卵母細胞大極體對ICSI周期受精、胚胎發育及臨床結局的影響

李丹 任新玲 江亞萍 張思佳

卵母細胞是決定輔助生殖技術(assisted reproductive technology,ART)成功與否的最重要因素之一。卵母細胞的質量不但與受精率密切相關,而且能夠明顯地影響后續形成的胚胎的發育能力[1]。客觀準確地評估卵母細胞質量,幫助胚胎學家選擇出具有優越發育能力的胚胎,才能最終提高輔助生殖的臨床效率。本研究的目的是通過評估ICSI周期大極體卵母細胞的受精、胚胎發育及妊娠結局,觀察卵母細胞大極體是否是影響胚胎質量的預測因素,從而輔助移植胚胎選擇,以幫助其改善ART后的妊娠結局。

對象與方法

一、研究對象

本研究回顧性分析華中科技大學同濟醫學院附屬同濟醫院生殖醫學中心2017年1月—2021年12月行輔助生殖助孕的不孕癥患者的臨床資料,將ICSI中含有大極體卵母細胞的112個新鮮周期作為研究對象,并將ICSI注射的880枚成熟卵母細胞(MII)根據第一極體大小分為大極體組和正常極體組,見圖1,分別比較兩組胚胎的受精、發育潛能和臨床結局。納入標準：(1)ICSI周期;(2)女方年齡≤40歲;(3)至少含有1枚大極體卵母細胞。本研究通過本院醫學倫理委員會批準,所有患者夫妻雙方均了解并知情同意。

圖1 第一極體的形態(×200,比例尺=20 μm)Figure 1 Morphology of the first polar body(×200, scale bar=20 μm)

二、研究方法

1.卵母細胞收集及脫顆粒：按本中心常規方案促排卵,肌肉注射人絨毛膜促性腺激素(human chorionic gonadotropin,HCG)10 000 U,36 h后在陰道超聲監測下穿刺取卵。取出卵母細胞后,將卵冠丘復合物(cumulus oocyte complexes,COCs)置培養箱中培養(37 ℃,6%CO2),獲卵后2～4 h按采卵的先后順序用80 IU/mL的透明質酸酶(vitrolife,瑞典)消化COCs,并用stripper(140 um,cook,美國)機械法去除顆粒細胞,去除顆粒細胞后置于G-1卵裂培養液(Vitrolife,瑞典)中培養。

2.ICSI注射及第一極體形態評估：在HCG給藥后36～41 h進行ICSI注射,ICSI注射時在顯微鏡下對MII卵母細胞第一極體大小進行評估并詳細記錄,146枚第一極體明顯增大的MII卵母細胞為大極體組,734枚第一極體大小正常的MII卵母細胞為正常極體組。ICSI受精后將胚胎置于G-1卵裂培養液(Vitrolife,瑞典)中,在37 ℃,6.0% CO2,5.0% O2,89.0% N2的EmbryoScopeTM延時監測(time-lapse monitoring,TLM)培養箱(Vitrolife,瑞典)中進行體外胚胎培養。

3.胚胎評估：16～18 h評估卵母細胞受精情況并記錄原核(pronucleus,PN)數目：2PN為正常受精;NPN為未受精;1PN和≥3PN分別為 1個原核和≥3個原核的異常受精。

本中心D2/D3卵裂胚評分標準：1級,卵裂球大小均勻且碎片≤5%;2級,卵裂球大小均勻或稍不均勻≤20%;3級,卵裂球大小嚴重不均且碎片<50%,或卵裂球無大小嚴重不均、碎片20%～50%;4級,胚胎卵裂球少,碎片≥50%。2PN卵裂指的是D1為正常受精(2PN),D2卵裂球數為≥2個。D3優質胚胎標準：D1為正常受精(2PN),D2卵裂球數為 4～5個,D3卵裂球數7～10個,卵裂球大小均勻且碎片<10%。本中心常規將D3 移植胚胎以外剩余的胚胎繼續培養,并采用 Gardner 囊胚評分系統[2]根據囊胚腔擴張程度、內細胞團(inner cell mass,ICM)和滋養層細胞(trophectoderm,TE)的形態和數目對囊胚進行質量評估。冷凍囊胚標準：D5/D6囊胚評分≥3/4 BC。優質囊胚標準：D5/D6囊胚評分≥3/4 BB。

4.妊娠結局的評估：胚胎移植后12～14 d進行HCG檢測。臨床妊娠為胚胎移植后至少5周行陰道B超可見孕囊,包括宮外孕;活產是指胎兒娩出后至少具有生命體征心跳、呼吸、臍帶搏動、隨意肌收縮之一;臨床妊娠后20周內無胎心活動為流產;生化妊娠指胚胎移植4～6周HCG陽性,但陰道B超未見到孕囊。

