Irisin對C2C12細(xì)胞胰島素抵抗的影響

何 茜 王 梅 吳 煉

（貴州省人民醫(yī)院內(nèi)分泌科，貴州 貴陽 550002）

胰島素抵抗是2型糖尿病病理生理機(jī)制中的關(guān)鍵環(huán)節(jié)，骨骼肌、肝臟和脂肪組織是胰島素作用的3個(gè)重要靶器官，在胰島素的作用下，這些組織對葡萄糖的攝取及代謝能力減弱，需要更多胰島素方能維持機(jī)體葡萄糖穩(wěn)態(tài)的狀態(tài)稱為胰島素抵抗[1-2]。全身葡萄糖攝取的90%以上在骨骼肌完成[3]，因此，在胰島素刺激下，骨骼肌對葡萄糖的攝取、轉(zhuǎn)運(yùn)以及代謝能力下降是造成機(jī)體葡萄糖代謝紊亂的重要原因[4]。

鳶尾素（irisin）是2012年新發(fā)現(xiàn)的肌因子，由112個(gè)氨基酸組成，可誘導(dǎo)脂肪細(xì)胞產(chǎn)熱并激活脂肪細(xì)胞棕色化程序[5]，因而，其在肥胖及糖尿病等代謝性疾病的治療方面被寄予厚望[6]。C2C12是小鼠成肌細(xì)胞系的亞株，是體外研究骨骼肌胰島素抵抗發(fā)病機(jī)制的理想細(xì)胞模型[7]。本研究旨在探討irisin對C2C12細(xì)胞胰島素抵抗的影響，以期為irisin與糖代謝的關(guān)系提供更多理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)材料 小鼠成肌細(xì)胞C2C12，購自中國科學(xué)院細(xì)胞庫。

1.2 試劑 DMEM完全高糖培養(yǎng)基及DMEM不完全高糖培養(yǎng)基（江蘇凱基生物技術(shù)股份有限公司）；1×PBS（0.01 M，pH 7.4）（江蘇凱基生物技術(shù)股份有限公司）；特級(jí)馬血清（北京索萊寶科技有限公司）；胎牛血清（美國 Scien Cell公司）；胰島素（美國Glpbio 公司）；重組 irisin（美國Peprotech公司）；2-NBDG（上海源葉生物科技有限公司）；棕櫚酸（上海源葉生物科技有限公司）。

1.3 主要儀器 CO2培養(yǎng)箱（上海一恒科學(xué)儀器有限公司）；倒置顯微鏡（廣州市明美光電有限公司）；NovoCyteTM流式細(xì)胞儀[艾森生物（杭州）有限公司]。

1.4 實(shí)驗(yàn)方法

1.4.1 C2C12細(xì)胞的生長與誘導(dǎo)分化 在37 ℃ 5%CO2條件下，用含10%胎牛血清、100 U/mL青霉素、100 μg/mL鏈霉素的高糖DMEM培養(yǎng)基培養(yǎng)小鼠成肌細(xì)胞C2C12，每1～2 d更換培養(yǎng)液，依細(xì)胞生長情況傳代。實(shí)驗(yàn)用細(xì)胞棄去原培養(yǎng)上清，用1×PBS洗滌兩遍，用0.25%胰酶（含0.02% EDTA）消化2～3 min，加入培養(yǎng)基終止消化，懸起細(xì)胞；將細(xì)胞收集至10 mL離心管中，以1 000轉(zhuǎn)/分的轉(zhuǎn)速離心3 min，棄盡上清，加入培養(yǎng)基，用吸管吹勻；將細(xì)胞懸液稀釋至適當(dāng)?shù)募?xì)胞密度，然后加至準(zhǔn)備好的培養(yǎng)板中，置于37 ℃ 5%CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。待細(xì)胞匯合時(shí)，換為含2%馬血清的培養(yǎng)液誘導(dǎo)，每2 d更換一次誘導(dǎo)液，4 d后在倒置顯微鏡下觀察細(xì)胞形態(tài)，直至細(xì)胞分化為多核肌管細(xì)胞。

