母體外周血胎兒游離DNA濃度與不良圍產(chǎn)結(jié)局的相關(guān)性探究

李佳欣 宮曉麗 石慧峰 原鵬波 陳練 魏瑗 趙揚(yáng)玉

胎兒游離DNA(cell-free fetal DNA,cffDNA)的發(fā)現(xiàn)推動(dòng)了無創(chuàng)產(chǎn)前檢測(cè)技術(shù)(non-invasive prenatal test, NIPT)的迅速發(fā)展,因其具有無創(chuàng)性、較高的敏感性和特異性,目前已廣泛應(yīng)用于臨床上篩查高危人群的胎兒21-三體、18-三體和13-三體。cffDNA來源于胎盤滋養(yǎng)層細(xì)胞的凋亡和釋放,cffDNA濃度的變化可能間接反映胎盤功能變化。少數(shù)國外的研究發(fā)現(xiàn),在早、中孕期cffDNA濃度低的孕婦發(fā)生妊娠期高血壓、子癇前期、妊娠期糖尿病、早產(chǎn)、胎兒宮內(nèi)生長受限等妊娠并發(fā)癥的風(fēng)險(xiǎn)增加[1-4]。cffDNA有望成為胎盤相關(guān)妊娠疾病早期篩查的新靶標(biāo),然而國內(nèi)缺乏相關(guān)大樣本量的隊(duì)列研究。本研究擬基于本院NIPT檢測(cè)的單胎妊娠孕婦隊(duì)列,隨訪圍產(chǎn)結(jié)局,評(píng)估cffDNA濃度與不良圍產(chǎn)結(jié)局的相關(guān)性,以期為妊娠并發(fā)癥的早期篩查提供新思路。

對(duì)象與方法

一、研究對(duì)象

回顧性收集2017年4月—2021年4月本院行NIPT檢測(cè)的孕婦12 085例,經(jīng)過納排標(biāo)準(zhǔn)篩選活產(chǎn)分娩的單胎妊娠孕婦。

1.納入標(biāo)準(zhǔn)：(1)單胎妊娠;(2)符合NIPT篩查指征且NIPT檢測(cè)獲得有效結(jié)果：血清學(xué)產(chǎn)前篩查臨界風(fēng)險(xiǎn)(1/1 000≤21-三體風(fēng)險(xiǎn)值<1/250,1/1 000≤18-三體風(fēng)險(xiǎn)值<1/350)、介入性產(chǎn)前診斷禁忌癥以及錯(cuò)過血清學(xué)篩查最佳時(shí)間、自愿要求等;(3)孕婦在本院分娩,臨床信息完整。

2.排除標(biāo)準(zhǔn)：(1)檢測(cè)孕周<12周;(2)胎兒染色體異常或結(jié)構(gòu)畸形;(3)流產(chǎn)(<28周分娩),包括晚期自然流產(chǎn)、不明原因胎死宮內(nèi)、因母體因素或胎兒畸形中期引產(chǎn)。

本研究經(jīng)本院倫理委員會(huì)審核批準(zhǔn)(M2021225)。

二、研究方法

1. 樣本采集：采集孕婦的外周靜脈血10 mL,乙二胺四乙酸抗凝,24 h內(nèi)分離血漿,具體流程為：4℃、1 600×g離心10 min,取上清血漿;1 600×g離心10 min,分離上清血漿至EP管中;取600 μL血清樣本提取DNA。

2. cffDNA提取、建庫及測(cè)序：使用QIAamp DSP DNA試劑盒提取得到cffDNA,通過實(shí)時(shí)定量聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(Real Time quantification Polymerase Chain Reaction,RT-qPCR)技術(shù)進(jìn)行DNA擴(kuò)增和文庫制備。利用高通量測(cè)序平臺(tái)(BioelectronSeq 4000基因測(cè)序儀),通過半導(dǎo)體測(cè)序法對(duì)其進(jìn)行堿基序列讀取和計(jì)數(shù),獲得不低于400 M的有效讀數(shù)。通過TMAP軟件將所有測(cè)序數(shù)據(jù)與人類基因組參考序列進(jìn)行對(duì)比、生物信息分析,得出胎兒患21-三體、18-三體、13-三體的風(fēng)險(xiǎn)值。

