基于網(wǎng)絡(luò)藥理探討菟藤方治療結(jié)直腸癌的作用機(jī)制

王曦妤 吳 行 石 齊 曾海倫 侯風(fēng)剛

（1 上海中醫(yī)藥大學(xué)附屬寶山醫(yī)院，上海 201999；2 上海市靜安區(qū)中醫(yī)醫(yī)院，上海 200072；3 上海中醫(yī)藥大學(xué)附屬市中醫(yī)醫(yī)院，上海 200071)

中醫(yī)藥已成為結(jié)直腸癌綜合治療中不可或缺的部分，被社會(huì)廣泛認(rèn)可，需求巨大[1-2]。侯風(fēng)剛教授認(rèn)為轉(zhuǎn)移性腸癌病機(jī)在于“腎虛毒結(jié)，挾濕挾瘀”[3-4]，以“補(bǔ)腎解毒，祛濕化瘀”為治法的經(jīng)驗(yàn)方——菟藤方（TTF），臨床研究發(fā)現(xiàn)能延長(zhǎng)患者生存期[5]，但其作用機(jī)制仍需進(jìn)一步研究。本研究基于網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)篩選TTF的活性成分和潛在作用靶點(diǎn)，分析關(guān)鍵蛋白涉及的生物學(xué)功能及信號(hào)通路，為進(jìn)一步揭示菟藤方抑制結(jié)直腸癌侵襲轉(zhuǎn)移的藥理機(jī)制提供理論基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 中藥潛在有效成分及作用靶點(diǎn)篩選 登錄中藥數(shù)據(jù)庫(kù)及分析平臺(tái)系統(tǒng)藥理學(xué)（TCMSP）[6]，搜索菟藤方中的菟絲子、藤梨根、桑寄生、蛇舌草、預(yù)知子、芡實(shí)、黑豆這7味中藥的潛在活性成分及潛在成分作用靶點(diǎn)。篩選標(biāo)準(zhǔn)：口服生物利用度（OB）≥30%，類藥藥性（DL）≥0.18。蟲類藥全蝎潛在有效成分及作用靶點(diǎn)篩選，則通過(guò)文獻(xiàn)[7]及化學(xué)專業(yè)數(shù)據(jù)庫(kù)網(wǎng)查詢獲得全蝎有效成分的分子結(jié)構(gòu)式。SwissADME網(wǎng)站以高胃腸道吸收（GI absorption HIGH）并且在類藥性（Druglikeness）的5項(xiàng)評(píng)分中（Lipinski、Ghose、Veber，Egan、Muegge）至少兩項(xiàng)為yes的成分作為篩選標(biāo)準(zhǔn)，確定全蝎的潛在有效成分，建立菟藤方活性成分——靶點(diǎn)數(shù)據(jù)庫(kù)。

1.2 腸癌相關(guān)基因整合 整合GeneCards[8]、OMIM[9]、PharmGkb[10]、TTD[11]、DrugBank，數(shù)據(jù)庫(kù)腸癌相關(guān)基因合并，得到腸癌基因數(shù)據(jù)庫(kù)。

1.3 中藥復(fù)方調(diào)控網(wǎng)絡(luò) 通過(guò)UniProt[12]數(shù)據(jù)庫(kù)，將TCMSP獲得的藥物作用靶點(diǎn)的基因全稱轉(zhuǎn)化為gene symbol——基因名稱的唯一縮寫。再將菟藤方活性成分—靶點(diǎn)數(shù)據(jù)庫(kù)與腸癌基因數(shù)據(jù)庫(kù)取交集，得到菟藤方作用于腸癌的相關(guān)基因。Cytoscape繪制“中藥有效成分——靶點(diǎn)基因”調(diào)控網(wǎng)絡(luò)圖。

1.4 蛋白互作網(wǎng)絡(luò)（PPI）通過(guò)String網(wǎng)站，物種選擇人類，設(shè)置置信度=0.7，隱藏落單節(jié)點(diǎn)進(jìn)行篩選，構(gòu)建“菟藤方-腸癌”靶點(diǎn)蛋白互作網(wǎng)絡(luò)，并將數(shù)據(jù)導(dǎo)入Cytoscape，使用CytoNCA 插件優(yōu)化。選擇插件里的中介中心性、接近中心性、點(diǎn)度中心性、特征向量中心度、局部平均連接、網(wǎng)絡(luò)中心性這6項(xiàng)參數(shù)進(jìn)行打分過(guò)濾，得分均大于中位數(shù)的基因保留，篩選兩次后保留的基因定義為PPI網(wǎng)絡(luò)核心基因。

