型(APAP)組、水飛薊賓組(0.144 g/kg)、解毒護肝方低、中和高劑量組(1.11、2.22、4.44 g/kg)，每組10只。上午各給藥組給予相應藥物灌胃，正常組和模型組給予等量蒸餾水灌胃；下午除正常組外，其余組均給予APAP(600 mg/kg)灌胃，建立DILI模型，正常組給予等量蒸餾水，給藥體積10 mL/kg，給藥14 d。

1.6 標本采集 實驗結束后，摘眼球取血，離心以收集血清；取血后，迅速剖取肝組織用4%多聚甲醛固定；收集結腸內容物于無菌凍存管中，-80 ℃保存。

1.7 指標檢測及方法

1.7.1 血清和肝組織生化指標檢測：半自動生化分析儀檢測小鼠血清中ALT、AST、TBIL、DBIL的活性或含量。

1.7.2 HE染色法觀察肝組織的病理形態學變化：固定好的肝組織進行常規脫水，石蠟包埋，切片，HE染色，光鏡下觀察結果。

1.7.3 糞便DNA提取與16SrRNA測序分析：根據治療效果，選用正常組、模型組和治療效果較好的高劑量組的小鼠糞便進行腸道菌群分析。按照說明使用OMEGA Soil DNA試劑盒提取腸道內容物中DNA樣本，1.2%瓊脂糖凝膠電泳檢測DNA提取質量，用338F和806R對所提取DNA中V3-V4區進行PCR擴增。擴增完成后使用Vazyme VAHTSTM DNA 清潔珠純化，并用Quant-it PicoGreen dsDNA檢測試劑盒進行定量。根據定量結果，對各樣本進行等量混樣，采用Illumina MiSeq測序平臺進行測序。

2 結果

2.1 各組小鼠血清ALT、AST活性和TBIL、DBIL含量變化 與正常組比，模型組小鼠血清中AST、ALT、TBIL、DBIL含量或活性明顯升高(P<0.01)；與模型組比，各用藥組小鼠血清中AST、ALT、TBIL、DBIL含量或活性明顯下降(P<0.01或P<0.05)，詳見表1。

表1 各組小鼠血清ALT、AST、TBIL和DBIL活性或含量的比較

2.2 各組大鼠肝臟病理形態學變化 正常組小鼠肝小葉結構清晰，肝細胞呈放射狀排列，肝細胞未見病變。模型組小鼠肝細胞排列紊亂，可見嗜酸性變和炎性細胞浸潤，偶見點狀壞死；各用藥組小鼠肝細胞排列趨于整齊，嗜酸性變和炎性細胞浸潤現象均減輕，見圖1。

注：A.正常組；B.模型組；C.水飛薊賓組；D.低劑量組；E.中劑量組；F.高劑量組。圖1 各組小鼠肝組織病理形態變化(HE×200)

2.3 Alpha多樣性分析 Alpha多樣性指數中，Chao1、Observed species、Simpson和Shannon指數數值越大，說明物種豐富度和多樣性越高。結果顯示，與正常組比，模型組小鼠Chao1、Observed species、Simpson和Shannon指數均明顯降低(P<0.01或P<0.05)，與模型組比，解毒護肝方組小鼠Chao1、Observed species、Simpson和Shannon指數均明顯升高(P<0.01或P<0.05)，詳見表2。

表2 各組小鼠Alpha多樣性指數比較

2.4 OTU水平上的Venn圖分析 由圖2可知，正常組OTU數量為14 780個，模型組OTU數量為5 906個，解毒護肝方組OTU數量為10 857個，表明解毒護肝方可提高腸道菌群物種的多樣性，這一結果與Alpha多樣性分析結果相一致。

2.5 各組大鼠腸道菌群組成結構分析和相關性分析 在門分類學水平上，厚壁菌門(Firmicutes)、變形菌門(Proteobacteria)和擬桿菌門(Bacteroidetes)為相對豐度較高的菌群。與正常組比，模型組小鼠糞便內厚壁菌門、變形菌門相對豐度以及厚壁菌門/擬桿菌門(F/B)值均顯著升高(P<0.01或P<0.05)，擬桿菌門相對豐度明顯降低(P<0.05)；與模型組比，解毒護肝方組小鼠厚壁菌門、變形菌門相對豐度以及F/B值均顯著降低(P<0.01)，擬桿菌門相對豐度明顯升高(P<0.01)，詳見表3。

注：C.正常組；M.模型組；J.解毒護肝方組。圖2 各組小鼠腸道菌群在OTU水平的Venn圖

表3 各組小鼠糞便主要菌群相對豐度和F/B值比較

相關性分析結果表明，厚壁菌門、變形菌門相對豐度與肝損傷標志物成正相關并有統計學差異(P<0.01或P<0.05)，擬桿菌門相對豐度與肝損傷標志物成負相關，其中與ALT活性以及TBIL、DBIL含量有統計學差異(P<0.01或P<0.05)，見圖3。

