重組人神經(jīng)生長因子通過抑制小膠質(zhì)細(xì)胞炎癥反應(yīng)發(fā)揮神經(jīng)保護(hù)作用

李瑤，陳旖，朱丹妮，宋小紅，張金龍，張哲，趙拯浩，侯利華，吳詩坡，陳薇

（軍事科學(xué)院軍事醫(yī)學(xué)研究院生物工程研究所，北京 100071）

神經(jīng)炎癥是神經(jīng)系統(tǒng)疾病如神經(jīng)退行性疾病和缺血性腦損傷的病理特征［1-2］。清除炎癥對(duì)于中樞神經(jīng)系統(tǒng)（central nervous system，CNS）的損傷和重建至關(guān)重要，但繼發(fā)性神經(jīng)炎癥具有神經(jīng)毒性，可進(jìn)一步導(dǎo)致神經(jīng)細(xì)胞壞死或凋亡［3］。因此，即使炎癥是免疫防御系統(tǒng)的一部分，也有必要適當(dāng)控制，以治療與細(xì)胞炎癥相關(guān)的疾病［4］。

神經(jīng)炎癥是一個(gè)復(fù)雜而精細(xì)的過程，由各種膠質(zhì)細(xì)胞和外周免疫細(xì)胞完成，活化的小膠質(zhì)細(xì)胞被認(rèn)為是這一過程的關(guān)鍵角色［5］。小膠質(zhì)細(xì)胞是CNS 中固有的免疫細(xì)胞，在生理狀態(tài)下呈高度分枝狀，持續(xù)監(jiān)測周圍微環(huán)境［5-6］，可通過感染、損傷或內(nèi)源性神經(jīng)毒性因子激活，極化為經(jīng)典激活狀態(tài)（M1表型）或選擇激活狀態(tài)（M2 表型），且其活化與多種細(xì)胞因子的產(chǎn)生和分泌相關(guān)。M1 表型細(xì)胞釋放促炎因子，包括介導(dǎo)神經(jīng)毒性的白細(xì)胞介素1β（inter?leukin-1β，IL-1β）、IL-6 和腫瘤壞死因子α（tumor necrosis factor-α，TNF-α）［7］，M2 表型細(xì)胞釋放抗炎因子，如IL-4 和IL-10，被認(rèn)為具有保護(hù)和修復(fù)功能［8］。研究表明，抑制小膠質(zhì)細(xì)胞活化可減少神經(jīng)元損傷，是治療神經(jīng)炎癥相關(guān)疾病的重要干預(yù)措施［9-10］。

在小膠質(zhì)細(xì)胞中，神經(jīng)生長因子（nerve growth factor，NGF）及其受體表達(dá)在炎癥刺激下顯著升高［11］。NGF是神經(jīng)營養(yǎng)因子家族的一員，對(duì)神經(jīng)元存活、分化和成熟至關(guān)重要［12-13］，在調(diào)節(jié)神經(jīng)系統(tǒng)和免疫系統(tǒng)之間雙向信號(hào)網(wǎng)絡(luò)以維持內(nèi)環(huán)境穩(wěn)態(tài)方面具有重要作用［14］。NGF 的臨床研究集中于修復(fù)周圍神經(jīng)系統(tǒng)和CNS的神經(jīng)損傷，包括周圍神經(jīng)病變、視神經(jīng)損傷、缺血性卒中和神經(jīng)退行性疾病［15-17］等。重組人神經(jīng)生長因子（recombinant human NGF，rhNGF）是NGF 的重組蛋白，其生物學(xué)功能最接近天然蛋白質(zhì)分子，能夠代替NGF促進(jìn)神經(jīng)再生，并為損傷后的神經(jīng)修復(fù)提供營養(yǎng)支持［18］。CHO 細(xì)胞表達(dá)的rhNGF 具有高活性和低免疫原性，具有廣闊的市場前景。rhNGF 滴眼液已用于臨床，可緩解干眼癥的癥狀。意大利Dompé 公司研發(fā)的rhNGF 滴眼液Oxervate（cenegermin）被美國FDA 批準(zhǔn)用于治療中度或重度神經(jīng)營養(yǎng)性角膜炎［19］。然而，rhNGF 在炎性狀態(tài)下的神經(jīng)保護(hù)作用機(jī)制尚不清楚。本研究建立BV2 小膠質(zhì)細(xì)胞炎癥模型以模擬炎癥狀態(tài)下的神經(jīng)細(xì)胞損傷，評(píng)價(jià)由本研究室自主研發(fā)的rhNGF 對(duì)小膠質(zhì)細(xì)胞介導(dǎo)的炎癥反應(yīng)和神經(jīng)元細(xì)胞凋亡的抑制作用，探討其神經(jīng)保護(hù)作用機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 rhNGF、細(xì)胞、試劑和主要儀器

