白簕葉總多酚對Aβ_25-35與AAPH誘導的PC12細胞氧化損傷和衰老的保護作用

俞佳妮 馮彩霞 劉向前 李小軍 張曉丹

摘 要： 為探究中藥白簕（Acanthopanx trifoliatus （L.） Merr.）能否作為高效、低毒的防治阿爾茨海默病的天然藥物原料，選用大鼠腎上腺嗜鉻細胞瘤株PC12作為神經細胞模型，建立Aβ_25-35誘導的PC12細胞氧化損傷模型，測定白簕葉總多酚干預24 h后PC12細胞存活率；通過AAPH誘導的PC12細胞衰老模型和β-半乳糖苷酶活性染色法評估PC12細胞衰老情況。結果表明：與僅損傷處理組相比，5～60 mg/L的白簕葉總多酚能夠顯著提高（p＜0.05）經Aβ_25-35誘導的氧化損傷的PC12細胞的存活率，且能夠降低AAPH誘導的細胞衰老模型中的β-半乳糖苷酶活性，表明白簕葉總多酚對PC12細胞具有顯著的保護作用，能有效緩解PC12細胞氧化損傷與衰老。該研究為尋找有效防治阿爾茨海默病的天然藥物的鑒定與篩選提供理論依據。

關鍵詞：白簕葉；總多酚；抗衰老；PC12細胞；體外細胞實驗

中圖分類號：TS195.644

文獻標志碼：A

文章編號：1673-3851 （2023） 05-0353-06

引文格式：俞佳妮，馮彩霞，劉向前，等. 白簕葉總多酚對Aβ_25-35與AAPH誘導的PC12細胞氧化損傷和衰老的保護作用［J］. 浙江理工大學學報（自然科學），2023，49（3）：353-358.

Reference Format： YU Jiani， FENG Caixia， LIU Xiangqian， et al. Protective effects of total polyphenols from Acanthopanx trifoliatus （L.） Merr. on Aβ_25-35-induced oxidative damage and AAPH-induced aging models in PC12 cells［J］. Journal of Zhejiang Sci-Tech University，2023，49（3）：353-358.

Protective effects of total polyphenols from Acanthopanx trifoliatus （L.）

Merr. on Aβ_25-35-induced oxidative damage and AAPH-induced aging models in PC12 cells

YU Jiani¹， FENG Caixia¹， LIU Xiangqian²， LI Xiaojun³， ZHANG Xiaodan¹

（1a.College of Life Sciences and Medicine; 1b.Zhejiang Provincial Key Laboratory of Plant Secondary Metabolic

Regulation， Zhejiang Sci-Tech University， Hangzhou 310018， China; 2. School of Pharmacy， Hunan University of Chinese Medicine， Changsha 410208， China; 3.School of Pharmacy， Gannan Medical University， Ganzhou 341000， China）

Abstract： In order to explore the possibility of Acanthopanx trifoliatus （L.） Merr. as a highly effective and low toxic agent for the prevention and treatment of Alzheimer′s disease， PC12， a rat adrenal pheochromocytoma cell line， was selected as the nerve cell model， the oxidative damage model of PC12 cells induced by Aβ_25-35was established， and the survival rate of PC12 cells was measured after 24 hours of intervention of total polyphenols of A trifoliatuscanthopanx . AAPH-induced aging model of PC12 cells and SA-β-Gal staining was used to evaluate the senescence of PC12 cells. The results show that， compared with the injury treated group， the survival rate of PC12 cells is significantly improved by adding 5～60 mg/L total polyphenols of A trifoliatuscanthopanx? （L.） Merr. and the β-Galactosidase activity of PC12 cells is also reduced， indicating that total polyphenols of A trifoliatuscanthopanx? （L.） Merr. has a significant protective effect on PC12 cells and can effectively alleviate the oxidative damage and aging of PC12 cells. The results of this paper provide a theoretical basis for the identification and screening of natural medicines that can effectively prevent and treat Alzheimer′s disease.