結 果

一、兩組基礎資料的比較：大極體組卵泡刺激素(follicle-stimulating hormone,FSH)高于正常極體組(P<0.05),兩組的女方年齡、體質指數(body mass index,BMI)、不孕類型、不孕年限比較均無統計學差異(P>0.05)。見表1。

表1 兩組基本情況比較Table 1 Comparison of the two groups of basic information

二、兩組受精和胚胎發育情況比較：大極體組2PN受精率顯著低于正常極體組(P<0.05);≥3PN率顯著高于正常極體組(P<0.01);1PN率和退化率(degradation rate,DA)呈升高趨勢,但均無統計學差異(P>0.05)。與正常極體組相比,大極體組2PN卵裂率呈下降趨勢,D3優胚率、囊胚形成率、可利用囊胚率、優質囊胚率均明顯降低,但僅囊胚形成率有統計學差異(P<0.01)。見表2。

表2 兩組受精和胚胎發育情況比較Table 2 Comparison of the fertilization and embryo development between the two groups[n(%)]

三、多因素Logistic回歸分析各因素對受精和胚胎發育的影響：Logistic回歸結果顯示,考慮了女方年齡、FSH、BMI、不孕類型、不孕年限等混雜因素后,與正常極體組相比,大極體組2PN受精率顯著降低(OR：0.63,95%CI：0.44～0.91,P<0.05);≥3PN率顯著增高(OR：3.99,95%CI：1.95～8.16,P<0.001);D3優胚率(OR：0.54,95%CI：0.31～0.93,P<0.05)和囊胚形成率(OR：0.42,95%CI：0.23～0.78,P<0.01)顯著降低。見表3。

表3 多因素Logistic回歸分析卵母細胞大極體對受精和胚胎發育的影響Table 3 Effects of oocytes with large polar bodies on fertilization and embryo development by logistic regression analysis

四、妊娠結局隨訪：以新鮮周期移植D3卵裂期胚胎進行比較,大極體組移植一個大極體來源的胚胎4例,臨床妊娠1例,流產1例;分別來源于大極體組和正常極體組的兩個胚胎聯合移植8例,均未妊娠。正常極體組單個胚胎移植23例,臨床妊娠12例,活產8例,流產4例,來源于正常極體組的兩個胚胎聯合移植6例,臨床妊娠3例,活產2例,流產1例。復蘇移植大極體來源的囊胚共6例,3例移植一個大極體來源囊胚,3例聯合移植來源于大極體組和正常極體組的兩個胚胎,2例(1例大極體組,1例大極體組+正常極體組)臨床妊娠并活產2個健康嬰兒。見表4。

表4 臨床結局比較Table 4 Comparison of the clinical outcomes[n(%)]

討 論

初級卵母細胞第一次減數分裂后形成次級卵母細胞和第一極體,第一極體的排出代表著卵母細胞細胞核的成熟。ICSI之前去除卵丘細胞可以更好地觀察第一極體是否存在及其形態,而促性腺激素刺激卵巢后獲得的卵母細胞可能經歷了不同的細胞質和核成熟時間,因此,第一極體的形態差異可能反映了卵母細胞的核成熟度及其與胞漿發育的同步性[3]。目前,第一極體形態是否可以預測卵母細胞的質量及對輔助生殖技術成功率的影響尚存在爭議,有研究表明,選擇第一極體形態良好的胚胎移植,受精率更高,胚胎質量更好,著床率和妊娠率更高[4-5],而另一些研究則報道了相互矛盾的結果[6-8]。本研究的目的是通過評估第一極體明顯增大的卵母細胞和受精、胚胎發育及妊娠結局之間的關系,觀察卵母細胞大極體是否是影響胚胎質量的預測因素,從而輔助移植胚胎選擇,以改善ICSI周期ART后的妊娠結局。

卵母細胞中普遍存在大極體現象,卵母細胞大極體發生率為0.5%～2%。Choi等[9]最早在小鼠中發現Mos/絲裂原活化蛋白激酶(mitogen activated protein kinase,MAPK)途徑可以調節第一極體的大小。卵母細胞胞質的不對稱分裂依賴于皮層紡錘體定位、皮層重組和卵母細胞極化后的紡錘體遷移[10]。敲除mos基因的小鼠生育力下降,成熟的MOS-/-卵母細胞在第一次減數分裂過程中不能激活MAPK,紡錘體形狀發生改變,紡錘體定位失敗不能遷移到皮層,導致卵裂面改變,產生異常大的第一極體。Huang等[11]研究發現肌動蛋白、細胞膜、微管相關WASP同源體(WASP homolog associated with actin, membranes and microtubules,WHAMM)是小鼠卵母細胞成熟外周紡錘體遷移和不對稱細胞質分裂所必需的。卵母細胞細胞質中微量注射特異性短干擾(si)RNA后WHAMM被耗盡,肌動蛋白帽的形成被中斷,紡錘體變大并停留在中部,紡錘體遷移失敗導致卵母細胞減數分裂出現對稱細胞質分裂,卵母細胞擠壓出較大的第一極體。