rhNGF 在CHO 細(xì)胞中表達(dá)并通過柱色譜純化，在TF-1 細(xì)胞試驗(yàn)中驗(yàn)證了其生物活性，并通過紫外-可見分光光度法確定其濃度［20］。小鼠BV2 小膠質(zhì)細(xì)胞和小鼠腦神經(jīng)瘤細(xì)胞Neuro-2a（N2a），北京協(xié)和醫(yī)學(xué)院細(xì)胞資源中心。DMEM 培養(yǎng)基、MEM 培養(yǎng)基、青鏈霉素雙抗、胰酶、PBS、非必需氨基酸和胎牛血清（fetal bovine serum，F(xiàn)BS），美國Gibco 公司；TritonTMX-100、牛血清白蛋白（bovine serum albumin，BSA）和脂多糖（lipopolysaccha?rides，LPS），美國Sigma 公司；小鼠抗小鼠神經(jīng)元特異性核蛋白（neuron specificnuclears protein，NeuN）單克隆抗體，德國Millipore 公司；CCK-8 試劑盒，北京索萊寶科技有限公司；多聚甲醛，國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司；大鼠抗小鼠CD16 抗體和凋亡細(xì)胞流式檢測試劑盒，美國BD 公司；山羊抗小鼠CD206 抗體，美國R&D 公司；Alexa FluorTM488 標(biāo)記驢抗大鼠IgG（H+L）、Alexa FluorTM594 標(biāo)記驢抗山羊IgG（H+L）和Alexa FluorTM488 標(biāo)記驢抗小鼠IgG（H+L）抗體，美國Invitrogen 公司；RNAiso Plus 溶液、RNA 酶抑制劑、逆轉(zhuǎn)錄試劑盒Prime?Script?和SYBR Green 實(shí)時(shí)熒光定量PCR（realtime quantitative PCR，RT-qPCR）試劑盒，日本TaKaRa 公司；細(xì)胞因子檢測試劑盒（cytometric bead array，CBA），美國BioLegend公司；TUNEL原位凋亡檢測試劑盒，南京諾維贊生物科技有限公司；PCR引物（表1）由生工生物工程（上海）有限公司合成。Mastercycler?nexus-PCR儀，德國Eppendorf股份公司；TS100 倒置顯微鏡，德國Nikon 公司；QuantStudio?3 實(shí)時(shí)熒光定量PCR 儀，美國ABI 公司；iMark?酶標(biāo)儀，美國Bio-Rad 公司；Sorvall ST 40R 臺(tái)式離心機(jī)和1300 Series A2 生物安全柜，美國Thermo 公司；0.2 μm 濾膜，德國Millipore 公司；MIR-H163L-PC 電熱恒溫培養(yǎng)箱和MCO-18AC二氧化碳細(xì)胞培養(yǎng)箱，日本三洋公司；AireGard NU-140 細(xì)胞超凈工作臺(tái)，美國NUAIRE 公司；Cytation 1細(xì)胞成像多功能檢測系統(tǒng)，美國Bio-TeK公司；FACS CantoTM流式細(xì)胞儀，美國BD公司。

Tab.1 Primer sequences for real-time quantitative PCR（RT-qPCR）

1.2 rhNGF濃度和LPS誘導(dǎo)BV2細(xì)胞炎癥反應(yīng)最佳濃度確定

BV2細(xì)胞在含10% FBS和1%青鏈霉素雙抗的DMEM 培養(yǎng)基中培養(yǎng)。將BV2 細(xì)胞接種至96 孔板（每孔5×103細(xì)胞）孵育過夜，設(shè)細(xì)胞對(duì)照組及rhNGF 0.005，0.05，0.5，5，50，500和5000 μg·L-1組，每組6 復(fù)孔，分別加入PBS 或相應(yīng)濃度rhNGF孵育48 h，CCK-8 試劑盒測定細(xì)胞存活率，確定rhNGF的濃度。