3. cffDNA濃度測(cè)定和分組：采用Y染色體基因(ChrY)標(biāo)記男胎DNA,應(yīng)用RT-qPCR估算男胎的cffDNA濃度。基于TaqMan熒光定量PCR結(jié)合高通量測(cè)序檢測(cè)胎兒特異性單核苷酸多態(tài)性位點(diǎn),以此作為cffDNA標(biāo)記物計(jì)算女胎cffDNA濃度。cffDNA濃度的分組：依據(jù)cffDNA濃度在整個(gè)cffDNA濃度梯度的百分位分為四組,即cffDNA濃度≤25th、25th75th,將cffDNA濃度≤25th定義為低濃度組。

4. 病歷資料搜集：搜集的資料包括孕婦采血時(shí)的年齡、孕周(根據(jù)末次月經(jīng)和孕早期超聲胎兒頭臂長核對(duì)孕周)、體質(zhì)指數(shù)(body mass index, BMI),以及分娩次數(shù)、受孕方式。從實(shí)驗(yàn)室獲取NIPT檢測(cè)結(jié)果、cffDNA濃度。通過病案系統(tǒng)獲取妊娠期合并癥及并發(fā)癥、分娩孕周和新生兒出生體重。

5. 結(jié)局指標(biāo)：包括妊娠期高血壓(gestational hypertension,GHT)、子癇前期(preeclampsia, PE)、妊娠期糖尿病(gestational diabetes mellitus, GDM)、自發(fā)性早產(chǎn)(spontaneous preterm birth, SPB),胎兒宮內(nèi)生長受限(fetal growth restriction, FGR)。其中PE按嚴(yán)重程度分為早發(fā)型子癇前期(early onset preeclampsia,Early Onset PE)、重度子癇前期(severe preeclampsia, SPE)、子癇前期并發(fā)胎兒宮內(nèi)生長受限(preeclampsia complicated with fetal growth restriction,PE with FGR)。所有疾病診斷標(biāo)準(zhǔn)均參照第九版《婦產(chǎn)科學(xué)》。

6. 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理：應(yīng)用SPSS 26.0軟件對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。本隊(duì)列的連續(xù)變量資料均不符合正態(tài)分布,以中位數(shù)(四分位間距)表示,組間差異比較采用Kruskal Wallis 檢驗(yàn);分類變量資料采用頻數(shù)及率進(jìn)行描述,組間差異比較采用χ2檢驗(yàn)或Fisher精確概率法。多因素分析采用Logistic回歸分析分別計(jì)算未校正和校正后的OR值和95%的置信區(qū)間。使用受試者工作特征曲線(receiver operating characteristic curve, ROC Curve)評(píng)估cffDNA濃度對(duì)不良圍產(chǎn)結(jié)局的預(yù)測(cè)效果,計(jì)算曲線下面積(area under the curve, AUC)。P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

結(jié) 果

一、研究對(duì)象一般情況

2017年4月—2021年4月本院行NIPT檢測(cè)的孕婦12 085例,排除NIPT檢測(cè)失敗134例、孕婦臨床信息不完整1 062例、胎兒染色體異常或結(jié)構(gòu)畸形88例、晚期自然流產(chǎn)112例、不明原因胎死宮內(nèi)32例、因母體因素中期引產(chǎn)11例、多胎妊娠729例,研究隊(duì)列最終納入單胎妊娠孕婦9 917例。