很多研究報道了人卵母細胞大極體與受精率、卵裂率、胚胎發育之間的關系。Ebner等[5]報道了66例患者70個ICSI周期的610枚MII卵母細胞第一極體形態對受精率和胚胎質量的影響,結果表明,大極體卵母細胞(18例)與其它組卵母細胞(完整平滑組,完整粗糙組,破碎組)相比,2PN受精率明顯下降(50.0%),D2胚胎質量(胚胎碎片<25%)明顯下降(22.2%),建議第一極體增大的卵母細胞不應該考慮移植。Fancsovits等[12]回顧性研究了522例患者的3387枚MII卵母細胞的第一極體形態與ICSI周期受精和胚胎發育的相關性,與其它組(完整平滑組,完整粗糙組,破碎組,未成熟組)相比,大極體卵母細胞組(62例)2PN受精率最低(50.0%),且大極體組D2多核胚胎數(26.7%)和胚胎碎片(20.5±12.1)顯著高于其它組,不應該選擇大極體卵母細胞發育的胚胎進行移植。Navarro等[13]回顧性分析了3177枚MII卵母細胞第一極體形態對ICSI結局的影響,大極體卵母細胞組(363例)的2PN受精率、D2卵裂率和胚胎質量(分別為20.7%、18.7%和5.0%)均明顯低于正常大小完整的極體組和極體破碎組,表明具有大極體的卵母細胞不應用于ICSI手術。李澎濤等[14]分析了63個ICSI周期的765枚MII卵母細胞第一極體的形態與卵母細胞的受精率、卵裂和發育潛能的關系,與極體完整組和極體破碎組相比,大極體卵母細胞組(49例)的正常受精率、卵裂率、優質胚胎率明顯下降(分別為67.4%、84.9%和3.3%),異常受精率明顯增高(14.3%),第一極體形態可以作為評價人類卵母細胞發育潛能的指標之一。

在本研究中,我們回顧性分析了ICSI周期卵母細胞大極體與受精率、胚胎發育的關系,與正常極體組相比,大極體組2PN正常受精率顯著降低;D3優胚率、囊胚形成率、可利用囊胚率、優質囊胚率均明顯降低,但僅囊胚形成率有統計學差異。考慮混雜因素后,大極體卵母細胞2PN正常受精率顯著降低(OR=0.63);D3優胚率(OR=0.54)和囊胚形成率(OR=0.42)均顯著減低。卵母細胞大極體是影響正常受精、D3胚胎質量和囊胚形成的危險因素,這與之前其它研究報道卵母細胞大極體影響受精及胚胎后期發育一致[5,12-14]。卵母細胞第一次減數分裂時紡錘體的異常導致同源染色體分離不均,第一極體中可能含有非整倍染色體,次級卵母細胞非整倍率增加[15]。在陳雯、賈嬋維等[16-17]的研究中大極體的卵母細胞非整倍體發生率明顯增高,與本研究大極體卵母細胞異常受精風險(≥3PN率調整后OR=3.99)明顯增高相一致。同時紡錘體定位遷移失敗使紡錘體位于卵母細胞中央,卵裂面擴大導致胞漿不對稱分裂被破壞,第一極體劃走一大部分胞漿形成大極體,次級卵母細胞中細胞器、細胞因子和蛋白質大量減少,最終影響卵母細胞受精及胚胎后期發育。鑒于以往研究未分析臨床結局,本研究進一步隨訪妊娠結局,新鮮周期移植大極體來源卵裂期胚胎共12例(大極體組4例,大極體組+正常極體組8例),1例臨床妊娠后流產,余均未妊娠;復蘇移植大極體來源的囊胚共6例(大極體組3例,大極體組+正常極體組3例),2例(大極體組1例,大極體組+正常極體組1例)臨床妊娠并活產2個健康嬰兒。因此,不建議移植大極體卵母細胞來源的卵裂期胚胎,若只有大極體來源的胚胎,建議將胚胎培養至囊胚后再移植,可能會改善其臨床結局。

綜上所述,在ICSI周期中,卵母細胞大極體會影響受精及胚胎后期發育,可以將卵母細胞出現大極體作為預測胚胎質量的因素,并將其作為選擇移植胚胎的一個參考指標,這樣有助于進一步改善ICSI周期移植的妊娠結局。