設(shè)細(xì)胞對(duì)照組及LPS 1，10 和100 mg·L-1組，分別加入PBS 或相應(yīng)濃度LPS 孵育細(xì)胞24 h，CCK-8 試劑盒測定細(xì)胞存活率，RT-qPCR 測定促炎細(xì)胞因子IL-1β，IL-6和TNF-α及抑炎細(xì)胞因子IL-4和IL-10mRNA 表達(dá)，確定誘導(dǎo)BV2 細(xì)胞炎癥反應(yīng)最佳LPS濃度。

1.3 BV2細(xì)胞分組和處理

將BV2 細(xì)胞接種于96 孔板（每孔5×103細(xì)胞）培養(yǎng)過夜，設(shè)細(xì)胞對(duì)照組、LPS 1 mg·L-1組及LPS+rhNGF 5，50 和500 μg·L-1組。LPS 和LPS+rhNGF 組給予LPS 1 mg·L-1處理24 h，更換為PBS 或rhNGF 5，50 或500 μg·L-1繼續(xù)孵育48 h；細(xì)胞對(duì)照組不做處理。

1.4 BV2細(xì)胞與N2a細(xì)胞共培養(yǎng)分組和處理

BV2 細(xì)胞分為細(xì)胞對(duì)照組、LPS 1 mg·L-1組及LPS+rhNGF 50 和500 μg·L-1組，接種至12 孔板（每孔5×105細(xì)胞），按1.3 處理，收集細(xì)胞。N2a 細(xì)胞在含10%FBS 和1%青鏈霉素雙抗的MEM 培養(yǎng)基中培養(yǎng)，分為細(xì)胞對(duì)照組、LPS 1 mg·L-1組及與上述處理的4 組BV2 細(xì)胞分別共培養(yǎng)組，每組設(shè)3復(fù)孔，接種于24孔板（每孔1×105細(xì)胞）培養(yǎng)過夜。第2 天4 個(gè)共培養(yǎng)組分別加入相應(yīng)處理的BV2 細(xì)胞，每孔1×104細(xì)胞，共培養(yǎng)12 或24 h；細(xì)胞對(duì)照組和LPS組分別加入等體積PBS和LPS。

1.5 BV2 細(xì)胞條件培養(yǎng)基與N2a 細(xì)胞共培養(yǎng)分組和處理

BV2 細(xì)胞分為細(xì)胞對(duì)照組、LPS 1 mg·L-1組及LPS+rhNGF 50 和500 μg·L-1組，接種至12 孔板（每孔5×105細(xì)胞），按1.3 處理，收集細(xì)胞培養(yǎng)上清即條件培養(yǎng)基（microglial conditioned medium，MCM），分別為MCM-對(duì)照、MCM-LPS 及MCMrhNGF 50和500 μg·L-1，于4 ℃，800×g離心10 min，0.2 μm囊式過濾器過濾去除細(xì)胞碎片。將N2a 細(xì)胞接種到96 孔板（每孔5×103細(xì)胞）或12 孔板（每孔5×105細(xì)胞）培養(yǎng)過夜，分為細(xì)胞對(duì)照組、LPS 1 mg·L-1組及4個(gè)MCM組，即MCM-對(duì)照組、MCMLPS 組、MCM-rhNGF 50 和500 μg·L-1組，每組設(shè)6 復(fù)孔。LPS 組僅以LPS 1 mg·L-1孵育12 或24 h，4 個(gè)MCM 組加入等體積相應(yīng)MCM 孵育12 或24 h，細(xì)胞對(duì)照組加入等體積PBS。

1.6 CCK-8法檢測BV2和N2a細(xì)胞存活率

用CCK-8 試劑盒檢測細(xì)胞存活率。取1.2，1.3和1.5分組處理的細(xì)胞，每孔加入CCK-8試劑10 μL，37 ℃孵育2 h，于酶標(biāo)儀檢測450 nm 處吸光度值（A450nm）。細(xì)胞存活率（%）=（實(shí)驗(yàn)組A450nm-空白組A450nm）/（細(xì)胞對(duì)照組A450nm-空白組A450nm）×100%。