注：r<0為負相關，r>0為正相關；*P<0.05，**P<0.01。圖3 Spearman's 相關性分析熱圖

3 討論

中醫學中并沒有DILI這一病名，根據其致病特點及臨床癥狀，將其歸為“脅痛”“黃疸”“藥毒”等范疇。DILI的發生多是由于藥毒經口，戕伐脾胃，土壅木郁，傳病到肝，肝失疏泄，致氣滯血瘀，水液代謝異常，臟腑功能失司；或藥毒侵襲，經表入體，直中于肝，木遏土壅，脾失健運，濕濁內生，蘊久化熱，瘀毒內結所致。因此DILI主要病位在肝，并與脾密切相關，肝郁脾虛、濕熱毒瘀為其主要病機，治宜疏肝健脾、清熱祛濕、解毒化瘀。解毒護肝方中柴胡疏肝行氣，為君藥。炒白芍、五味子養血柔肝以滋肝陰，防柴胡疏泄之力過強而耗傷肝陰，生黃芪、炒白術健脾益氣，4藥合用，柔肝養血、健脾益氣，共為臣藥。茵陳、田基黃清熱祛濕、調肝化濁，絕濕濁之源，楮實子清肝熱、瀉肝火，丹參活血祛瘀，共為佐藥。生甘草清熱解毒、調和諸藥，為使藥。全方調肝和脾、清熱除濕，疏泄同時又兼有收斂之性，疏泄合宜，開闔有度，共奏疏肝解郁、健脾祛濕之效。現代藥理研究表明，解毒護肝方中多種藥物均能改善APAP致肝損傷，如柴胡水煎液可減少APAP毒性產物產生，以緩解APAP致肝損傷[8]；五味子丙素、楮實子和黃芪甲苷可通過抗炎或抗氧化作用治療APAP致肝損傷[9-11]。因此，本實驗選用解毒護肝方為該病的治療方劑。

ALT和AST為診斷肝損傷的敏感指標，肝細胞受損時，肝細胞膜完整性破壞，二者釋放入血，ALT和AST活性升高[12]。肝臟有清除血中膽紅素的作用，當肝細胞受損，肝臟對膽汁酸代謝不足時，血中膽紅素含量升高，其中TBIL和DBIL可反映肝臟代謝膽紅素的能力以及肝細胞損傷情況[13]。本實驗結果表明，模型組小鼠血清中ALT、AST、DBIL和TBIL活性或含量均明顯升高，肝細胞內出現嗜酸性變和炎性細胞浸潤，提示DILI模型建立成功；解毒護肝方可明顯降低小鼠血清中ALT、AST、DBIL和TBIL活性或含量，改善肝臟病理損傷，揭示解毒護肝方有較好的護肝效果。

1998年Marshal提出了“腸-肝軸”理論，這代表了肝臟與腸道的雙相通信：腸道菌群失調后可影響肝功能，肝臟疾病也可誘發或加重菌群失調[14]。腸道菌群失調后，可通過脂多糖外漏和腸道代謝物失衡直接影響藥物代謝，促進炎癥反應和氧化應激，加重肝損傷[15]。在APAP誘導大鼠肝損傷中，腸道菌群失調可增加甲酚的產生來降低APAP的磺化作用，導致APAP在肝臟中堆積，加重肝損傷[16]；已有研究證實，糾正腸道菌群失衡，可能成為防治DILI的潛在靶點，補充益生菌可降低伊立替康所致的肝臟毒性[17]；APAP致肝損傷小鼠經過糞菌移植后肝損傷程度得到改善[18]。在腸道菌群中，厚壁菌門和擬桿菌門為優勢菌門，約占腸道菌群總數的90%以上，二者的比值可用于評估肌體是否存在腸道菌群失調[19-20]。同時，肝病的惡化程度與擬桿菌門相對豐度降低成反比[21]。也有學者提出以變形菌門相對豐度增加作為衡量腸道菌群失調的生物性標志，變形菌門以革蘭陰性桿菌居多，能夠產生脂多糖，增加腸源性內毒素的含量，引發腸源性內毒素血癥，加重肝臟損傷[22]。本研究結果顯示，模型組小鼠腸道菌群的豐富度和多樣性均降低，同時厚壁菌門和變形菌門相對豐度以及F/B值均明顯升高，而擬桿菌門相對豐度明顯降低，表明APAP誘導的DILI小鼠確實存在腸道菌群失調現象。解毒護肝方給藥治療后，Alpha多樣性指數和擬桿菌門相對豐度均明顯升高，厚壁菌門和變形菌門相對豐度以及F/B值均明顯降低，提示解毒護肝方可改善腸道菌群紊亂。腸道菌群與肝功能相關性分析結果表明，厚壁菌門和變形菌門相對豐度與肝損傷標志物成正相關，擬桿菌門相對豐度與肝損傷標志物成負相關，可見解毒護肝方的保肝作用與腸道菌群密切相關。綜上可知，解毒護肝方可能通過調節腸道菌群結構，從而發揮保肝的作用。