Key words：Acanthopanx trifoliatus （L.） Merr.; total polyphenols; anti-aging; PC12 cells ; in vitro cell experiment

0 引 言

白簕（Acanthopanx trifoliatus （L.） Merr.）為五加科（Araliaceae）五加屬（Acanthopanax）攀援狀灌木，又被稱為禾掌簕、三葉五加、三加皮等，廣泛分布于中國的中部和南部，是一種民間常用的草藥；味苦、澀、微寒，具有祛風除濕、舒筋活血、消腫解毒的功效，用于治療感冒、咳嗽、風濕和坐骨神經痛等癥^［1］。白簕葉中富含皂苷^［2］、三萜羧酸^［3］、黃酮^［4］、糖苷^［5］等多種化學成分。

白簕總多酚具有良好的抗氧化作用，張元等^［6］通過DPPH，ABTS和ORAC測定了經優化后的提取工藝提取所得白簕總多酚的抗氧化活性，發現白簕總多酚具有與Trolox相近的較高的抗氧化活性。Hamid等^［7］通過建立小鼠炎癥模型發現了白簕葉具有良好的抗炎效果，為白簕葉資源的深入利用和高價值的產品開發提供了理論依據。咖啡酰奎寧酸類總多酚是白簕葉的有效成分群之一，具有多種不同的生物活性，能夠有效地抑制血小板聚集，并在抗血栓、抗氧化和自由基損傷和防治阿爾茨海默病^［8］等方面發揮作用。盛艷梅等^［9］通過建立大鼠腦缺血再灌注的損傷模型，探討了3，5-二咖啡酰奎寧酸對于腦神經的保護作用。咖啡酰奎寧酸類化合物在大鼠模型中，能夠有效改善其神經行為，進而使得腦梗死的比率顯著下降^［10］。

阿爾茨海默病是由大腦病理性變化引起的神經退行性疾病，表現為患者認知功能與學習功能下降，記憶功能出現障礙，且癥狀隨患病時間加長而逐漸惡化^［11］。目前阿爾茨海默病的發病機制尚未明確，市面上用于治療阿爾茨海默病的藥物大多通過抑制乙酰膽堿酶活性來減緩癥狀，少數藥物通過靶向清除Aβ減緩病癥的惡化^［12］。能夠低毒、高效地治療阿爾茨海默病的藥物仍待進一步找尋。

白簕葉富含咖啡酰奎寧酸類多酚，可能對腦神經具有較好的保護作用，有關白簕葉藥理活性及在抗氧化、保護神經細胞方面的研究仍為空白。為了探究白簕葉總多酚是否具有保護神經細胞的作用，以及成為治療阿爾茨海默病的藥物的可能性，本文通過建立Aβ_25-35誘導的大鼠腎上腺嗜鉻細胞瘤株PC12氧化損傷模型以及AAPH誘導的大鼠腎上腺嗜鉻細胞瘤株PC12衰老模型，加入乙醇提取、大孔樹脂純化后的白簕葉總多酚進行干預，利用MTT法檢測細胞存活率，分析觀察大鼠腎上腺嗜鉻細胞瘤株PC12的衰老情況，探究白簕葉總多酚是否對大鼠腎上腺嗜鉻細胞瘤株PC12的氧化損傷與衰老具有保護作用，為研究白簕葉總多酚是否具有保護神經效果、尋找有效治療阿爾茨海默病的藥物提供科學依據。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