1.7 實(shí)時(shí)定量PCR 檢測BV2 細(xì)胞炎癥因子mRNA表達(dá)

取1.2 和1.3 處理的BV2 細(xì)胞，Trizol 法提取總RNA，用PrimeScript?逆轉(zhuǎn)錄試劑盒逆轉(zhuǎn)錄合成cDNA。RT-qPCR 檢測促炎因子IL-1β，IL-6和TNF-α及抗炎因子IL-4和IL-10mRNA 表達(dá)。反應(yīng)體系：cDNA 1 μL，上、下游引物（10 μmol·L-1）0.8 μL，ROX Reference Dye Ⅱ0.4 μL，TB Green Premix Ex Taq Ⅱ（Tli RNaseH Plus）10 μL，無RNA 酶水7 μL。反應(yīng)條件：95 ℃30 s；95 ℃5 s，60 ℃34 s，共45 個(gè)循環(huán)；95 ℃15 s，60 ℃1 min。以GAPDH作為內(nèi)參，待測基因mRNA 相對(duì)表達(dá)水平用2-△△Ct表示。

1.8 CBA 法檢測BV2 細(xì)胞培養(yǎng)上清中炎癥因子濃度

用CBA 試劑盒測定BV2 細(xì)胞培養(yǎng)上清中細(xì)胞因子TNF-α,IL-6,IL-4 和IL-10 濃度。取1.3 細(xì)胞培養(yǎng)上清和標(biāo)準(zhǔn)品，加入分析緩沖液和檢測微球，室溫下避光800 rpm振蕩孵育2 h。洗滌2次，加入25 μL檢測抗體于室溫下避光800 rpm振蕩孵育1 h 后，加入SA-PE 25 μL繼續(xù)振蕩孵育30 min。洗滌2次后重懸樣品，轉(zhuǎn)移至流式管中，于流式細(xì)胞儀檢測。通過LEGENDplex v8 軟件繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線并計(jì)算細(xì)胞因子濃度。

1.9 免疫熒光法檢測BV2 細(xì)胞中CD16 和CD206陽性細(xì)胞百分比

取1.3 分組處理的BV2 細(xì)胞，用冷PBS 洗滌，PBS 緩沖條件下用4%多聚甲醛固定20 min 后，用0.2%Triton X-100 透化15 min。細(xì)胞用含10%BSA的PBS 封閉1 h 阻斷非特異性結(jié)合，然后用大鼠抗小鼠CD16 或山羊抗小鼠CD206 抗體4 ℃孵育過夜。PBS 洗滌3 次，細(xì)胞在37 ℃條件下與Alexa FluorTM488和Alexa FluorTM594偶聯(lián)的熒光二抗孵育1 h，DAPI 染色10 min。用Cytation 1 細(xì)胞成像多功能檢測系統(tǒng)獲取熒光圖像，每樣本隨機(jī)選擇2 個(gè)視野，用Image J 軟件統(tǒng)計(jì)CD16（綠色）和CD206（紅色）陽性細(xì)胞百分比。

1.10 流式細(xì)胞術(shù)檢測N2a細(xì)胞凋亡率

取1.5 分組處理的N2a 細(xì)胞，用結(jié)合緩沖液重懸，計(jì)數(shù)并稀釋至1×109L-1。各取100 μL細(xì)胞懸液轉(zhuǎn)移至流式管，加入5 μL Annexin Ⅴ-PE 和7-AAD混合，室溫避光孵育15 min。每管加200 μL 結(jié)合緩沖液重懸，樣品于1 h 內(nèi)于流式細(xì)胞儀檢測，用FACS Diva 軟件分析早期凋亡細(xì)胞百分比。Annexin Ⅴ+7-AAD-為早期凋亡細(xì)胞。