圖1 流程圖Figure 1 Flowchart

二、孕婦和胎兒的一般情況

表1列出不同cffDNA濃度梯度的母胎基線特征。采血時(shí)的孕周中位數(shù)為16+3(15～17)周,各組間采血孕周差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P=0.18),各組間的孕婦采血年齡、BMI、受孕方式、孕產(chǎn)次差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05),其中cffDNA濃度≤25th(低濃度組)與cffDNA濃度>75th百分位相比,低濃度組的檢測(cè)時(shí)孕婦年齡更高(年齡中位數(shù)33 vs 32,P=0.02),孕婦BMI更大(BMI中位數(shù)23.2 vs 21.3,P<0.01),人工輔助受孕率更高(16.2% vs 12.1%,P<0.01),產(chǎn)次≥1的概率更高(15.9% vs 8.4%,P<0.01)。各組間的分娩孕周、新生兒出生體重?zé)o統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P>0.05)。

表1 不同cffDNA濃度梯度的母胎基線特征Table 1 Maternal and fetal baseline characteristics by cffDNA fraction layers

三、cffDNA濃度與不良圍產(chǎn)結(jié)局的多因素分析

表2顯示了不同cffDNA濃度梯度發(fā)生不良圍產(chǎn)結(jié)局的風(fēng)險(xiǎn),以cffDNA濃度>75th為參考,校正孕婦年齡、BMI、受孕方式、產(chǎn)次后,cffDNA濃度≤25th(低濃度組)發(fā)生GHT(校正后的OR=1.5, 95%CI：1.1～2.1)、PE(校正后的OR=1.5, 95%CI：1.1～1.9)、GDM(校正后的OR=1.2, 95%CI：1.1～1.4)、FGR(校正后的OR=1.8, 95%CI：1.3～2.6)的風(fēng)險(xiǎn)更高,且cffDNA濃度梯度越低,上述妊娠并發(fā)癥的風(fēng)險(xiǎn)越大。但cffDNA濃度≤25th與自發(fā)性早產(chǎn)(校正后的OR=0.9, 95%CI：0.8～1.2)無明顯相關(guān)性。圖2(1)森林圖展示了不同cffDNA濃度梯度發(fā)生GHT、PE、GDM、FGR的風(fēng)險(xiǎn)情況。

表2 不同cffDNA濃度梯度與不良圍產(chǎn)結(jié)局的相關(guān)性Table 2 Correlation between different cffDNA fraction layers and adverse perinatal outcomes

圖2 (1) cffDNA濃度梯度與圍產(chǎn)結(jié)局的風(fēng)險(xiǎn)森林圖;圖2(2)cffDNA濃度梯度與不同類型子癇前期的風(fēng)險(xiǎn)森林圖Figure 2 (1) OR values of cffDNA fraction layer and perinatal outcomes; Figure 2(2) OR values of cffDNA fraction layer and different types of preeclampsia.

另外,比較不同cffDNA濃度梯度在不同類型PE的發(fā)生風(fēng)險(xiǎn)(表2),發(fā)現(xiàn)cffDNA濃度≤25th發(fā)生早發(fā)型PE(校正后的OR=3.5, 95%CI：1.7～7.4)、PE并發(fā)FGR(校正后的OR=2.2, 95%CI：1.0～4.7)和重度PE(校正后的OR=1.4, 95%CI：1.0～2.0)的風(fēng)險(xiǎn)更高,其中發(fā)生早發(fā)型PE的風(fēng)險(xiǎn)最大,是cffDNA濃度>75th的3.5倍,表明cffDNA濃度降低與PE的嚴(yán)重程度有關(guān),發(fā)病越早、病情越重,cffDNA濃度越低。圖2(2)森林圖展示了不同cffDNA濃度梯度發(fā)生PE、PE并發(fā)FGR、早發(fā)型PE、重度PE的風(fēng)險(xiǎn)情況。

四、cffDNA濃度聯(lián)合母體因素對(duì)妊娠并發(fā)癥的ROC曲線分析：

使用cffDNA濃度以及cffDNA濃度結(jié)合孕婦年齡、BMI、受孕方式、產(chǎn)次因素進(jìn)行ROC曲線分析(表3和圖3),cffDNA濃度聯(lián)合母體因素對(duì)早發(fā)型PE和PE并發(fā)FGR的預(yù)測(cè)準(zhǔn)確性最高,早發(fā)型PE的AUC值0.9(0.9～1.0),敏感性93.6%,特異性89.2%,PE并發(fā)FGR的AUC值 0.9(0.9～1.0),敏感性93.8%,特異性86.2%。