1.4.2 C2C12細(xì)胞胰島素抵抗模型的建立 將分化后的C2C12細(xì)胞分為對照組和胰島素抵抗模型組，用DMEM高糖培養(yǎng)基培養(yǎng)對照組，用含250 μM棕櫚酸的DMEM高糖培養(yǎng)液培養(yǎng)胰島素抵抗模型組細(xì)胞；培養(yǎng)24 h后，兩組細(xì)胞用100 nmol/L胰島素孵育30 min，用50 μM熒光葡萄糖類似物2-NBDG處理細(xì)胞30 min，采用流式細(xì)胞儀檢測細(xì)胞平均熒光強(qiáng)度。

1.4.3 Irisin不同濃度對胰島素抵抗C2C12細(xì)胞葡萄糖攝取的影響 用不同濃度（0 nmol/L、2.5 nmol/L、5 nmol/L、10 nmol/L）重組irisin處理胰島素抵抗C2C12細(xì)胞24 h，然后用100 nmol/L胰島素孵育30 min，再用50 μM 2-NBDG處理30 min，采用流式細(xì)胞儀檢測細(xì)胞平均熒光強(qiáng)度。

1.4.4 Irisin不同處理時(shí)長對胰島素抵抗C2C12細(xì)胞葡萄糖攝取的影響 將胰島素抵抗C2C12 細(xì)胞以5 nmol/L重組irisin分別處理0 h、1 h、4 h、24 h，然后用100 nmol/L胰島素孵育30 min，再用50 μM 2-NBDG處理30 min，采用流式細(xì)胞儀檢測細(xì)胞平均熒光強(qiáng)度。

1.5 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析 統(tǒng)計(jì)分析采用SPSS 22.0軟件進(jìn)行。數(shù)據(jù)用（）表示。采用獨(dú)立樣本t檢驗(yàn)進(jìn)行兩組間的比較，單因素方差分析（ANOVA）進(jìn)行多組間的比較，LSD檢驗(yàn)進(jìn)行兩兩比較。以雙側(cè)P＜0.05表示差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 C2C12細(xì)胞胰島素抵抗模型的建立 C2C12細(xì)胞經(jīng)棕櫚酸處理24 h，采用流式細(xì)胞儀檢測細(xì)胞平均熒光強(qiáng)度，評(píng)估細(xì)胞對2-NBDG的攝取。與對照組比較，胰島素抵抗模型組葡萄糖攝取顯著降低（t=29.114，P＜0.001），提示胰島素抵抗模型建立成功。見表1。

2.2 不同濃度重組irisin對胰島素抵抗C2C12細(xì)胞葡萄糖攝取的影響 以不同濃度（0 nmol/L、2.5 nmol/L、5 nmol/L、10 nmol/L）重組irisin處理胰島素抵抗C2C12細(xì)胞24 h，采用流式細(xì)胞儀檢測細(xì)胞平均熒光強(qiáng)度。如圖2所示，5 nmol/L及10 nmol/L重組irisin均可減輕棕櫚酸對C2C12細(xì)胞葡萄糖攝取的抑制。

圖1 棕櫚酸對 C2C12 細(xì)胞葡萄糖攝取能力的影響（n=3，）

圖2 不同濃度irisin對胰島素抵抗C2C12細(xì)胞葡萄糖攝取的影響（n=3，）

2.3 重組Irisin不同處理時(shí)長對胰島素抵抗C2C12細(xì)胞葡萄糖攝取的影響 以5 nmol/L重組irisin處理胰島素抵抗C2C12細(xì)胞不同時(shí)長（分別為0 h、1 h、4 h及24 h），采用流式細(xì)胞儀檢測細(xì)胞平均熒光強(qiáng)度。如圖3所示，重組irisin以時(shí)間依賴的方式改善棕櫚酸對C2C12細(xì)胞葡萄糖攝取的抑制，以24 h的作用最強(qiáng)。