1.11 NeuN和TUNEL共染法檢測N2a細(xì)胞凋亡率

使用TUNEL 紅色熒光原位凋亡檢測試劑盒和NeuN 抗體共染色檢測N2a 細(xì)胞凋亡。取1.4 分組處理的N2a 細(xì)胞，PBS 洗滌細(xì)胞2 次，4%多聚甲醛固定20 min，0.2% Triton X-100 透化15 min，使用含10%BSA 的PBS 封閉1 h。室溫條件用平衡緩沖液平衡細(xì)胞10 min，加TdT 工作液在37 ℃孵育60 min。用PBS 清洗細(xì)胞后，加入抗小鼠NeuN 單克隆抗體（1∶200），4 ℃孵育過夜。細(xì)胞用PBS 洗滌3 次后，加入Alexa FluorTM488 標(biāo)記驢抗小鼠IgG（H+L）抗體（1∶1000），室溫避光孵育60 min。經(jīng)PBS 洗滌后，用DAPI 進(jìn)行細(xì)胞核染色。用Cytation 1 細(xì)胞成像多功能檢測系統(tǒng)獲取熒光圖像，每樣本隨機(jī)選擇2 個(gè)視野，用Image J 軟件統(tǒng)計(jì)NeuN（綠色）和TUNEL（紅色）雙陽性細(xì)胞百分率。

1.12 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

2 結(jié)果

2.1 rhNGF濃度和LPS誘導(dǎo)BV2細(xì)胞炎癥反應(yīng)濃度的確定

與BV2 細(xì)胞對(duì)照組比，rhNGF 5，50，500 和5000 μg·L-1干預(yù)48 h 可明顯提高BV2 細(xì)胞存活率（P<0.05，P<0.01）（圖1），因此選rhNGF 5，50和500 μg·L-1用于后續(xù)實(shí)驗(yàn)。

Fig.1 Effect of recombinant human nerve growth factors（rhNGF）on cell viability of BV2 cells. BV2 cells were treated with rhNGF for 48 h. The cell viability was detected by CCK-8 kit.±s，n=6.＊P<0.05，＊＊P<0.01，compared with cell control group.

表2 結(jié)果顯示，LPS 1，10 和100 mg·L-1誘導(dǎo)24 h 后，BV2 細(xì)胞存活率顯著降低（P<0.01），促炎因子IL-6，IL-1β和TNF-α及抗炎因子IL-10mRNA水平顯著升高（P<0.01），但I(xiàn)L-4mRNA 水平下降（P<0.01），表明LPS可有效激活BV2細(xì)胞為炎癥狀態(tài)。考慮為LPS濃度過大對(duì)BV2細(xì)胞可能造成不可逆損傷，本研究采用1 mg·L-1作為造模濃度。

Tab.2 Effect of lipopolysaccharides（LPS）on viability and mRNA levels of inflammatory cytokines of BV2 cells

2.2 rhNGF改善LPS誘導(dǎo)的BV2細(xì)胞損傷

與細(xì)胞對(duì)照組相比，LPS 組BV2 細(xì)胞存活率明顯下降（P<0.01）；與LPS 組相比，rhNGF 5 μg·L-1對(duì)BV2 細(xì)胞存活率無明顯影響，rhNGF 50 和500 μg·L-1顯著升高細(xì)胞存活率（P<0.01）（圖2A）。因此，后續(xù)實(shí)驗(yàn)中rhNGF濃度選用50和500 μg·L-1。

Fig.2 Effect of rhNGF on LPS-induced cytotoxicity in BV2 cells. BV2 cells were stimulated with LPS 1 mg·L-1 for 24 h. LPS+rhNGF groups were treated with rhNGF 5，50 and 500 μg·L-1，respectively, for another 48 h. A：cell viability；B：cell morphological changes. ±s，n=6. ＊＊P<0.01，compared with cell control group；##P<0.01，compared with LPS group.

由圖2B 所示，細(xì)胞對(duì)照組處于“靜息”狀態(tài)的BV2 細(xì)胞顯示出具有短分叉結(jié)構(gòu)的較小胞體；LPS組細(xì)胞則變圓且胞體增大，表現(xiàn)為活化狀態(tài)；LPS+rhNGF 50 和500 μg·L-1組細(xì)胞胞體較小且長出更多的突觸，在一定程度上LPS 誘導(dǎo)的BV2細(xì)胞形態(tài)變化得到改善。

2.3 rhNGF 通過誘導(dǎo)BV2 細(xì)胞向M2 型分化抑制促炎反應(yīng)