1.5 GO生物過(guò)程富集分析及KEGG通路富集分析 使用R軟件中的Goplot插件，調(diào)用GO及KEGG數(shù)據(jù)庫(kù)[13]，富集菟藤方作用于腸癌的相關(guān)基因的通路信息，以P＜0.05 為顯著富集標(biāo)準(zhǔn)。

2 結(jié)果

2.1 菟藤方的潛在成分及靶點(diǎn) TCMSP數(shù)據(jù)庫(kù)篩選出菟藤方的潛在有效成分分別為菟絲子11種、藤梨根6種、桑寄生2種、蛇舌草7種、預(yù)知子6種、芡實(shí)2種、黑豆13種；文獻(xiàn)及各數(shù)據(jù)庫(kù)篩選全蝎潛在活性成分12種，各中藥潛在有效成分表見(jiàn)表1。對(duì)潛在有效成分進(jìn)行靶點(diǎn)預(yù)測(cè)，分別為菟絲子10種、藤梨根6種、桑寄生2種、蛇舌草5種、預(yù)知子4種、芡實(shí)2種、黑豆12種、全蝎12種，共得到1 630個(gè)作用靶點(diǎn)。

表1 菟藤方潛在有效化學(xué)成分

2.2 腸癌相關(guān)基因數(shù)據(jù)庫(kù) 菟藤方篩選出的1 630個(gè)潛在作用靶點(diǎn)，通過(guò)UniProt數(shù)據(jù)庫(kù)將基因全稱轉(zhuǎn)換gene symbol后，剔除重復(fù)值，剩余319個(gè)靶點(diǎn)基因，與5個(gè)數(shù)據(jù)庫(kù)篩篩選獲得的9 550個(gè)腸癌相關(guān)基因取交集，得出菟藤方作用于腸癌的潛在有效靶點(diǎn)基因241個(gè)。

2.3 菟藤方的成分靶點(diǎn)調(diào)控網(wǎng)絡(luò) Cytoscape創(chuàng)建菟藤方—潛在有效成分-潛在靶點(diǎn)互作網(wǎng)絡(luò)，見(jiàn)圖1。其中多個(gè)活性成分具有相同的潛在作用靶點(diǎn)，按度值降序排列，前三為PTGS1、PTGS2、NCOA2，分別是20、19、19個(gè)潛在有效成分的共同作用靶點(diǎn)。每個(gè)潛在有效成分均有多個(gè)潛在作用靶點(diǎn)，按度值降序排序，前三分別是槲皮素（MOL000098）、甘氨酸（MOL000050）、山柰酚（MOL000422），分別存在131、56、48個(gè)潛在作用靶點(diǎn)。

圖1 菟藤方—潛在有效成分-潛在靶點(diǎn)調(diào)控網(wǎng)絡(luò).最外圈節(jié)點(diǎn)的顏色代表不同中藥，圓形內(nèi)Mol id代表潛在有效成分，內(nèi)圈方形節(jié)點(diǎn)代表菟藤方治療腸癌的潛在靶點(diǎn)基因，顏色（淡黃到深紅）及大小與度值成正比。

2.4 菟藤方的蛋白互作網(wǎng)絡(luò) String數(shù)據(jù)庫(kù)篩選查詢到有219個(gè)節(jié)點(diǎn)，1 508條邊的蛋白質(zhì)-蛋白質(zhì)相互作用網(wǎng)絡(luò)（PPI），CytoNCA 插件二次篩選結(jié)束時(shí)有23個(gè)核心節(jié)點(diǎn)和194條邊，見(jiàn)圖2。

圖2 PPI網(wǎng)絡(luò)的拓?fù)浜Y選過(guò)程.節(jié)點(diǎn)表示不同的靶點(diǎn)基因產(chǎn)生的所有蛋白，邊代表蛋白質(zhì)與蛋白質(zhì)之間的功能連接。219個(gè)節(jié)點(diǎn)（藍(lán)色）經(jīng)過(guò)第一次篩選保留58個(gè)節(jié)點(diǎn)（紅色），第二次篩選保留23個(gè)節(jié)點(diǎn)（黃色），作為核心節(jié)點(diǎn)。

2.5 GO生物過(guò)程富集分析及KEGG通路富集分析 將241潛在有效靶點(diǎn)基因進(jìn)行GO生物過(guò)程富集分析，富集到BP 2 552個(gè)條目，排名前30的富集結(jié)果主要涉及對(duì)營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)的反應(yīng)、炎性反應(yīng)及對(duì)缺氧的反應(yīng)，氧化應(yīng)激反應(yīng)等，見(jiàn)圖3A。KEGG通路富集分析的最終富集了189個(gè)條目，排名前30的富集結(jié)果見(jiàn)圖3B，其中與腸癌相關(guān)的信號(hào)通路，如TNF信號(hào)通路（hsa04668）、HIF-1信號(hào)通路（hsa04066）、結(jié)直腸癌通路（hsa05210）等。菟藤方在HIF通路中涉及21個(gè)靶點(diǎn)，并繪制了相關(guān)靶點(diǎn)圖，見(jiàn)圖4。