白簕（Acanthopanx trifoliatus （L.） Merr.）采集于廣東省鳳凰山，大鼠腎上腺嗜鉻細胞瘤株PC12購自中國科學院上海細胞庫，RPMI-1640細胞培養基和胎牛血清購自GE醫療生命科學，胰蛋白酶和青鏈霉素混合液購自上海碧云天生物技術有限公司，二甲基亞砜購自吉諾生物醫藥技術公司，噻唑藍購自上海寶曼生物科技有限公司，β-半乳糖苷酶染色試劑盒購自美國Cell Signaling Technology公司，Aβ_25-35和AAPH購自美國Sigma公司，DMSO、磷酸二氫鉀、磷酸氫二鈉、氯化鈉和氯化鉀購自上海阿拉丁生化科技股份有限公司，乙醇和濃鹽酸購自杭州高晶精細化工有限公司。

1.2 儀器設備

MCO-18AIC型二氧化碳培養箱（日本三洋公司）、Synergy H4型酶標儀（美國伯騰儀器有限公司）、GL124-1SCN型電子分析天平（德國賽多利斯公司）和MF53型熒光倒置顯微鏡（明美光電技術有限公司）。

1.3 試劑的配制

1.3.1 RPMI-1640完全培養基的配制

在超凈工作臺中，向RPMI-1640培養液中加入10%的胎牛血清，充分混勻后加入1%的青鏈霉素混合液，搖勻即為完全培養基，于4 ℃冰箱保存備用。

1.3.2 PBS緩沖液的配制

分別稱取0.24 g磷酸二氫鉀、1.44 g磷酸氫二鈉、8.00 g氯化鈉和0.20 g氯化鉀至燒杯中，加入800 mL蒸餾水，玻璃棒充分攪拌使之溶解，用濃鹽酸調至pH值為7.2，最后在容量瓶中加水定容至1000 mL。將配制好的PBS滅菌（121 ℃，20 min）后，置于4 ℃冰箱保存。

1.3.3 Aβ_25-35母液配制

取1 mg Aβ_25-35于471.5 μL ddH₂O溶解，配制成2 mmol/L的母液，小管分裝，避免反復凍融，在-20 ℃冰箱保存備用。使用前將分裝的Aβ_25-35母液于37 ℃的恒溫培養箱中孵育約7 d，增加Aβ_25-35的神經毒性。

1.3.4 MTT溶液的配制

稱取MTT粉末500 mg于燒杯，加入100 mL配置完成的PBS緩沖液，完全溶解后，在超凈工作臺中用0.22 μm濾膜過濾，即為質量濃度5 mg/mL的MTT。MTT需現配現用，過濾除菌后將其放在4 ℃冰箱避光保存。

1.4 樣品的制備

白簕葉總多酚的提取方法：將烘干至恒重后的白簕葉粉碎，取1 kg粉末，加入70%的乙醇，超聲提取4次，每次2 h，將提取液合并濃縮，干燥后加水溶解，用石油醚萃取4次去脂，取水相濃縮干燥，得到總多酚粗提物粉末^［13］。白簕葉總多酚的純化方法：稱取100 g D101大孔樹脂，加入500 mL 95%的乙醇，將其充分浸泡24 h，倒入層析柱后去除雜質，然后進行酸洗和堿洗，用蒸餾水浸泡備用；稱取2.8 g總多酚粗提物，配置成200 mL樣品，將大孔樹脂于水中濕法上柱，加入樣品進行吸附，控制流速收集流出液，收集并濃縮洗脫液總多酚流段，冷凍干燥后獲得白簕葉總多酚^［14］。

1.5 MTT法檢測細胞存活率

白簕葉總多酚處理24 h后，向每個孔加入20 μL的MTT溶液，置于含5%CO₂的37 ℃培養箱中培養4 h。取出96孔板，沿著培養液上部用移液槍小心吸取上清液，充分棄去MTT。每孔加150 μL的DMSO溶解結晶，輕輕振搖15 min。使用酶標儀，在490 nm波長處檢測各孔的吸光度，即OD值，計算不同質量濃度下藥物對細胞增殖的抑制率，抑制率用細胞存活率表示，計算公式為：