與細(xì)胞對(duì)照組相比，LPS 組BV2 細(xì)胞中IL-6，IL-1β，TNF-α和IL-10mRNA 水平明顯升高（P<0.01）,IL-4mRNA 水平明顯降低（P<0.01）。與LPS 組相比，rhNGF 50 μg·L-1處理48 h 后顯著降低BV2 細(xì)胞IL-6，IL-1β和TNF-αmRNA 水平（P<0.05），并提高IL-4（P<0.01）和IL-10（P<0.05）mRNA 水平（表3）。CBA 法測定結(jié)果（表4）表明，與細(xì)胞對(duì)照組相比，LPS 組細(xì)胞上清液中IL-6 和TNF-α 蛋白濃度顯著升高（P<0.01）；與LPS 組相比，rhNGF 50和500 μg·L-1使IL-6和TNF-α蛋白濃度顯著降低（P<0.01）。各組IL-4 蛋白濃度無明顯變化，IL-10 蛋白濃度低于檢測限。上述結(jié)果表明，LPS 刺激BV2 細(xì)胞發(fā)生炎癥反應(yīng)后，rhNGF 可在mRNA 和蛋白水平抑制促炎因子，并在mRNA水平促進(jìn)抗炎因子，從而抑制炎癥反應(yīng)。

Tab.3 Inflammatory cytokine mRNA levels in rhNGF-treated BV2 cells by RT-qPCR

Tab.4 Inflammatory cytokine protein levels in rhNGF-treated BV2 cells by CBA kit

免疫熒光檢測M1 表型標(biāo)志物CD16 和M2 表型標(biāo)志物CD206 相對(duì)表達(dá)結(jié)果如圖3 所示。與細(xì)胞對(duì)照組相比，LPS 顯著增加CD16（綠色）和CD206（紅色）表達(dá)，CD16 表達(dá)增加更顯著，表明LPS 激活BV2細(xì)胞促進(jìn)其轉(zhuǎn)化為促炎M1表型。值得注意的是，與LPS 組相比，BV2 細(xì)胞經(jīng)rhNGF 50和500 μg·L-1處理后，CD16 表達(dá)水平顯著降低（P<0.05），而CD206 表達(dá)水平顯著升高（P<0.01），表明rhNGF 可誘導(dǎo)BV2 細(xì)胞從促炎M1 表型向抗炎M2 表型轉(zhuǎn)化。上述結(jié)果提示，rhNGF 通過誘導(dǎo)BV2 細(xì)胞向M2 表型極化而抑制炎癥反應(yīng)。

Fig.3 Effect of rhNGF on polarization of LPS-induced BV2 cells. See Fig.2 for the cell treatment. A：immunofluorescence images；green：CD16；red：CD206；blue：DAPI；B：statistical analysis of the percentages of CD16+ and CD206+ BV2 cells. ±s，n=6.＊＊P<0.01，compared with cell control group；#P<0.05，##P<0.01，compared with LPS group.

2.4 rhNGF抑制BV2細(xì)胞誘導(dǎo)的N2a細(xì)胞凋亡

2.4.1 rhNGF 抑制BV2 細(xì)胞-N2a 細(xì)胞共培養(yǎng)體系中N2a細(xì)胞凋亡

圖4A 結(jié)果顯示，與細(xì)胞對(duì)照組相比，LPS 直接與N2a 神經(jīng)細(xì)胞培養(yǎng)12 和24 h，TUNEL+NeuN+細(xì)胞百分率顯著升高（P<0.01）。與LPS 直接作用組相比，LPS 干預(yù)后的BV2 細(xì)胞與N2a 細(xì)胞共培養(yǎng)12 和24 h，TUNEL+NeuN+細(xì)胞百分率顯著升高（P<0.01）。LPS+rhNGF 50 和500 μg·L-1共同干預(yù)后的BV2 細(xì)胞與N2a 細(xì)胞共培養(yǎng)12 和24 h，與LPS 干預(yù)的BV2 細(xì)胞與N2a 細(xì)胞共培養(yǎng)組相比，TUNEL+NeuN+細(xì)胞百分率顯著降低（P<0.05，P<0.01）。上述結(jié)果表明，炎癥狀態(tài)下BV2 細(xì)胞可誘導(dǎo)N2a細(xì)胞凋亡，rhNGF可抑制炎癥狀態(tài)下BV2細(xì)胞誘導(dǎo)的N2a細(xì)胞凋亡。