表3 cffDNA濃度聯(lián)合母體因素對(duì)圍產(chǎn)結(jié)局的ROC分析Table 3 ROC analysis of cffDNA fraction combined with maternal factors on perinatal outcomes

圖3 cffDNA濃度聯(lián)合母體因素對(duì)妊娠并發(fā)癥的ROC曲線分析Figure 3 ROC curves of cffDNA fraction combined with maternal factors on perinatal outcomes

討 論

本研究是目前探究低cffDNA濃度與不良圍產(chǎn)結(jié)局相關(guān)性研究中樣本量最大的隊(duì)列研究。本研究發(fā)現(xiàn)在孕12+0～26+6周的母體外周血中,不同cffDNA濃度梯度發(fā)生不良圍產(chǎn)結(jié)局的風(fēng)險(xiǎn)存在差異。低cffDNA濃度,即cffDNA濃度≤25th(cffDNA濃度≤13.3%)發(fā)生GHT、PE、GDM和FGR的風(fēng)險(xiǎn)最高。

一、低cffDNA與妊娠期高血壓疾病：GHT是指妊娠20周后新發(fā)的血壓升高,而PE是在GHT的基礎(chǔ)上伴有尿蛋白陽性或靶器官損傷,該類疾病嚴(yán)重威脅母嬰健康,是全球范圍內(nèi)孕產(chǎn)婦和圍產(chǎn)兒病死率升高的主要原因。目前臨床上缺乏對(duì)PE有效的治療方法,主要是對(duì)癥治療和適時(shí)終止妊娠,但也會(huì)增加醫(yī)源性早產(chǎn)的概率,已有研究表明[5]對(duì)PE高風(fēng)險(xiǎn)的孕婦從妊娠11+0～14+0周開始每天口服150mg阿司匹林至36周,可以有效降低PE早產(chǎn)的風(fēng)險(xiǎn)。因此,早期篩查、早期防治對(duì)降低PE的發(fā)生率和改善不良圍產(chǎn)結(jié)局具有重要意義,而目前通過病史聯(lián)合血清學(xué)指標(biāo)預(yù)測(cè)PE的方法效率不高,故臨床上亟需一種高效、早期的標(biāo)志物可以有效預(yù)測(cè)PE。cffDNA可以間接反映胎盤功能,又能在妊娠早期檢測(cè),有望成為PE預(yù)測(cè)的新靶標(biāo)。本研究發(fā)現(xiàn),GHT和PE的風(fēng)險(xiǎn)隨cffDNA濃度的下降有升高的趨勢(shì),cffDNA濃度≤25th、25th75th的1.5倍、1.4倍、1.2倍,發(fā)生PE的概率依次是cffDNA濃度>75th的1.5倍、1.3倍、1.1倍。在PE的亞組中,相比于cffDNA濃度>75th,cffDNA濃度≤25th時(shí)PE并發(fā)FGR的風(fēng)險(xiǎn)是2.2倍、早發(fā)型PE的風(fēng)險(xiǎn)是3.5倍,均高于cffDNA濃度≤25th在總體PE中的風(fēng)險(xiǎn),ROC曲線分析cffDNA濃度對(duì)不同類型PE預(yù)測(cè)的AUC值分別為早發(fā)型PE 0.9、PE并發(fā)FGR 0.9、重度PE 0.6,說明PE的病情越嚴(yán)重、發(fā)病時(shí)間越早,與cffDNA濃度≤25th的相關(guān)性越強(qiáng)。本研究與既往國外的幾項(xiàng)研究結(jié)果一致[1-4]。胎盤功能的異常及子宮胎盤血供的減少在PE的發(fā)生上起著重要的作用,cffDNA主要由胎盤滋養(yǎng)層細(xì)胞凋亡產(chǎn)生,胎盤的體積與功能決定了凋亡細(xì)胞的數(shù)量。PE絨毛外滋養(yǎng)細(xì)胞浸潤能力受損、子宮螺旋動(dòng)脈重鑄不足使胎盤灌注減少、炎性反應(yīng)的激活導(dǎo)致胎盤絨毛凝聚,均可導(dǎo)致胎盤體積減小和功能障礙,使胎盤釋放的cffDNA減少[6]。但目前的研究并未給出具體的cffDNA濃度閾值,需要一個(gè)大樣本的縱向研究以評(píng)估PE孕婦在不同孕期cffDNA濃度的變化,以及與非PE孕婦的差異,以期為PE的早期篩查提供新思路。