1.6 白簕葉總多酚對PC12細胞的細胞毒性

當細胞處于對數生長期時，棄培養液，用配制好的PBS洗兩次，加入1 mL的胰酶使貼壁細胞分散，消化完全后，加入培養液使貼壁細胞懸浮起來，800 r/min 離心3 min以充分去除胰酶。離心后保留細胞沉淀，加入1 mL完全培養基，用吸管輕輕吹打，吹散細胞使細胞飄浮起來，制成懸液。用血球計數板進行細胞計數，最終向96孔板每孔中加入100 μL的細胞懸液（約5000個細胞），將不含細胞的100 μL完全培養基作為空白孔，在含5% CO₂的37 ℃培養箱中培養過夜，使之貼壁。將白簕葉總多酚用無血清培養基配制成240.000、120.000、60.000、30.000、15.000、7.500、3.750 mg/L和1.875 mg/L共8個質量濃度梯度的白簕葉總多酚藥物組，每組分別設4個復孔。加藥后將96孔板置于5% CO₂，37 ℃培養箱繼續培養24 h后，采用MTT法檢測細胞存活率。

1.7 白簕葉總多酚對Aβ_25-35誘導的PC12細胞氧化損傷的保護作用

1.7.1 Aβ_25-35誘導的PC12細胞氧化損傷濃度的確定

將懸浮的PC12細胞用血球計數板進行計數，最終向96孔板每孔中加入100 μL細胞懸液（約5000個細胞），空白對照加100 μL完全培養基，放在含有5% CO₂的37 ℃培養箱中培養過夜，使之貼壁。將孵育7 d后的Aβ_25-35用培養基稀釋，分別稀釋為10、8、7、6、5、4、2 μmol/L和1 μmol/L ，向Aβ_25-35損傷組中加入10 μL上述不同濃度的Aβ_25-35，不加Aβ_25-35為陰性對照組，加入10 μL無血清RPMI-1640培養液。每組分別設置4～6個孔，重復3次。在含5%CO₂的37 ℃培養箱繼續培養24 h后用MTT法檢測細胞存活率，用GraphPad Prism 7軟件計算Aβ_25-35對PC12細胞的IC₅₀值確定誘導濃度，具體方法參考文獻［15］。

1.7.2 白簕葉總多酚對Aβ_25-35誘導的PC12細胞氧化損傷模型的作用

將消化后的PC12細胞制成細胞懸液進行計數，向每孔加入90 μL 細胞懸液（約5000個細胞），設置空白組加90 μL完全培養基，放在含5% CO₂的37 ℃培養箱中培養過夜，使之貼壁。在小于白簕葉總多酚的最大安全質量濃度基礎上設置加入白簕葉總多酚質量濃度為5、10、20、30、40、50 mg/L和60 mg/L的白簕葉總多酚實驗組，Aβ_25-35模型組與陰性對照組加入10 μL無血清培養基，預處理30 min，實驗組與Aβ_25-35模型組加入濃度為4.141 μmol/L的Aβ_25-35溶液10 μL，空白對照組和陰性對照組加入10 μL無血清培養基。每組分別設4個復孔，實驗重復3次，在5% CO₂、37 ℃條件下繼續培養24 h后，用MTT法檢測細胞存活率，具體方法參考文獻［16］。

1.8 白簕葉總多酚對AAPH誘導的PC12細胞衰老的抵抗作用

1.8.1 AAPH誘導的衰老模型的建立以及給藥

當細胞處于對數生長期時，吸去培養液，用PBS洗兩次。加入1 mL胰酶使貼壁細胞分散，消化完全后，加入培養液使貼壁細胞懸浮起來，800 r/min 離心3 min以充分去除胰酶。離心后保留細胞沉淀，加入1 mL培養液，用吸管輕輕吹打，使細胞飄浮起來，制成懸液。然后用血球計數板進行細胞計數，最終向每孔加入2 mL 細胞懸液（約200000個細胞）到6孔板中，培養過夜使之貼壁。對照組繼續培養，PC12細胞加藥組和AAPH組均加入終濃度為1 mmol/L的AAPH，加藥組分別另外加入15、30mg/L和60 mg/L的白簕葉總多酚，培養48 h后進行染色并檢測，具體方法參考文獻［17］。