Fig.4 Iinhibitory effect of rhNGF on inflammation-mediated N2a neuron apoptosis. BV2 cells were divided into cell control，LPS 1 mg·L-1，and LPS+rhNGF 50 and 500 μg·L-1 groups. After treatment as Fig.2，BV2 cells and culture supernatant（microglial con?ditioned medium，MCM）were collected. A：N2a cells were co-cultured with BV2 cells collected above for 12 or 24 h before being stained by double of TUNEL and neuron specific nuclear protein（NeuN）. A1：representative immunofluorescence images of 12 h（24 h not shown）. Green：NeuN；red：TUNEL；blue：DAPI. A2：the proportion of TUNEL+NeuN+/NeuN+cells. ±s，n=6. B：N2a cells were co-cultured with MCM collected above for 12 or 24 h，then N2a cell viability and early apoptotic cell（annexin V+7-AAD?）percent were detected by CCK-8 kit and Annexin V/7-AAD assay，respectively. B1：viability of N2a cells at 24 h. ±s，n=6. B2：early apoptotic cell percent of N2a cells at 12 and 24 h. ±s，n=3. ＊P<0.05，＊＊P<0.01，compared with cell control group；#P<0.05，##P<0.01，compared with LPS-group or MCM-control；ΔP<0.05，ΔΔP<0.01，compared with co-culture group with LPS-treated BV2 cells or MCM-LPS group.

2.4.2 rhNGF 抑制BV2 細(xì)胞MCM 介導(dǎo)的N2a 細(xì)胞凋亡

圖4B1 和B2 結(jié)果顯示，與細(xì)胞對(duì)照組相比，LPS 組（LPS 直接與N2a 細(xì)胞培養(yǎng)）N2a 細(xì)胞存活率顯著降低（P<0.05），早期凋亡細(xì)胞百分率明顯增加（P<0.05）。將MCM-對(duì)照、MCM-LPS 或MCMrhNGF 50 和100 μg·L-1與N2a 細(xì)胞共培養(yǎng)12 和24 h，MCM-LPS 組N2a 細(xì)胞存活率顯著低于LPS組和MCM-對(duì)照組（P<0.01），早期凋亡細(xì)胞百分率則明顯高于該2 組（P<0.05，P<0.01）。與MCMLPS 組比較，MCM-rhNGF 50 和500 μg·L-1組N2a細(xì)胞存活率顯著升高（P<0.05，P<0.01），細(xì)胞早期凋亡百分率顯著降低（P<0.01）。上述結(jié)果表明，炎癥狀態(tài)下BV2 細(xì)胞分泌至上清的細(xì)胞因子可促進(jìn)N2a 細(xì)胞凋亡，rhNGF 可抑制BV2 細(xì)胞分泌的細(xì)胞因子介導(dǎo)的N2a細(xì)胞凋亡。

3 討論

外源性NGF 能夠促進(jìn)神經(jīng)修復(fù)和調(diào)節(jié)免疫反應(yīng)，被認(rèn)為是中樞神經(jīng)系統(tǒng)疾病的潛在保護(hù)和治療因子，廣泛應(yīng)用于臨床，但rhNGF 神經(jīng)保護(hù)作用機(jī)制尚不明確。在中樞神經(jīng)系統(tǒng)疾病的發(fā)生發(fā)展過程中，神經(jīng)炎癥是常見的病理特征，也能直接或間接地調(diào)節(jié)神經(jīng)細(xì)胞功能［21-22］。因此，對(duì)免疫系統(tǒng)和神經(jīng)系統(tǒng)之間的相互作用的控制是預(yù)防或治療大多數(shù)中樞神經(jīng)系統(tǒng)疾病的關(guān)鍵，其中神經(jīng)元和神經(jīng)膠質(zhì)（特別是小膠質(zhì)細(xì)胞）之間的相互作用尤為突出［23］。因此，本研究主要關(guān)注rhNGF 對(duì)神經(jīng)元與小膠質(zhì)細(xì)胞相互作用的調(diào)節(jié)。