圖3 Irisin不同處理時(shí)長對胰島素抵抗C2C12細(xì)胞葡萄糖攝取的影響（n=3，）

3 討論

胰島素抵抗是2型糖尿病重要的病理生理機(jī)制之一，胰島素在靶組織中的作用減弱是胰島素抵抗的本質(zhì)和始動(dòng)因素[8]。作為胰島素作用的重要靶器官之一，骨骼肌對葡萄糖的攝取、轉(zhuǎn)運(yùn)以及代謝能力下降被認(rèn)為是2型糖尿病發(fā)生的重要胰腺外因素[9]。骨骼肌質(zhì)量約占健康成人體質(zhì)量的40%～50%。研究發(fā)現(xiàn)，運(yùn)動(dòng)可使肌纖維收縮，從而產(chǎn)生和釋放數(shù)百種細(xì)胞因子或多肽，稱為肌因子，可發(fā)揮自分泌、旁分泌或內(nèi)分泌效應(yīng)。因此，骨骼肌也逐漸被視為重要的內(nèi)分泌器官[10-12]。

Irisin的前體Ⅲ型纖連蛋白結(jié)構(gòu)域包含蛋白5（Fibronectin type Ⅲ domain-containing protein 5，F(xiàn)NDC5）高表達(dá)于骨骼肌。FNDC5屬Ⅰ型膜蛋白，在蛋白水解酶的作用下，經(jīng)C-末端剪切后成為含112個(gè)氨基酸的多肽片段，并經(jīng)糖基化修飾后釋放入血，這一多肽片段被命名為irisin[5,13]。早期研究發(fā)現(xiàn)，irisin可誘導(dǎo)白色脂肪細(xì)胞棕色化，增加產(chǎn)熱以及能量消耗，可使高脂飲食誘導(dǎo)的肥胖小鼠體質(zhì)量減輕、血糖及胰島素水平下降，胰島素抵抗獲得改善[5]。后續(xù)研究發(fā)現(xiàn)，irisin還可作用于骨骼肌、肝臟、胰腺等多個(gè)器官及組織，通過多種病理生理機(jī)制發(fā)揮維持葡萄糖穩(wěn)定的作用[14-15]。

棕櫚酸是一種飽和游離脂肪酸，可對胰島素信號(hào)通路產(chǎn)生抑制效應(yīng)，從而誘發(fā)胰島素抵抗[16]。棕櫚酸誘導(dǎo)的骨骼肌細(xì)胞胰島素抵抗模型是一種理想的體外胰島素抵抗模型，被廣泛用于探索骨骼肌胰島素抵抗的潛在機(jī)制[17]。而C2C12是小鼠成肌細(xì)胞系的亞株，是體外研究骨骼肌胰島素抵抗的理想細(xì)胞模型[7]。

本研究發(fā)現(xiàn)，棕櫚酸可顯著降低胰島素刺激下骨骼肌細(xì)胞對熒光葡萄糖類似物2-NBDG的攝取，誘導(dǎo)胰島素抵抗，與既往研究[18-19]一致。重組irisin以濃度依賴的方式減輕棕櫚酸對C2C12細(xì)胞葡萄糖攝取的抑制，5 nmol/L及10 nmol/L重組irisin均可發(fā)揮這一效應(yīng)，與Xin等[20]的研究結(jié)果相符。另一項(xiàng)研究也表明，irisin的過表達(dá)可增加棕櫚酸誘導(dǎo)的胰島素抵抗C2C12細(xì)胞的葡萄糖攝取，改善胰島素抵抗[21]。Ye等[22]進(jìn)行的研究采用高胰島素建立C2C12細(xì)胞胰島素抵抗模型，隨后用不同濃度重組irisin處理細(xì)胞，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，irisin可顯著增加胰島素刺激下C2C12細(xì)胞的葡萄糖攝取。本研究還發(fā)現(xiàn)，重組irisin減輕棕櫚酸對C2C12細(xì)胞葡萄糖攝取的抑制、改善胰島素抵抗的作用呈時(shí)間依賴性，尤以24 h的作用最為顯著。

綜上所述，本研究證實(shí)了irisin可減輕棕櫚酸誘導(dǎo)的C2C12細(xì)胞胰島素抵抗，為irisin與糖代謝的關(guān)系提供了一定理論基礎(chǔ)，未來還需深入研究irisin減輕骨骼肌胰島素抵抗、改善葡萄糖代謝的分子機(jī)制。