1.8.2 β-半乳糖苷酶染色

按照試劑盒要求配制染色液，根據白簕葉總多酚對PC12細胞的細胞毒性實驗結果，在不顯著降低PC12細胞的條件下選取低，中，高共三個濃度梯度進行實驗。實驗組用15、30 mg/L和60 mg/L的白簕葉總多酚處理后，在超凈工作臺中棄去舊細胞培養液，每孔加入2 mL的PBS洗滌1次，向每孔加入1 mL預先配制好的固定液，將PC12細胞在室溫條件下固定10～15 min；固定后吸去固定液，每孔加入2 mL的PBS 洗滌2次以充分去除殘留的固定液，每孔加入1 mL染色液進行染色；將6孔板放入干燥的無CO₂的37 ℃培養箱過夜，在倒置顯微鏡下觀察細胞染色情況。

2 結果與分析

2.1 白簕葉總多酚的細胞毒性檢測結果

以白簕葉總多酚加藥質量濃度-細胞存活率為橫縱坐標作圖，結果如圖1所示。圖1表明：當白簕葉總多酚濃度為60 mg/L以下時，PC12細胞的存活率均大于95%，與空白對照組差異不顯著（p>0.05），而在質量濃度高于60 mg/L時，細胞存活率明顯下降，因此，本文選取干預PC12細胞的白簕葉總多酚最大安全質量濃度為60 mg/L。

2.2 Aβ_25-35對PC12細胞損傷濃度的確定

本文通過MTT實驗測定不同濃度Aβ_25-35處理24 h后的PC12細胞存活率，結果如圖2所示。圖2表明：在Aβ_25-35濃度為1～10 μmol /L范圍內，細胞損傷率與Aβ_25-35呈濃度依賴性且為正相關。Aβ_25-35對PC12細胞的IC₅₀值為4.141 μmol/L，確定其為使用Aβ_25-35建立細胞氧化損傷模型的濃度。

2.3 白簕葉總多酚對Aβ_25-35誘導的PC12細胞氧化損傷模型的保護作用

為了探究白簕葉總多酚對Aβ_25-35誘導的PC12細胞氧化損傷模型的作用，以4.141 μmol/L的Aβ_25-35誘導PC12的氧化損傷模型。根據白簕葉總多酚對PC12細胞毒性的檢測結果，白簕葉總多酚質量濃度小于60 mg/L時，對PC12細胞的增殖無顯著影響，因此加入質量濃度為5、10、20、30、40、50 mg/L和60 mg/L的不同濃度白簕葉總多酚處理，MTT檢測細胞存活率結果如圖3所示。圖3表明：加入質量濃度范圍為5～60 mg/L白簕葉總多酚后，PC12細胞存活率顯著高于未加入白簕葉總多酚的Aβ_25-35模型組，通過白簕葉總多酚對該損傷模型的處理，顯著提高了細胞的存活率（p<0.05）；白簕葉總多酚對Aβ_25-35誘導的PC12細胞氧化損傷具有顯著的保護作用，氧化損傷模型的細胞存活率低于50%，且白簕葉總多酚藥物組的質量濃度越高，細胞存活率呈現降低趨勢，其原因可能是Aβ_25-35是一種β淀粉樣蛋白，活性受溫度及孵育時間的影響，較不穩定，導致實驗重復性較低。