二、低cffDNA與胎兒宮內(nèi)生長受限：FGR是指胎兒應(yīng)有的生長潛能受損,估測(cè)的胎兒體重小于同孕齡第10百分位,胎盤功能是影響胎兒生長因素的主要原因之一,FGR的早期篩查及早期干預(yù)對(duì)于胎兒生長發(fā)育具有重要意義。本研究表明隨著cffDNA濃度梯度降低,FGR的發(fā)生風(fēng)險(xiǎn)升高,cffDNA濃度≤25th時(shí)FGR的風(fēng)險(xiǎn)是cffDNA濃度>75th的1.8倍。既往研究也報(bào)道過cffDNA濃度降低與FGR的風(fēng)險(xiǎn)增加有關(guān),Clapp等[7]研究發(fā)現(xiàn)在cffDNA濃度<5th(cffDNA濃度<5.3%)的孕婦中,新生兒出生體重<10th的風(fēng)險(xiǎn)增加(OR=2.3, 95%CI：1.2～4.7),新生兒出生體重<5th的風(fēng)險(xiǎn)更高(OR= 3.7, 95%CI：1.4～9.0)。廣泛的胎盤血管內(nèi)皮損傷、胎盤灌注下降使得胎盤體積減小和胎盤功能障礙,進(jìn)而導(dǎo)致胎兒血供減少、發(fā)育遲緩,也使得cffDNA濃度降低[8],cffDNA對(duì)FGR的預(yù)測(cè)潛能有待進(jìn)一步研究。

三、低cffDNA與妊娠期糖尿病：GDM是指妊娠期首次發(fā)生的血糖高于正常標(biāo)準(zhǔn)值,可能導(dǎo)致微血管病變、胎盤血管異常,進(jìn)而影響胚胎和胎盤的發(fā)育[9],血糖控制不佳者,對(duì)母兒的影響極大,感染、羊水過多、巨大兒、新生兒低血糖等風(fēng)險(xiǎn)增加。目前GDM主要依靠妊娠24～28周進(jìn)行75g口服糖耐量實(shí)驗(yàn)(oral gucose tolerance test, OGTT)診斷,診斷時(shí)間接近孕晚期,早期預(yù)測(cè)可以更早的進(jìn)行飲食指導(dǎo)和體重管理,改善母胎結(jié)局。本研究表明低cffDNA濃度組發(fā)生GDM的風(fēng)險(xiǎn)更高(OR=1.2, 95%CI：1.1～1.4),Hopkins等[10]一項(xiàng)病例對(duì)照研究也顯示,GDM孕婦與正常孕婦相比,cffDNA濃度更低,認(rèn)為GDM孕婦體重更大、肥胖比例更高,肥胖孕婦血容量增加導(dǎo)致母體游離DNA增加,另外脂肪組織的壞死、凋亡增加也會(huì)導(dǎo)致母體游離DNA增加,對(duì)cffDNA產(chǎn)生稀釋作用,使cffDNA濃度下降[11]。荷蘭的一項(xiàng)NIPT篩查隊(duì)列納入了295例因cffDNA濃度<4%導(dǎo)致NIPT檢測(cè)失敗的孕婦,與荷蘭正常孕婦人群進(jìn)行比較,發(fā)現(xiàn)cffDNA濃度低的孕婦發(fā)生GDM的概率更高,但該研究未校正孕婦BMI[2]。本研究在校正BMI后,差異仍具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(校正后的OR=1.2, 95%CI：1.1～1.4),表明在排除母體因素后,cffDNA濃度低與GDM仍存在相關(guān)性。但不可否認(rèn),孕婦BMI升高與GDM的發(fā)生有關(guān),也與cffDNA濃度降低有關(guān)[12-13],BMI對(duì)研究結(jié)果具有不可忽視的影響,因此cffDNA濃度對(duì)GDM的預(yù)測(cè)價(jià)值尚需進(jìn)一步探討,后續(xù)可對(duì)BMI正常和肥胖人群進(jìn)行分層分析。