促炎因子水平異常升高是導(dǎo)致炎癥損傷的關(guān)鍵因素，促炎因子也是神經(jīng)系統(tǒng)疾病重要的治療靶標(biāo)之一［24］。本研究用LPS 刺激BV2 小膠質(zhì)細(xì)胞建立細(xì)胞炎癥模型，發(fā)現(xiàn)rhNGF能明顯改善BV2細(xì)胞激活后的形態(tài)變化并提高細(xì)胞存活率，初步證實(shí)rhNGF對(duì)細(xì)胞的保護(hù)作用。最近研究表明，NGF的免疫調(diào)節(jié)作用可減輕腦損傷后的神經(jīng)炎癥［25］。有報(bào)道稱，在缺血性腦卒中治療中，抗炎治療策略比目前主要的基于再灌注的方法具有更好的潛在適用性［26］。然而，通過調(diào)節(jié)炎癥免疫治療神經(jīng)損傷仍處于探索階段。本研究結(jié)果表明，在BV2 細(xì)胞炎癥模型上，rhNGF 顯著降低過度激活的BV2細(xì)胞促炎因子IL-1β，IL-6 和TNF-α 表達(dá)，促進(jìn)抗炎因子IL-4和IL-10 表達(dá)，提示rhNGF 可抑制LPS 誘導(dǎo)的BV2小膠質(zhì)細(xì)胞炎癥反應(yīng)。

目前，對(duì)于中樞炎癥反應(yīng)的研究已不局限于抑制小膠質(zhì)細(xì)胞，而是傾向于誘導(dǎo)小膠質(zhì)細(xì)胞從促炎癥M1表型轉(zhuǎn)化為抗炎性M2表型，即調(diào)節(jié)M1與M2表型的比值。本研究結(jié)果表明，rhNGF 能夠誘導(dǎo)BV2 小膠質(zhì)細(xì)胞從促炎M1 表型轉(zhuǎn)換為抗炎M2 表型，從而調(diào)節(jié)炎癥反應(yīng)。rhNGF 對(duì)小膠質(zhì)細(xì)胞表型轉(zhuǎn)化的調(diào)節(jié)可能是其抗炎機(jī)制之一。因此，調(diào)節(jié)M1/M2 極化狀態(tài)比值可能為神經(jīng)炎癥疾病的治療和新型抗炎藥的開發(fā)提供一種新的靶向治療方法。

在許多神經(jīng)系統(tǒng)疾病中，細(xì)胞凋亡是神經(jīng)損傷的重要環(huán)節(jié)，而NGF 可減少細(xì)胞凋亡，促進(jìn)神經(jīng)重建［27-28］。為模擬體內(nèi)的炎癥環(huán)境，本研究將LPS 和LPS+rhNGF 活化的BV2 小膠質(zhì)細(xì)胞及其MCM 與N2a 神經(jīng)細(xì)胞共培養(yǎng)。結(jié)果表明，rhNGF 顯著抑制LPS激活的BV2小膠質(zhì)細(xì)胞及其MCM 對(duì)N2a神經(jīng)細(xì)胞的促凋亡作用，增加N2a 神經(jīng)細(xì)胞存活率。由此提示，rhNGF 可通過抑制BV2小膠質(zhì)細(xì)胞炎癥介導(dǎo)的神經(jīng)元凋亡發(fā)揮神經(jīng)保護(hù)作用，且該抑制作用可能部分依賴于對(duì)BV2 小膠質(zhì)細(xì)胞炎癥因子釋放的抑制作用。

綜上，本研究發(fā)現(xiàn)，rhNGF 通過調(diào)節(jié)小膠質(zhì)細(xì)胞活化狀態(tài)和抑制炎癥介導(dǎo)的細(xì)胞凋亡發(fā)揮神經(jīng)保護(hù)作用，提高了對(duì)rhNGF 神經(jīng)保護(hù)作用機(jī)制的理解，并進(jìn)一步表明小膠質(zhì)細(xì)胞的調(diào)節(jié)是rhNGF 克服神經(jīng)炎癥相關(guān)疾病的一種新的治療策略。今后將進(jìn)一步探討rhNGF 在體內(nèi)抑制神經(jīng)炎癥和保護(hù)神經(jīng)元的作用，以深入了解rhNGF 治療神經(jīng)損傷疾病的可行性。