2.4 β-半乳糖苷酶染色結果

為了驗證白簕葉總多酚對Aβ_25-35誘導的PC12細胞氧化損傷模型的作用結果的可靠性，選取AAPH對PC12細胞進行誘導，將不同質量濃度白簕葉總多酚處理后的損傷PC12細胞進行染色，結果如圖4所示。圖4表明：AAPH模型組的大部分細胞被染為藍色，β-半乳糖苷酶活性較高，細胞處于衰老狀態，未經AAPH誘導的對照組幾乎未見染色陽性細胞，而各質量濃度白簕葉總多酚作用后的細胞染色陽性率均明顯小于模型組，且在15～60 mg/L濃度范圍內，β-半乳糖苷酶染色陽性率細胞數目隨著白簕葉總多酚質量濃度增加而減少，白簕葉總多酚對PC12細胞的衰老具有保護作用，且在一定質量濃度范圍內隨著質量濃度的增加而提高。

3 討 論

Aβ-淀粉樣蛋白與阿爾茨海默病的防治息息相關，Aβ_25-35為一種Aβ淀粉樣蛋白，其聚集在阿爾茨海默病的發生和發展過程中發揮重要作用。Aβ蛋白通過減少細胞內的抗凋亡因素加速細胞凋亡，使神經元發生壞死^［18］。王凱等^［19］通過將不同濃度的β淀粉樣蛋白Aβ_25-35進行側腦注射，發現Aβ_25-35會減退大鼠的記憶能力，損傷大鼠的突出超微結構，使大鼠的海馬神經元壞死。付劭靜等^［20］發現當阿爾茨海默病患者神經功能障礙與認知功能障礙程度加重時，患者血清中的Aβ_1-42顯著增加，因此通過清除Aβ-淀粉樣蛋白防治阿爾茨海默病是阿爾茨海默病藥物的重要研究方向之一。利用Aβ_25-35誘導的PC12細胞氧化損傷模型尋找防治阿爾茨海默癥藥物的實驗方法的應用較為廣泛，王媛等^［21］通過建立該模型探究了雌激素受體介導的柚皮苷抗Aβ_25-35損傷PC12 細胞凋亡作用。AAPH作為一種自由基誘導劑，是一種含氮的水溶性小分子，在生理溫度（37 ℃，pH值7.0）下，能夠分解產生自由基。氧氣能夠快速地和其中含碳的自由基發生反應，生成過氧自由基，且以穩定的速率釋放^［22］，被廣泛運用于構建氧化應激模型。本文通過建立Aβ_25-35誘導的PC12神經細胞損傷模型與AAPH誘導的PC12細胞氧化損傷模型探究白簕葉總多酚是否能夠通過清除Aβ_25-35與AAPH達到對大鼠腎上腺嗜鉻細胞瘤株PC12細胞的保護效果，結果表明白簕葉總多酚能夠有效保護PC12細胞不受氧化損傷，白簕葉總多酚在防治阿爾茨海默病上具有巨大潛力。

4 結 論

本文通過建立Aβ_25-35誘導的PC12神經細胞損傷模型與APPH誘導的PC12神經細胞衰老模型，加入不同質量濃度的白簕葉總多酚后測定細胞存活率與β-半乳糖苷酶活性，探究白簕葉總多酚對氧化損傷的PC12細胞的保護作用，主要結論如下：

a）過高質量濃度的白簕葉總多酚對PC12具有毒性。當白簕葉總多酚質量濃度為60 mg/L以下時，PC12細胞的存活率均大于95%，而在質量濃度高于60 mg/L時，細胞存活率明顯下降低于95%，因此干預PC12細胞的白簕葉總多酚最大安全質量濃度為60 mg/L。

b）Aβ_25-35能夠誘導PC12細胞產生氧化損傷，且氧化損傷程度隨著Aβ_25-35濃度的增加而增加。質量濃度為5～60 mg/L的白簕葉總多酚均可顯著提高Aβ_25-35誘導的氧化損傷PC12細胞的存活率，對其產生顯著的保護作用。

c）AAPH能夠誘導PC12細胞的衰老。在15～60 mg/L的濃度范圍內，白簕葉總多酚對AAPH誘導的PC12細胞的衰老的保護作用隨著白簕葉總多酚濃度的增加而提高。

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（責任編輯：張會巍）