圖3 (A)菟藤方作用于腸癌的GOBP富集分析。圖片展示了根據(jù)q value＜0.05篩選后排名前30的GO生物過(guò)程富集結(jié)果?？v坐標(biāo)代表生物功能的名字，橫坐標(biāo)代表富集在GO上的基因數(shù)，q value代表P值調(diào)整后的富集的顯著性，紅色越深代表富集的程度越高。(B)菟藤方作用于腸癌的KEGG通路富集分析.圖片展示了根據(jù)q value＜0.05篩選后排名前30的KEGG通路富集結(jié)果。橫坐標(biāo)代表富集通路上的基因數(shù)目，縱坐標(biāo)代表通路或相關(guān)疾病的名稱，q value代表P值調(diào)整后的顯著性，紅色越深代表富集的程度越高。

圖4 菟藤方治療腸癌的潛在靶點(diǎn)在HIF-1信號(hào)通路上的分布。紅色靶點(diǎn)為菟藤方參與此信號(hào)通路的靶點(diǎn)分布，白色靶點(diǎn)為該通路其他靶點(diǎn)。

3 討論

通過(guò)網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)方法，篩選出菟藤方53個(gè)潛在有效成分及241個(gè)潛在靶點(diǎn)。其中β-谷甾醇、槲皮素、谷甾醇及豆甾醇為多個(gè)中藥的共同有效成分。每種有效成分對(duì)標(biāo)多個(gè)作用靶點(diǎn)，如槲皮素[14]、甘氨酸、山柰酚、L-丙氨酸及β-谷甾醇，分別存在131、56、48、29及26個(gè)潛在作用靶點(diǎn)。同時(shí)，不同有效成分也可作用于相同的靶點(diǎn)。如PTGS1、PTGS2、NCOA2、GABRA1和ADH1C就分別對(duì)標(biāo)多個(gè)有效成分，分別是20、19、19、13、9個(gè)，表明菟藤方通過(guò)多成分協(xié)同作用產(chǎn)生療效。本研究對(duì)PPT蛋白互作網(wǎng)絡(luò)進(jìn)行了兩次篩選，最終保留23個(gè)核心節(jié)點(diǎn)，提示這些靶點(diǎn)表達(dá)蛋白之間的相互作用可能是促使菟藤方抑制腸癌侵襲轉(zhuǎn)移的關(guān)鍵。

經(jīng)過(guò)GO生物功能富集分析及KEGG富集分析，分析排名前30受菟藤方顯著影響的生物功能及信號(hào)通路，發(fā)現(xiàn)相關(guān)生物功能集中在對(duì)營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)的反應(yīng)、炎性反應(yīng)、氧化應(yīng)激反擊，對(duì)缺氧的反應(yīng)等[15]；信號(hào)通路中與腸癌相關(guān)的包括腫瘤壞死因子信號(hào)通路、結(jié)直腸癌通路、腫瘤蛋白聚糖通路、HIF信號(hào)通路[16]、細(xì)胞衰老、鉑耐藥、P53信號(hào)通路。課題組前期研究發(fā)現(xiàn)中藥的作用與HIF-1α密切相關(guān)[17]，基于此篩選出菟藤方治療腸癌的潛在靶點(diǎn)在HIF-1信號(hào)通路上的分布，發(fā)現(xiàn)菟藤方涉及的該通路上21個(gè)靶點(diǎn)[18]。

綜上所述，菟藤方中含有的槲皮素、β-谷甾醇、甘氨酸、山柰酚及L-丙氨酸等53個(gè)潛在有效成分可能作用于AKT1、PTGS2、VEGFA、JUN等241個(gè)潛在靶點(diǎn)，通過(guò)這些靶點(diǎn)基因表達(dá)蛋白之間的相互作用，激活HIF1信號(hào)通路、腫瘤蛋白聚糖通路及p53信號(hào)通路等，從而調(diào)控營(yíng)養(yǎng)水平、氧化應(yīng)激反應(yīng)、缺氧反應(yīng)、炎性反應(yīng)等細(xì)胞生物學(xué)行為，在腸癌治療中起作用。菟藤方具有多成分、多靶點(diǎn)、多通路治療結(jié)直腸癌的作用，而HIF-1信號(hào)通路可能是菟藤方延長(zhǎng)晚期腸癌患者生存期的關(guān)鍵通路之一。