四、低cffDNA與自發(fā)性早產(chǎn)：SPB指妊娠達(dá)28周但不足37周且排除醫(yī)源性因素分娩者,目前臨床上多認(rèn)為孕24周前超聲檢測(cè)宮頸長度<25mm,提示SPB風(fēng)險(xiǎn)增大,但對(duì)SPB的預(yù)測(cè)價(jià)值還不明確。胎盤血管灌注損傷可能是SPB發(fā)病的原因之一,近年來,cffDNA在預(yù)測(cè)SPB方面的探索引起了研究者們極大的關(guān)注。Yuan等[4]納入了2191例孕13～26周行NIPT的單胎孕婦,發(fā)現(xiàn)cffDNA濃度<10th時(shí),<34周分娩的SPB(OR=3.1, 95%CI：1.2～7.9)風(fēng)險(xiǎn)更高。也有研究表明cffDNA濃度與SPB無顯著相關(guān)性[3,14],與本研究結(jié)果一致。SPB病因復(fù)雜,也可能與炎性損傷和物理應(yīng)激有關(guān),cffDNA濃度對(duì)SPB的預(yù)測(cè)價(jià)值尚不明確。

五、研究優(yōu)勢(shì)與局限性：目前國內(nèi)針對(duì)cffDNA濃度與不良圍產(chǎn)結(jié)局相關(guān)性研究數(shù)量少且樣本量小,證據(jù)性不高,而本研究是目前國內(nèi)分析cffDNA低濃度與不良圍產(chǎn)結(jié)局相關(guān)性研究中樣本量最大的單胎隊(duì)列研究。另外,國外的研究對(duì)于低濃度的定義多數(shù)是cffDNA濃度<4%,即主要分析NIPT失敗與不良圍產(chǎn)結(jié)局的相關(guān)性,但NIPT失敗的發(fā)生率僅為0.1%～3%[15],與NIPT成功組樣本量差距懸殊,故以cffDNA濃度<4%作為閾值預(yù)測(cè)妊娠并發(fā)癥可能不適用于大多數(shù)孕婦,本研究依據(jù)隊(duì)列的cffDNA總體水平進(jìn)行cffDNA濃度梯度分組,定義cffDNA濃度≤25th(cffDNA濃度≤13.3%)為低濃度組,提高了cffDNA的濃度閾值,且各濃度梯度組間樣本量基本相同,對(duì)于比較不良圍產(chǎn)結(jié)局的發(fā)生風(fēng)險(xiǎn)準(zhǔn)確性更高。本研究雖然是單中心研究,無法判斷不同醫(yī)療水平對(duì)結(jié)果的影響,但所有樣本的檢測(cè)環(huán)境和分析方法一致,排除了樣本檢測(cè)差異的干擾。另外,本研究未分析cffDNA濃度在不同孕周和疾病發(fā)生前后的變化趨勢(shì),需要縱向研究進(jìn)行更深入的探討。

綜上所述,cffDNA低濃度與不良圍產(chǎn)結(jié)局有關(guān),發(fā)生妊娠期高血壓、子癇前期、妊娠期糖尿病、胎兒宮內(nèi)生長受限的風(fēng)險(xiǎn)更高,且子癇前期病情越重、發(fā)病時(shí)間越早,風(fēng)險(xiǎn)越高。cffDNA有望成為胎盤相關(guān)妊娠并發(fā)癥預(yù)測(cè)的新靶標(biāo)。